Summary
हम एक कस्टम निर्मित ट्रैक्टर का उपयोग कर विकसित एक माउस टिबियल व्याकुलता आस्टियोजेनेसिस मॉडल पेश करते हैं । एक विश्लेषण लक्ष्य के रूप में एक माउस का उपयोग अनुसंधान आगे बढ़ाने के लिए लाभप्रद है ।
Abstract
व्याकुलता आस्टियोजेनेसिस (DO) एक शल्य प्रक्रिया है कि कोशिका प्रत्यारोपण के बिना कंकाल ऊतक पुनर्जनन शामिल है । एक मॉडल निम्नलिखित तीन चरणों के होते हैं: osteotomy और बाहरी ट्रैक्टर के स्थान के बाद विलंबता चरण; व्याकुलता चरण है, जिसमें अलग हड्डी समाप्त होता है धीरे और लगातार विचलित; और समेकन चरण । इस कस्टम करने के लिए इस्तेमाल किया ट्रैक्टर दो अधूरा एक्रिलिक राल के छल्ले और एक विस्तार पेंच के शामिल है । इस प्रक्रिया को सिलिकॉन छाप सामग्री के साथ मोल्ड बनाकर और फिर कस्टम मेड के लिए बना हुआ ट्रैक्टर बनाकर शुरू किया गया । दंत राल सिलिकॉन छाप सामग्री से बना formwork में डाला गया था, और यह polymerize करने के लिए अधूरा राल कस्टम के लिए आवश्यक के छल्ले बनाने के लिए अनुमति दी गई थी । ये छल्ले पारदर्शी राल का उपयोग कर एक विस्तार पेंच के साथ तय किया गया । इस दृष्टिकोण के जरिए बनाया गया कस्टमर बना हुआ ट्रैक्टर चूहों के टिबिया से जुड़ा हुआ था. टिबिया 25 ग्राम सुई के एक जोड़ी समीपस्थ का उपयोग कर डिवाइस के लिए तय किया गया था, 27 जी सुइयों के एक जोड़ी लंबा, और एक्रिलिक राल. 5 दिनों के एक विलंबता अवधि के बाद, व्याकुलता ०.२ mm/12 एच की दर से शुरू किया गया था । लंबी 8 दिनों के लिए जारी किया गया था, ३.२ mm के कुल अंतर में जिसके परिणामस्वरूप । चूहों को त्याग कर 4 सप्ताह बाद व्याकुल हो गए । व्याकुलता अंतर में अस्थि गठन दोनों रेडियोग्राफी और प्रोटोकॉल का उपयोग कर की पुष्टि की थी ।
Introduction
व्याकुलता आस्टियोजेनेसिस (DO) कंकाल विकारों की एक किस्म के लिए एक स्थापित उपचार विधि है, इस तरह के अंग लंबाई विसंगतियों, अस्थि दोष, और अंग विकृति के रूप में1. इस अनूठी उपचार रणनीति "तनाव तनाव सिद्धांत" Ilizarov द्वारा प्रस्तावित पर आधारित है । विधि विलंबता के लिए कई दिनों के लिए, सक्रिय व्याकुलता के लिए कई हफ्तों की आवश्यकता है, और समेकन के लिए कई महीनों तक परिपक्व हड्डी2का गठन किया है ।
रक्त प्रवाह की रुकावट के कारण स्थानीय hypoxic स्थितियों3,4 और यांत्रिक उत्तेजना5,6 के उपचार की प्रक्रिया में विशेष रूप से महत्वपूर्ण हैं । हाइपोक्सिया-प्रेरित angiogenesis ऑक्सीजन, पोषक तत्वों, घुलनशील कारकों और कोशिकाओं को रक्त के प्रवाह के माध्यम से स्थानीय रूप से ऊतक की मरंमत के लिए आवश्यक वहन करती है । विस्तार आपरेशन द्वारा यांत्रिक उत्तेजना mesenchymal स्टेम कोशिकाओं के भेदभाव के रूप में जैविक