Summary
Мы представляем модель Остеогенез большеберцовых отвлечение мыши, разработанные с помощью заказной дистрактора. Использование мыши в качестве целевого объекта анализа является выгодным для продвижения научных исследований.
Abstract
Отвлечение Остеогенез (ДУ) является хирургическая процедура, которая предполагает регенерации костной ткани без трансплантации клеток. СДЕЛАТЬ модель состоит из следующих трех этапов: этапа задержка после остеотомии и размещение внешних дистрактор; отвлечение фаза, которой заканчивается разлученных кости постепенно и непрерывно отвлекается; и на этапе консолидации. Этот заказ дистрактора для ду состоит из двух колец неполной акриловой смолы и расширение винт. Этот процесс был инициирован плесени силиконовые впечатление материалом и затем создание заказных дистрактора. Стоматологической смолы сливали в опалубке из силиконового материала впечатление, и было разрешено полимеризоваться для создания неполной смолы кольца, необходимых для заказных дистрактора. Эти кольца были исправлены с винтом расширения, с помощью прозрачной смолой. По индивидуальному заказу дистрактор, созданные с помощью такой подход был прикреплен к голени мышей. Голени было зафиксировано к аппарату, используя одну пару 25 G иглы проксимально, одна пара 27 G иглы дистально и акриловой смолы. После периода задержка 5 дней отвлечение было начато со скоростью 0,2 мм/12 ч. Удлинение было продолжено на 8 дней, что приводит к общей разрыв 3,2 мм. Мышей были принесены в жертву через 4 недели после безумия. Формирования костей в дистракционного разрыв был подтвержден с помощью радиографии и гистологии.
Introduction
Отвлечение Остеогенез (ДУ) является методом установленного лечения для целого ряда скелетных расстройств, таких как несоответствия длины конечностей, костных дефектов и деформаций конечностей1. Эта уникальная процедура стратегия основана на «принцип напряженности стресс», предложенный Илизарова. Этот метод требует несколько дней задержка, несколько недель для активного отвлечение и несколько месяцев для консолидации до зрелых кости сформированные2.
Местные гипоксические условия из-за блокирования крови поток3,4 и5,механической стимуляции6 особенно важное значение в процессе заживления ДУ. Гипоксия индуцированной ангиогенеза носит кислорода, питательных веществ, растворимых факторов и клеток, необходимых для восстановления тканей локально через поток крови. Механическая стимуляция расширение операции вызывает биологические реакции, такие как дифференциация мезенхимальных стволовых клеток, формирования костей, кальцификации и реконструкции. Серийный делать лечение позволяет формирования не только твердых тканей, но и мягких тканей, в том числе нервов, мышц, кровеносных сосудов и тканей кожи, без необходимости в трансплантации стволовых клеток. Таким образом сделать модель считается прекрасной моделью для анализа регенерацию различных тканей.
Кролики и собаки являются наиболее широко используемых животных в фундаментальных исследований для ду; Однако существует несколько инструментов анализа, доступные для этих животных. Использование мыши сделать модель способствует более подробный анализ. Это особенно хорошо подходит для экспериментов с использованием маскирования мышей. Однако при использовании мыши как экспериментальное животное, устройство расширения должны создаваться. Здесь мы представляем модели мыши большеберцовых разработан с использованием заказных дистрактор, созданных с помощью инструмента зуботехнической лаборатории и техники, которая использовалась в предыдущем исследовании.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Все эксперименты проводились в соответствии с протоколами, утвержденных животных уход и использование Комитета нашего учреждения. Простерилизуйте все инструменты перед процедурой.
1. Подготовка пресс-формы для создания заказных дистрактор
- Сделайте два неполных кольца (наружный диаметр, 20 мм, внутренний диаметр 10 мм), которые являются частью дистрактор, с одного листа парафина (145 мм x 74 мм) с помощью воска Карвер Эванс.
