Summary
Vi præsenterer en mus tibial distraktion osteogenesis model udviklet ved hjælp af en skræddersyet distractor. Brug af en mus som en analyse mål er fordelagtigt for at fremme forskningen.
Abstract
Distraktion osteogenesis () er en kirurgisk procedure, der indebærer bevægeapparatet vævsregeneration uden celle transplantation. En model består af følgende tre faser: latenstid fasen efter osteotomi og placering af den eksterne distractor; distraktion fase, hvori de adskilte knogleenderne er gradvist og kontinuerligt distraheret; og konsolideringsfasen. Denne skræddersyede distractor bruges til består af to ufuldstændige akryl harpiks ringe og en ekspansion skrue. Processen blev indledt ved at gøre en støbeform med silikone indtryk materiale og derefter oprette den skræddersyede distractor. Dental harpiks blev hældt til forskalling af silikone indtryk materiale, og det blev tilladt at polymerisere for at oprette ufuldstændige harpiks ringene kræves for de skræddersyede distractor. Disse ringe blev fastsat med en ekspansion skrue ved hjælp af gennemsigtige harpiks. Den skræddersyede distractor skabt via denne tilgang blev knyttet til skinneben af mus. Tibia blev fastsat til enheden med et par af 25 G nåle proksimalt, et par af 27 G nåle distalt, og akryl harpiks. Efter en latenstid på 5 dage, blev distraktion indledt med en hastighed af 0,2 mm/12 h. Forlængelsesstykket fortsattes for 8 dage, hvilket resulterer i et samlet hul på 3,2 mm. Musene blev ofret 4 uger efter distraktion. Knogledannelse i distraktion kløften blev bekræftet ved hjælp af både røntgen og histologi.
Introduction
Distraktion osteogenesis () er en etableret behandlingsform for en række knoglelidelser, som lemmer længde uoverensstemmelser, knogledefekter og lemmer deformiteter1. Denne unikke behandlingsstrategi er baseret på "spænding-stress princippet" foreslået af Ilizarov. Metoden kræver flere dage for ventetid, flere uger for aktive distraktion og flere måneder for konsolidering, indtil modne knoglen er dannet2.
De lokale hypoksiske betingelser på grund af blokering af blod flow3,4 og mekaniske stimulation5,6 er særlig vigtig i den helbredende proces af. Hypoxi-induceret angiogenese transporterer ilt, næringsstoffer, opløselige faktorer og celler nødvendige for væv reparation lokalt gennem blodgennemstrømningen. Mekanisk stimulation af udvidelse operation forårsager biologiske reaktioner såsom differentiering af mesenkymale stamceller, knogledannelse, forkalkning og remodellering. Seriel behandling tillader dannelsen af ikke alene hårde væv, men også bløde væv, herunder nerver, muskler, blodkar og hud væv, uden behov for stamcelletransplantation. Derfor er en model anses for at være en fremragende model til at analysere regenerering af forskellige væv.
Kaniner og hunde er de mest udbredte dyr i grundlæggende forskning i; men der er par analyseværktøjer tilgængelige for disse dyr. Brug af en mus gør model letter en mere detaljeret analyse. Det er især velegnet til eksperimenter ved hjælp af knockout mus. Når du bruger en mus som en eksperimentel dyr, bør der imidlertid oprettes en udvidelse enhed. Her udviklet præsenterer vi en mus tibial model ved hjælp af en skræddersyet distractor oprettet ved hjælp af en dental laboratorium værktøj og teknik, som har været brugt i en tidligere undersøgelse.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle eksperimenter blev udført i overensstemmelse med protokoller godkendt af Animal Care og brug Udvalget af vores institution. Sterilisere alle instrumenter før proceduren.
1. forberedelse af en støbeform til at skabe den skræddersyede Distractor
- Gøre to ufuldstændige ringe (ydre diameter, 20 mm, indvendig diameter, 10 mm), som er en del af distractor, med ét ark af paraffin (145 mm x 74 mm) ved hjælp af en Evans voks carver.
- Gøre 4 af de samme stykker. Bruge en voks spatel opvarmet med en gasbrænder. Stable de fire ringe til en tykkelse på 5 mm. giver plads til ekspansion skrue og nål, 8 mm x 2 mm og 5 mm x 2 mm henholdsvis med Evans voks carver (tal 1A, 1B).