प्रतिक्रियाओं का कारण बनता है, हड्डी गठन, पत्थराना और remodeling. सीरियल उपचार न केवल कठिन ऊतकों के गठन की अनुमति देता है, लेकिन यह भी कोमल ऊतकों, नसों सहित, मांसपेशियों, रक्त वाहिकाओं, और त्वचा के ऊतकों, स्टेम कोशिका प्रत्यारोपण के लिए की आवश्यकता के बिना. इसलिए, एक मॉडल विभिंन ऊतकों के उत्थान के विश्लेषण के लिए एक उत्कृष्ट मॉडल माना जाता है ।
खरगोश और कुत्तों के लिए बुनियादी अनुसंधान में सबसे व्यापक रूप से इस्तेमाल जानवरों कर रहे हैं; हालांकि, इन जानवरों के लिए कुछ विश्लेषण उपकरण उपलब्ध हैं । एक माउस का उपयोग मॉडल एक अधिक विस्तृत विश्लेषण की सुविधा है । यह पीटकर चूहों का उपयोग प्रयोगों के लिए विशेष रूप से उपयुक्त है । हालांकि, जब एक प्रयोगात्मक पशु के रूप में एक माउस का उपयोग कर, एक एक्सटेंशन डिवाइस बनाया जाना चाहिए । यहां, हम एक माउस टिबियल एक कस्टम बनाया-एक दंत प्रयोगशाला उपकरण और तकनीक है, जो एक पिछले अध्ययन में इस्तेमाल किया गया है का उपयोग कर बनाया गया है ।
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Protocol
सभी प्रयोगों हमारे संस्थान के पशु देखभाल और उपयोग समिति द्वारा अनुमोदित प्रोटोकॉल के अनुसार किए गए थे । प्रक्रिया से पहले सभी उपकरणों निष्फल ।
1. कस्टम मेड के लिए एक मोल्ड बनाने की तैयारी
- एक इवांस मोम carver का उपयोग कर दो अधूरा छल्ले (बाहरी व्यास, 20 मिमी, भीतरी व्यास, 10 मिमी), जो ट्रैक्टर का एक हिस्सा तेल मोम की एक चादर (१४५ mm x ७४ mm) के साथ कर रहे हैं बनाओ ।
- एक ही टुकड़े के 4 बनाओ । एक मोम रंग एक गैस बर्नर के साथ गरम का प्रयोग करें । 5 मिमी की मोटाई के लिए चार अंगूठियां स्टैक करें । विस्तार पेंच और सुई, 8 मिमी x 2 मिमी और 5 मिमी एक्स 2 मिमी के लिए स्थान प्रदान क्रमशः इवांस वैक्स carver (आंकड़े 1a, 1b) के साथ ।
- सिलिकॉन छाप सामग्री में एंबेड मोम पैटर्न और राल के छल्ले (चित्रा 1सी) के लिए एक सांचे में ढालना बनाएं ।
- सिलिकॉन छाप सामग्री (कमरे के तापमान पर लगभग 5 मिनट) के इलाज के बाद, मोम पैटर्न निकालें ।
2. कस्टम मेड के उत्पादन के लिए ट्रैक्टर
- पेट्रोलियम जेली पतले और समान रूप से सिलिकॉन मोल्ड करने के लिए लागू करें । बहुलकीकरण दंत राल के 3 जी मिश्रण और तुरंत यह सिलिकॉन मोल्ड में डाल दिया । कमरे के तापमान (आरटी) में 5 मिनट के लिए सेट करें ।
- मोल्ड से बहुलक राल अंगूठी निकालें और एक कार्बाइड बार और एक दंत micromotor गड़गड़ाहट को दूर करने के लिए (के बारे में 1 मिनट) के साथ पॉलिश । दो राल के छल्ले प्रत्येक कस्टम-बनाया ट्रैक्टर के लिए आवश्यक हैं ।
- प्रक्रिया को दोहराएँ राल के छल्ले की आवश्यक संख्या बनाने के लिए (चित्रा 1डी).