- Сделайте 4 те же произведения. Лопаточкой Воск нагревают с газовой горелкой. Стек четыре кольца толщиной 5 мм из. предоставляют пространство для расширения винт и иглы, 8 мм х 2 мм и 5 мм х 2 мм соответственно с воском Карвер Эванс (цифры 1A, 1B).
- Внедрить восковых моделей в впечатление материал силикона и создания плесени для смолы кольца (рис. 1C).
- После отверждения силикона впечатление материал (примерно 5 минут при комнатной температуре), удалите восковых моделей.
2. Производство заказных дистрактор
- Применить вазелином тонко и равномерно в силиконовые формы. Смешать 3 g полимеризации стоматологической смолы и сразу налить его в силиконовые формы. Набор для 5 мин при комнатной температуре (RT).
- Удаление полимеризованная смола кольца от плесени и отполировать с твердосплавными бар и стоматологических микромотор для удаления заусенцев (около 1 мин). Для каждый заказ дистрактор требуются два кольца смолы.
- Повторите эту процедуру для создания требуемое количество смолы кольца (рис. 1D).
- Оставьте зазор около 2 мм, чтобы исправить смолы кольца с утилита воском и обеспечения внешней экспансии винт полностью прозрачной смолой. Установите смолы для 5 мин на RT. После завершения полимеризации удалите расширение винт регулятора (рис. 1E).
3. хирургический протокол
- Используйте 8 мужчин week-old мышей.
- Побудить анестезии с внутрибрюшинной инъекции medetomidine гидрохлорида 0,3 мг/г, мидазолама по 4 мг/кг, а Буторфанол тартрата 5 мг/кг массы тела.
- С осторожностью бриться и дезинфекция хирургические области с раствор 10% йода и затем управлять лидокаина гидрохлорида 0,5% на правой нижней конечности.
- Сделайте продольные Кожный разрез (примерно 15 мм в длину) в правой голени с помощью скальпеля № 15. Тупо отдельные основные мышцы, стараясь не удалить все надкостницы. Подход от снаружи легко добраться до малоберцовой кости. Вырежьте малоберцовой кости с ножницами.
- Захватите щиколотки с узкие тонкие стерильные щипцами и использовать стерильные иглы 27 G, чтобы сделать отверстие в кости около 5 мм от пятки. Игла должна проникнуть, кожи, костей и кожи в этом порядке. Когда игла проникает, вырежьте кончик и корень с щипцы так, чтобы игла находится около 15 мм.
- Сделайте еще один отверстие таким же образом, около 2-3 мм проксимальный. Держите вокруг лодыжки и пройти две иглы 25 G под колено таким же образом. После того, как иглы прорезывают, вырежьте советы и корни с щипцы (рис. 1F).
- Место на заказ дистрактор, таким образом, что это параллельно направлению расширение. Исправить иглы и устройства с стоматологической смолы достаточно полимеризации для заполнения пазов устройства. Ждать для полимеризации для завершения (примерно 5 минут) (рис. 1G).
- Будьте осторожны, чтобы не повредить окружающие ткани. Вырежьте в середине диафиза большеберцовой кости с помощью очень тонкой отрезного диска при применении физиологический раствор (1 – 2 мл).
- Закройте рану с швом нейлона 4-0.
- Дать подкожной инъекции бупренорфин (0,1 мг/кг) для обезболивания сразу же после операции. Продолжать бупренорфин каждые 12 ч, через сутки 7 и необходимости в дальнейшем.
4. отвлечение протокол
Примечание: Есть различные сообщения на уровень задержки период и отвлечение внимания, но здесь, представитель протоколы отображаются.
- После периода задержка 5 дней запустите отвлечение со скоростью 0,2 мм/12 ч. Для расширения используйте ПИН, придает винт быстрого расширения. Переместите закрепление в направлении желтая стрелка, придает расширение винт (рис. 1E).
- Анестезия не является необходимым во время расширения. Держите хвост с мизинец и пальмы и исправить расширения устройство с указательный палец и большой палец.
- Выполните расширение (0,2 мм для 1/4 оборота). Далее, удлинение на 8 дней, что приведет к полной разрыв 3,2 мм.