- Integrere voks mønstre i silikone indtryk materiale og skabe en form for harpiks ringe (figur 1C).
- Efter hærdning silikone indtryk materiale (ca. 5 min. ved stuetemperatur), fjerne voks mønstre.
2. fremstilling af den skræddersyede Distractor
- Anvende Vaselin tyndt og jævnt på silikone formen. Mix 3 g polymerisering dental harpiks og straks hældes det i formen silikone. Sæt i 5 min. ved stuetemperatur (RT).
- Fjerne polymeriseret resin ring fra formen og polere det med en hårdmetal bar og en dental mikromotorer fjerne burr (ca. 1 min). To harpiks ringene er påkrævet for hver custom-made distractor.
- Gentag fremgangsmåden for at oprette det krævede antal resin ringene (fig. 1D).
- Efterlade et hul på ca. 2 mm til fix harpiks ringe med nytte voks og sikre ydersiden af ekspansion skruen helt med gennemsigtigt harpiks. Indstille harpiks i 5 min på RT. Når polymerisering er fuldført, skal du fjerne ekspansion skrue knop (figur 1E).
3. kirurgisk protokol
- Bruge 8 uger gamle mand mus.
- Fremkalde anæstesi med en intraperitoneal injektion af medetomidine hydrochlorid på 0,3 mg/g, midazolam til 4 mg/kg og butorphanol tartrat på 5 mg/kg kropsvægt.
- Omhyggeligt barbere og desinficere det kirurgiske område med 10% jodopløsning, og derefter administrere 0,5% lidocain hydrochlorid på den højre nedre lemmer.
- Gøre en langsgående hud indsnit (ca. 15 mm i længden) til højre Sænk benet med en No. 15 skalpel. Ligeud adskille de underliggende muskler, pas på ikke for at fjerne alle periosteum. Tilgang udefra til nemt nå fibula. Skære fibula med saks.
- Gribe anklen med smalle tynde steril pincet, og bruge en steril 27 G nål til at lave et hul i knogle omkring 5 mm fra hælen. Nålen skal trænge hud, knogler og hud i nævnte rækkefølge. Når nålen trænger, skåret spidsen og rod med en nipper, så nålen er ca 15 mm.
- Gøre en anden hul på samme måde, omkring 2-3 mm proksimale. Hold omkring anklen og passere to 25 G nåle under knæet på samme måde. Efter nåle trænge, skære tips og rødder med en nipper (figur 1F).
- Placer den skræddersyede distractor således, at det er parallelt med udvidelse. Løse nåle og enhed med nok polymerisering dental harpiks til at fylde i rillerne på enheden. Afvente polymerisering til komplet (ca. 5 min.) (figur 1G).
- Pas på ikke at beskadige de omkringliggende væv. Skære i midten af diaphysis af skinnebenet ved hjælp af en meget tynd klippe disk mens anvendelse en saltopløsning (1-2 mL).
- Lukke såret med en 4-0 nylon sutur.
- Give subkutane injektioner af buprenorphin (0,1 mg/kg) for analgesi umiddelbart efter operationen. Fortsætte buprenorphin hver 12 h gennem postoperative dag 7 og efter behov derefter.
4. distraktion protokol
Bemærk: Der er forskellige rapporter på latency periode og distraktion sats, men her, repræsentative protokoller er vist.
- Efter en latenstid på 5 dage, begynde distraktion med en hastighed af 0,2 mm/12 h. For udvidelse, bruge PIN-koden er knyttet til den hurtige ekspansion skrue. Flytte pin i retning af den gule pil fastgjort til spindelforlænger (figur 1E).
- Anæstesi er ikke nødvendigt under udvidelse. Hold hale med den lille finger og palm, og rette udvidelse enhed med pege- og tommelfinger.
- Udføre forlængelse (0,2 mm til 1/4 omgang). Fortsat forlængelse for 8 dage, hvilket vil resultere i en samlet hul på 3,2 mm.