- के बारे में 2 मिमी के एक अंतर छोड़ उपयोगिता मोम के साथ राल के छल्ले को ठीक करने और पारदर्शी राल के साथ पूरी तरह से विस्तार पेंच के बाहर सुरक्षित । आरटी पर 5 मिनट के लिए राल सेट करें । जब बहुलकीकरण पूरा हो गया है, विस्तार पेंच घुंडी (चित्रा 1ई) को हटा दें ।
3. सर्जिकल प्रोटोकॉल
- 8 सप्ताह पुराने पुरुष चूहों का प्रयोग करें ।
- medetomidine हाइडरोक्लॉराइड के एक intraperitoneal इंजेक्शन के साथ संज्ञाहरण प्रेरित ०.३ मिलीग्राम/जी, मिदाजोलम पर 4 मिलीग्राम/kg, और butorphanol tartrate पर 5 मिलीग्राम/
- ध्यान से दाढ़ी और 10% आयोडीन समाधान के साथ सर्जिकल क्षेत्र को संक्रमित, और फिर, सही निचले अंग पर ०.५% lidocaine हाइडरोक्लॉराइड प्रशासन ।
- एक अनुदैर्ध्य त्वचा चीरा (लंबाई में लगभग 15 मिमी) एक No .15 स्केलपेल के साथ सही निचले पैर पर बनाओ । कुंद अंतर्निहित मांसपेशियों को अलग, देखभाल करने के लिए periosteum के सभी को दूर नहीं ले । बाहर से दृष्टिकोण आसानी से बहिर्जंघिका तक पहुंचने के लिए । बहिर्जंघिका को कैंची से काट लें ।
- संकीर्ण पतली बाँझ संदंश के साथ टखने समझ, और एक बाँझ 27 जी सुई का उपयोग करने के लिए एड़ी से 5 मिमी के बारे में हड्डी में एक छेद बनाने के लिए. सुई त्वचा, हड्डी घुसना चाहिए, और उस क्रम में त्वचा । सुई में प्रवेश करते ही एक निप्र के साथ नोक और जड़ कट जाती है जिससे सुई करीब 15 एमएम हो जाती है ।
- एक ही तरीके से, के बारे में 2-3 मिमी समीपस्थ एक और छेद बनाओ । टखने के चारों ओर पकड़ो और एक ही तरीके से घुटने के नीचे २ २५ ग्राम सुई पास । सुई घुसना के बाद, एक निप्र (चित्रा 1एफ) के साथ सुझावों और जड़ों में कटौती ।
- कस्टम-मेड ट्रैक्टर को ऐसे रखें कि यह एक्सटेंशन दिशा के समानांतर हो । डिवाइस के खांचे को भरने के लिए पर्याप्त बहुलकीकरण दंत राल के साथ सुइयों और डिवाइस को ठीक करें । बहुलकीकरण को पूरा करने के लिए प्रतीक्षा करें (लगभग 5 मिनट) (चित्रा 1जी) ।
- आसपास के ऊतकों को नुकसान न हो इसके लिए सावधान रहें । एक बहुत पतली काटने डिस्क का उपयोग करते हुए टिबिया के diaphysis के बीच में कटौती जबकि एक खारा समाधान (1-2 एमएल) लागू ।
- एक 4-0 नायलॉन सीवन के साथ घाव बंद करें ।
- ऑपरेशन के तुरंत बाद analgesia के लिए buprenorphine के चमड़े के नीचे इंजेक्शन (०.१ मिलीग्राम/ buprenorphine के माध्यम से हर 12 घंटे जारी रखें 7 और इसके बाद की जरूरत के रूप में ।
4. व्याकुलता प्रोटोकॉल
नोट: लेटेंसी अवधि और व्याकुलता दर पर विभिन्न रिपोर्टें हैं, लेकिन यहाँ, प्रतिनिधि प्रोटोकॉल दिखाए जाते हैं.
- 5 दिनों के एक विलंबता अवधि के बाद, ०.२ mm/12 एच की दर से व्याकुलता शुरू करते हैं । विस्तार के लिए, तेजी से विस्तार पेंच से जुड़ी पिन का उपयोग करें । विस्तार पेंच (चित्रा 1ई) से जुड़ी पीले तीर की दिशा में पिन ले जाएं ।
- संज्ञाहरण विस्तार के दौरान आवश्यक नहीं है । छोटी उंगली और हथेली के साथ पूंछ पकड़ो, और तर्जनी और अंगूठे के साथ विस्तार डिवाइस को ठीक करें ।
- विस्तार (1/4 बारी के लिए ०.२ मिमी) करते हैं । 8 दिनों के लिए लंबी जारी है, जो ३.२ mm के कुल अंतर में परिणाम होगा ।
5. विश्लेषण
- रेडियोग्राफी विश्लेषण: विस्तार के पूरा होने के बाद, २.०% isoflurane का उपयोग करके सामान्य संज्ञाहरण के तहत गणना टोमोग्राफी के साथ अस्थि पुनर्जनन मूल्यांकन ।