5. анализ
- Рентгенография анализ: после завершения расширения, оценки костной регенерации с томографии под общим наркозом с помощью изофлюрановая 2,0%.
Примечание: Если внимание было принято в отношении положения устройства расширения, это возможность оценить его с простой рентгенография даже с устройством прилагается. - Гистологический анализ: Осторожно снимите аппарат чтобы не вызвать перелом дистракционного сайта во время выборки. Исправьте образца в нейтральных буферизации формалина 10% за 24 ч при комнатной температуре. Известь с решением Морзе (цитрат натрия 10%, 20% муравьиной кислоты) на ночь при 4 ° C.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Цифры 1A и 1B представляют неполные кольца (наружный диаметр, мм 20 внутренний диаметр, мм 10; толщина 5 мм) с парафина. Две модели воска были внедрены в материал силикона впечатление, и была создана форма для смолы кольца (рис. 1C). Полимеризованная смола сразу же налил в эту плесень, и смола кольца были получены (рис. 1D). По индивидуальному заказу дистрактор был создан путем объединения двух колец смолы и расширение винт (рис. 1E). Рисунок 2 A представляет типичный рентгенография выводы на 4 недели после отвлечение в модели. Новообразованной костной было отмечено на сайте отвлечение. Рисунок 2B представляет гематоксилином и эозином, пятнать результаты. Было отмечено, мост вновь образованной кости, и вновь образованной кости можно было легко отличить от родной кости. Существовал не интраоперационной перелом или послеоперационной инфекции в 5 мышей, используемые в этом эксперименте.
Рисунок 1 : Заказ дистрактора. (A, B) Приблизительные размеры кольца являются следующие: наружный диаметр, мм 20; внутренний диаметр 10 мм; толщина 5 мм. Защищены пространства для расширения винт (белая стрелка) и иглы (черная стрелка). (C) воск шаблону встроенных в материал силикона впечатление. (D) завершено смолы кольца. (E) два кольца смолы и расширения винт защищены смолой. (F) четыре иглы вставляются в проксимальном и дистальном метафиз голени. (G) отвлечение устройства помещены в мыши конечностей. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 2 : Радиологическое и гистологические результаты. (A) радиоактивно, вновь образованной кости наблюдается через 4 недели после безумия. (B) гистологически, разрыв заполняется с новообразование кости (шкала бар = 500 мкм). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Когда большое животное используется как экспериментальная модель, готовые расширение устройство может быть использовано, и это легко для получения хорошей фиксации и оценить сама операция расширения и расширения объема. Однако когда мышь используется в качестве экспериментальной модели, необходимо разработать некоторые или все оборудование. Isefuku et al. и Tay et al. устройство и создал мыши модель7,8. Carvahjo et al. приняла метод с участием фиксации устройства, готовые расширения (трек дистрактор: KLS Мартин) с вязью провода9. Мы могли бы также создать модель ду мыши с использованием существующих продуктов для устройств расширения и разработки метода фиксации. Этот подход позволит легко производить расширение устройства, выполнять расширение и оценить сумму расширение. Кроме того предполагается, что модель большеберцовых сегментарный дефекта могут быть созданы с помощью того же устройства. Кроме того длина дефекта может быть скорректирована с шагом 0,2 мм, и таким образом, устройство считается универсальным.
В такой эксперимент технически трудно резьбы иглы через большеберцовой кости. В частности мал диаметр дистальной части голени, и определенную подготовку должны пройти две иглы. Если достаточных кость не отмечалось, необходимо проверить ли получается хорошая фиксация. Для получения хорошей фиксации, было бы лучше передать иглы под углом и с максимально широким разрывом между иглами7,8. Кроме того как скорость заживления и гистология во время лечения изменится согласно методу остеотомии, это необходимо для выполнения процедуры в определенным образом.