5. analyse
- Radiografi analyse: efter afslutningen af udvidelsen, vurdere knogle regenerering med computertomografi under generel anæstesi ved hjælp af 2,0% isofluran.
Bemærk: Hvis omhu har truffet med hensyn til placeringen af den forlængelse enhed, det er muligt at vurdere det med enkle radiografi selv med den enhed, der er knyttet. - Histologiske analyse: fjerne apparatet omhyggeligt for ikke at forårsage en fraktur distraktion site under prøvetagningen. Fix prøven i 10% neutrale bufferet formalin i 24 timer ved stuetemperatur. Afkalke med Morses løsning (10% natriumcitrat, 20% myresyre) natten over ved 4 ° C.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Tal 1A og 1B præsentere ufuldstændige ringe (ydre diameter, 20 mm indre diameter 10 mm; tykkelse, 5 mm) med paraffinvoks. To voks mønstre var indkapslet i silikone indtryk materiale, og en form for harpiks ringe (figur 1C) blev dannet. Polymeriseret resin blev straks hældt ind i denne støber, og harpiks ringe blev indhentet (fig. 1D). En skræddersyet distractor blev oprettet ved at kombinere to harpiks ringe og en ekspansion skrue (figur 1E). Figur 2 A præsenterer typisk radiografi resultater på 4 uger efter distraktion i modellen. Nydannede knogle blev observeret på webstedet distraktion. Figur 2B præsenterer hæmatoxylin og eosin pletter resultater. Nydannede knogle bro blev observeret, og de nydannede knogle kunne skelnes let fra den indfødte knogle. Der var ingen intraoperativ fraktur eller postoperative infektion i 5 mus bruges i dette eksperiment.
Figur 1 : Skræddersyede distractor. (A, B) Omtrentlige dimensioner af ringen er som følger: ydre diameter, 20 mm; indre diameter, 10 mm; tykkelse, 5 mm. Rum for ekspansion skrue (hvid pilespids) og nål (sort pilespids) er sikret. (C) voks mønster indkapslet i silikone indtryk materiale. (D) afsluttet harpiks ringe. (E) to harpiks ringe og ekspansion skruen er sikret med harpiks. (F) fire nåle er indsat i den proksimale og distale metaphysis af skinnebenet. (G) distraktion enheden placeret i mus lemmer. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2 : Radiologiske og histologiske fund. (A) radiologisk, nydannede knogle er observeret 4 uger efter distraktion. (B) Histologisk, kløften er fyldt med nydannede knogle (skalalinjen = 500 µm). Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Når et stort dyr bruges som en eksperimentel model, en færdiglavet udvidelse enhed kan bruges, og det er nemt at opnå god fiksering og vurdere udvidelse operationen og beløbet forlængelse. Når en mus bruges som en eksperimentel model, er det imidlertid nødvendigt at udvikle nogle eller alle af udstyr. Isefuku et al. og Tay et al. lavede enheden og lavet en mus model7,8. Carvahjo et al. vedtaget en metode, der involverer fiksering af en færdiglavet ekspansion enhed (spore distractor: KLS Martin) med en ligatur wire9. Vi kan også oprette musemodel, ved hjælp af eksisterende produkter til forlængelse enheder og udtænke en fiksering metode. Denne tilgang vil gøre det let at fremstille udvidelse enhed, udføre udvidelse og vurdere beløbet forlængelse. Derudover forventes det, at en tibial segmental defekt model kan være oprettet ved hjælp af den samme enhed. Derudover længden af defekten kan indstilles i trin på 0,2 mm, og således enheden anses for at være alsidige.
I sådan et eksperiment er det teknisk vanskeligt at tråd nålen gennem skinneben. Navnlig, diameteren af den distale del af skinnebenet er små, og nogle uddannelse skal passere to nåle. Om tilstrækkelig knogle ikke er noteret, er det nødvendigt at kontrollere, om god fiksering er opnået. For at opnå god fiksering, kan det være bedre at passere nåle i en vinkel og med et hul så bredt som muligt mellem nåle7,8. Desuden som satsen for healing og histologi under healing ville ændre efter osteotomi-metoden, er det nødvendigt at udføre proceduren på en bestemt måde.