नोट: यदि ध्यान एक्सटेंशन डिवाइस की स्थिति के संबंध में लिया गया है, यह भी संलग्न डिवाइस के साथ सरल रेडियोग्राफी के साथ इसका मूल्यांकन करने के लिए संभव है. - ऊतकवैज्ञानिक विश्लेषण: उपकरण सावधानी से निकालें ताकि नमूने के दौरान एक फ्रैक्चर व्याकुलता साइट का कारण नहीं है । कमरे के तापमान पर 24 घंटे के लिए 10% तटस्थ बफर formalin में नमूना ठीक करें । मोर्स समाधान के साथ Decalcify (10% सोडियम साइट्रेट, 20% फार्मिक एसिड) 4 डिग्री सेल्सियस पर रातोंरात ।
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Representative Results
आंकड़े 1a और 1b वर्तमान अपूर्ण छल्ले (बाहरी व्यास, 20 मिमी; भीतरी व्यास, 10 मिमी; मोटाई, तेल मोम के साथ 5 मिमी) । दो मोम पैटर्न सिलिकॉन छाप सामग्री में एंबेडेड थे, और राल के छल्ले के लिए एक सांचे में ढालना (चित्रा 1सी) का गठन किया गया था । बहुलक राल तुरंत इस सांचे में डाल दिया गया था, और राल के छल्ले प्राप्त किया गया (चित्रा 1डी) । एक कस्टम-बनाया ट्रैक्टर दो राल के छल्ले और एक विस्तार पेंच (चित्रा 1ई) के संयोजन के द्वारा बनाई गई थी । चित्रा 2 एक मॉडल में व्याकुलता के बाद 4 सप्ताह में ठेठ रेडियोग्राफी निष्कर्षों प्रस्तुत करता है । नव गठित हड्डी व्याकुल स्थल पर मनाया गया । चित्रा 2बी hematoxylin और eosin धुंधला परिणाम प्रस्तुत करता है । एक नव गठित हड्डी पुल मनाया गया था, और नए गठन हड्डी आसानी से देशी हड्डी से प्रतिष्ठित किया जा सकता है । इस प्रयोग में प्रयुक्त होने वाले 5 चूहों में कोई intraoperative फ्रैक्चर या पश्चात का संक्रमण नहीं था.
चित्रा 1 : रिवाज़ बना हुआ है. (A, B) रिंग के अनुमानित आयाम इस प्रकार हैं: बाहरी व्यास, 20 मिमी; भीतरी व्यास, 10 मिमी; मोटाई, 5 मिमी । विस्तार पेंच (सफेद arrowhead) और सुई (ब्लैक arrowhead) के लिए रिक्त स्थान सुरक्षित हैं । (ग) सिलिकॉन छाप सामग्री में मोम पैटर्न एंबेडेड । (घ) राल के छल्ले पूर्ण । (ङ) दो राल के छल्ले और विस्तार पेंच राल के साथ सुरक्षित हैं । (च) टिबिया के समीपस्थ और बाहर के metaphysis में चार सुई सम्मिलित हैं. (छ) माउस के अंग में रखा व्याकुल यन्त्र । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।
चित्रा 2 : रेडियोलॉजिकल और ऊतकवैज्ञानिक निष्कर्षों । (क) Radiologically, नव गठित हड्डी व्याकुलता के बाद 4 सप्ताह मनाया जाता है । (ख) Histologically, अंतर नव गठित हड्डी (स्केल बार = ५०० µm) से भरा है । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।
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Discussion
जब एक बड़े जानवर एक प्रयोगात्मक मॉडल के रूप में इस्तेमाल किया जाता है, एक तैयार विस्तार डिवाइस का इस्तेमाल किया जा सकता है, और यह अच्छा निर्धारण प्राप्त करने और विस्तार आपरेशन खुद और विस्तार राशि का आकलन करने के लिए आसान है । हालांकि, जब एक माउस एक प्रयोगात्मक मॉडल के रूप में प्रयोग किया जाता है, यह कुछ या उपकरणों के सभी विकसित करने के लिए आवश्यक है । Isefuku एट अल. और Tay एट अल. डिवाइस बनाया और एक माउस मॉडल7,8बनाया । Carvahjo एट अल. एक संयुक्ताक्षर तार9के साथ एक तैयार विस्तार डिवाइस (ट्रैक ट्रैक्टर: ळ् मार्टिन) के निर्धारण को शामिल किया गया एक विधि को अपनाया । हम भी एक माउस को विस्तार उपकरणों के लिए मौजूदा उत्पादों का उपयोग कर मॉडल बना सकते है और एक निर्धारण विधि तैयार । इस दृष्टिकोण यह आसान विस्तार डिवाइस का निर्माण करने के लिए, विस्तार प्रदर्शन, और विस्तार राशि का आकलन करना होगा । इसके अलावा, यह उम्मीद है कि एक ही डिवाइस का उपयोग कर एक टिबियल फॉल्ट दोष मॉडल बनाया जा सकता है. इसके अतिरिक्त, दोष की लंबाई ०.२ मिमी के चरणों में समायोजित किया जा सकता है, और इस प्रकार, डिवाइस बहुमुखी माना जाता है ।