Размер экспериментальных животных может считаться сдерживающим фактором этого эксперимента. Существует никаких проблем, когда мышь находится большой; Однако если он слишком мал, сама операция не может быть возможным. Ранее мы использовали 4-week-old мышей и были в состоянии выполнять эксперименты без каких-либо проблем10. Что касается периода оценки устройства расширения могут быть установлены без проблем до 42 дней после резки кости. Однако как далее замечания не были сделаны, дополнительные исследования необходимо в будущем. Возникновения осложнений может быть проблемой при продвижении экспериментов. В примерно 1 из 30 мышей может произойти перелом во время операции. Аналогичным образом послеоперационной раневой инфекции может произойти в примерно 1 из 30 мышей.
В заключение мы представили большеберцовых ду модель мыши, разработанных с помощью заказной дистрактора.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторы не имеют ничего сообщать.
Acknowledgments
Авторы благодарят г-жа Макико Като за предоставление поддержки для завершения этого исследования. Мы также благодарим Отдел экспериментальных животных и медицинских исследований инженерных, Нагоя выпускник школы медицины университета, для жилищного строительства мышей.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Paraffin wax | YAMAHACHI DENTAL MFG. CO. | - | For preparation a mold for resin rings |
| Labocone putty | GC Corporation | - | For preparation a mold for resin rings |
| Utility wax | GC Corporation | - | For preparation a mold for resin rings |
| Expansion screw | Ortho Dentaurum | 600-301-30 | Component of custom-made distractor |
| Unifast III | GC Corporation | - | Immediate polymerization resin Component of custom-made distractor |
| Ortho Crystal | NISSIN | - | Transparent resin Component of custom-made distractor |
| 25 G needle | TERUMO | NN-2516R | For custom-made distractor |
| 27 G needle | TERUMO | NN-2719S | For custom-made distractor |
| ICR mouse | Chubu Kagaku Shizai Corporation | - | Experimental animal |
| Somnopentyl | Kyoritsu Seiyaku | - | Pentobarbital sodium salt |
| Isoflurane | FUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation | 099-06571 | Isoflurane inhalation solution |
References
- Watson, J. T. Distraction osteogenesis. The Journal of the American Academy of Orthopaedic Surgeons. 14, 168-174 (2006).
- Ilizarov, G. A. The tension-stress effect on the genesis and growth of tissues: Part II. The influence of the rate and frequency of distraction. Clinical Orthopaedics and Related Research. 239, 263-285 (1989).
- Wan, C., et al. Activation of the hypoxia-inducible factor-1 alpha pathway accelerates bone regeneration. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (2), 686-691 (2008).
- Fujio, M., et al. Stromal cell-derived factor-1 enhances distraction osteogenesis-mediated skeletal tissue regeneration through the recruitment of endothelial precursors. Bone. 49 (4), 693-700 (2011).
- Tong, L., et al. Focal adhesion kinase expression during mandibular distraction osteogenesis: evidence for mechanotransduction. Plastic and reconstructive surgery. 111 (1), 211-222 (2003).
- Rhee, S. T., El-Bassiony, L., Buchman, S. R. Extracellular signal- related kinase and bone morphogenetic protein expression during distraction osteogenesis of the mandible: in vivo evidence of mechanotransduction mechanism for differentiation and osteogenesis by mesenchymal precursor cells. Plastic and reconstructive surgery. 117 (7), 2243-2249 (2006).
- Isefuku, S., Joyner, C. J., Simpson, A. H. A murine model of distraction osteogenesis. Bone. 27 (5), 661-665 (2000).
- Tay, B. K., Le, A. X., Gould, S. E., Helms, J. A. Histochemical and molecular analyses of distraction osteogenesis in a mouse model. Journal of Orthopaedic Research. 16 (5), 636-642 (1998).
- Carvalho, R. S., et al. The role of angiogenesis in a murine tibial model of distraction osteogenesis. Bone. 34 (5), 849-861 (2004).
- Osawa, Y., et al. Activated FGFR3 promotes bone formation via accelerating endochondral ossification in mouse model of distraction osteogenesis. Bone. 105, 42-49 (2017).