Størrelsen af den eksperimentelle dyr kan betragtes som en begrænsende faktor i dette eksperiment. Der er ingen problemer, når musen er stort; men hvis det er for lille, kirurgi, sig kan ikke være muligt. Tidligere vi brugte 4 uger gamle mus og var i stand til at udføre eksperimenter uden nogen problemer10. Med hensyn til vurderingsperioden, kunne forlængelse enheder installeres uden problemer indtil 42 dage efter opskæring knoglen. Dog som yderligere observationer ikke blev gjort, er yderligere forskning nødvendig i fremtiden. Forekomsten af komplikationer kan være et problem, når fremme eksperimenter. Under operationen kunne forekomme i ca 1 ud af 30 mus. Tilsvarende, postoperativ sårinfektion kan forekomme i ca 1 ud af 30 mus.
Afslutningsvis, præsenterede vi en mus tibial model udviklet ved hjælp af en skræddersyet distractor.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ikke noget at oplyse.
Acknowledgments
Forfatterne takke Ms. Makiko Kato for at give opmuntring til at fuldføre denne undersøgelse. Vi takker også Division af forsøgsdyr og medicinsk forskning Engineering, Nagoya University Graduate School of Medicine, for opstaldning af mus.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Paraffin wax | YAMAHACHI DENTAL MFG. CO. | - | For preparation a mold for resin rings |
| Labocone putty | GC Corporation | - | For preparation a mold for resin rings |
| Utility wax | GC Corporation | - | For preparation a mold for resin rings |
| Expansion screw | Ortho Dentaurum | 600-301-30 | Component of custom-made distractor |
| Unifast III | GC Corporation | - | Immediate polymerization resin Component of custom-made distractor |
| Ortho Crystal | NISSIN | - | Transparent resin Component of custom-made distractor |
| 25 G needle | TERUMO | NN-2516R | For custom-made distractor |
| 27 G needle | TERUMO | NN-2719S | For custom-made distractor |
| ICR mouse | Chubu Kagaku Shizai Corporation | - | Experimental animal |
| Somnopentyl | Kyoritsu Seiyaku | - | Pentobarbital sodium salt |
| Isoflurane | FUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation | 099-06571 | Isoflurane inhalation solution |
References
- Watson, J. T. Distraction osteogenesis. The Journal of the American Academy of Orthopaedic Surgeons. 14, 168-174 (2006).
- Ilizarov, G. A. The tension-stress effect on the genesis and growth of tissues: Part II. The influence of the rate and frequency of distraction. Clinical Orthopaedics and Related Research. 239, 263-285 (1989).
- Wan, C., et al. Activation of the hypoxia-inducible factor-1 alpha pathway accelerates bone regeneration. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (2), 686-691 (2008).
- Fujio, M., et al. Stromal cell-derived factor-1 enhances distraction osteogenesis-mediated skeletal tissue regeneration through the recruitment of endothelial precursors. Bone. 49 (4), 693-700 (2011).
- Tong, L., et al. Focal adhesion kinase expression during mandibular distraction osteogenesis: evidence for mechanotransduction. Plastic and reconstructive surgery. 111 (1), 211-222 (2003).
- Rhee, S. T., El-Bassiony, L., Buchman, S. R. Extracellular signal- related kinase and bone morphogenetic protein expression during distraction osteogenesis of the mandible: in vivo evidence of mechanotransduction mechanism for differentiation and osteogenesis by mesenchymal precursor cells. Plastic and reconstructive surgery. 117 (7), 2243-2249 (2006).
- Isefuku, S., Joyner, C. J., Simpson, A. H. A murine model of distraction osteogenesis. Bone. 27 (5), 661-665 (2000).
- Tay, B. K., Le, A. X., Gould, S. E., Helms, J. A. Histochemical and molecular analyses of distraction osteogenesis in a mouse model. Journal of Orthopaedic Research. 16 (5), 636-642 (1998).
- Carvalho, R. S., et al. The role of angiogenesis in a murine tibial model of distraction osteogenesis. Bone. 34 (5), 849-861 (2004).
- Osawa, Y., et al. Activated FGFR3 promotes bone formation via accelerating endochondral ossification in mouse model of distraction osteogenesis. Bone. 105, 42-49 (2017).