ऐसे प्रयोग में टिबिया के माध्यम से सुई को धागे से बांधना तकनीकी रूप से कठिन हो जाता है । विशेष रूप से, टिबिया के बाहर भाग का व्यास छोटा है, और कुछ प्रशिक्षण दो सुई पारित करने के लिए आवश्यक है । यदि पर्याप्त हड्डी नोट नहीं है, यह जांच करने के लिए आवश्यक है कि अच्छा निर्धारण प्राप्त किया है । आदेश में अच्छा निर्धारण प्राप्त करने के लिए, यह एक कोण पर और सुई7,8के बीच के रूप में संभव के रूप में व्यापक अंतराल के साथ सुइयों पारित करने के लिए बेहतर हो सकता है । इसके अतिरिक्त, चिकित्सा की दर और उपचार के दौरान प्रोटोकॉल osteotomy की विधि के अनुसार बदल जाएगा के रूप में, यह एक निश्चित तरीके से प्रक्रिया को पूरा करने के लिए आवश्यक है ।
प्रयोगात्मक पशु का आकार इस प्रयोग के एक सीमित कारक के रूप में माना जा सकता है । वहां कोई समस्या नहीं है जब माउस बड़ा है; हालांकि, अगर यह बहुत छोटा है, सर्जरी ही संभव नहीं हो सकता है । पहले, हम 4 सप्ताह पुराने चूहों का इस्तेमाल किया और किसी भी समस्याओं के बिना प्रयोगों प्रदर्शन करने में सक्षम थे10. मूल्यांकन अवधि के संबंध में, हड्डी काटने के बाद ४२ दिनों तक एक्सटेंशन डिवाइस समस्याओं के बिना स्थापित किया जा सकता है । हालांकि, के रूप में आगे टिप्पणियों नहीं किए गए, अतिरिक्त अनुसंधान भविष्य में आवश्यक है । जटिलताओं की घटना एक समस्या है जब प्रयोगों को आगे बढ़ा सकते हैं । सर्जरी के दौरान फ्रैक्चर 30 चूहों में से लगभग 1 में हो सकता है । इसी तरह, पश्चात घाव संक्रमण 30 चूहों में से लगभग 1 में हो सकता है ।
अंत में, हम एक माउस प्रस्तुत टिबियल मॉडल एक कस्टम का उपयोग कर बनाया गया है ।
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Disclosures
लेखकों का खुलासा करने के लिए कुछ नहीं है ।
Acknowledgments
लेखक सुश्री Makiko काटो प्रोत्साहन प्रदान करने के लिए इस अध्ययन को पूरा करने के लिए धंयवाद । हम भी प्रयोगात्मक पशु और चिकित्सा अनुसंधान इंजीनियरिंग, नागोया विश्वविद्यालय के ग्रेजुएट स्कूल ऑफ मेडिसिन, चूहों के आवास के लिए के विभाजन का धन्यवाद.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Paraffin wax | YAMAHACHI DENTAL MFG. CO. | - | For preparation a mold for resin rings |
| Labocone putty | GC Corporation | - | For preparation a mold for resin rings |
| Utility wax | GC Corporation | - | For preparation a mold for resin rings |
| Expansion screw | Ortho Dentaurum | 600-301-30 | Component of custom-made distractor |
| Unifast III | GC Corporation | - | Immediate polymerization resin Component of custom-made distractor |
| Ortho Crystal | NISSIN | - | Transparent resin Component of custom-made distractor |
| 25 G needle | TERUMO | NN-2516R | For custom-made distractor |
| 27 G needle | TERUMO | NN-2719S | For custom-made distractor |
| ICR mouse | Chubu Kagaku Shizai Corporation | - | Experimental animal |
| Somnopentyl | Kyoritsu Seiyaku | - | Pentobarbital sodium salt |
| Isoflurane | FUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation | 099-06571 | Isoflurane inhalation solution |
References
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