Summary
Ex vivo i bugspytkirtlen islet undersøgelser er vigtige for diabetes research. Eksisterende teknikker til at studere kulturperler Holme i deres native 3-dimensionelle arkitektur er tidskrævende, ineffektiv og sjældent brugt. Dette arbejde beskriver en ny, enkel og effektiv metode for at skabe høj kvalitet paraffinsnit af hele kulturperler Holme.
Abstract
Eksperimenter ved hjælp af isolerede pancreas Holme er vigtige for diabetes forskning, men Holme er dyre og af begrænset overflod. Holme indeholder en blandet celle befolkning i en struktureret arkitektur, der påvirker funktionen, og menneskelige Holme er meget variabel i celle type sammensætning. Nuværende hyppigt anvendte metoder til at studere kulturperler Holme omfatter molekylære undersøgelser udført på hele Holme, overbegreb uensartede islet celletyper sammen, eller mikroskopi eller molekylære undersøgelser på spredte islet celler, forstyrre islet arkitektur. For i vivo islet undersøgelser er paraffin-embedded bugspytkirtlen skæring en kraftfuld teknik til at vurdere celle-specifikke resultater i de indfødte i bugspytkirtlen miljø. At studere efter kultur Holme af paraffin skæring vil tilbyde flere fordele: påvisning af flere resultater på samme Holme (potentielt selv de eksakt samme Holme, ved hjælp af seriel afsnit), celle-type-specifikke målinger og opretholde indfødte Islet celle-celle og celle-undergrundens interaktioner både under eksperimentelle eksponering og analyse. Dog isoleret eksisterende teknikker til at indbygge Holme efter kultur er ineffektive, tidskrævende, tilbøjelige til tab af materiale, og generelt producere sektioner med utilstrækkelig islet tal at være nyttig til at kvantificere resultaterne. Klinisk Patologi laboratorium cell block forberedelse faciliteter er utilgængelige og upraktisk for grundlæggende forskningslaboratorier. Vi har udviklet en forbedret og forenklet bænk-top metode, der genererer sektioner med robust udbytte og distribution af Holme. Fast Holme er genopslemmes i varm histologiske agarosegel og pipetted i en flad skive på en standard glas dias, sådan at holmene er fordelt i et fly. Efter standard dehydrering og indlejring, kan flere (10 +) 4-5 µm sektioner skæres fra samme islet blok. Brug denne metode, kan histologiske og immunfluorescent analyser udføres på mus, rotter og menneskelige Holme. Dette er en effektiv, billig, tidsbesparende tilgang til at vurdere celle-type-specifikke, intakt-arkitektur resultater fra kulturperler Holme.
Introduction
Pancreas Holme af Langerhanske, den eneste kilde af cirkulerende insulin, er et kritisk væv for efterforskerne at studere diabetes mellitus. Fra enhver given organisme har Holme variabel størrelse, celle type frekvens og arkitektur1,2,3. Den konventionelle strategi at studere i vivo struktur og endokrine celle sammensætning af pancreas Holme er ved at inddele bugspytkirtlen væv4,5. Da Holme udgør kun en lille brøkdel af pancreas cellulære totalindholdet, er molekylære undersøgelser udført på isolerede småøer. Ex vivo islet kultur eksperimenter test svar på næringsstoffer, give gen graduering (Transfektion, transduktion) eller eksperimentelle behandlinger vigtig indsigt i mekanismerne modulerende endokrine celle overlevelse, spredning og funktion 5 , 6.
Ex vivo islet eksperimenter er ofte analyseret ved hjælp af molekylære studier af hele Holme eller histologiske eller molekylære studier af spredte islet celler dyrkes i éncellelag5,6. Molekylær analyse af hele Holme introducerer den alvorlige hage af iblanding celletyper, som kan producere falsk negative eller falsk-positive resultater, når de ekstrapoleres til enhver individuel celletype. Celle spredningen på coverslips til post kultur mikroskopi tillader celle-type-specifikke resultat måling, men forstyrrer islet arkitektur, som kan ændre svar til intervention og udelukker identifikation af arkitektur-relaterede resultater. Derudover kan generelt kun en enkelt resultat måles; for eksempel, for at måle beta celleproliferation og beta celledød på samme betingelser, skal to separate forsøg udføres. Disse tilgange er også blind for Inter islet variabilitet, et område af voksende interesse for feltet. Sortering ø-celler ved flowcytometri for celle-type-specifikke molekylære undersøgelser eller encellede RNA undersøgelser er elegant men dyrt, tidskrævende, begrænset af væv overflod, udryddelse af arkitektur, og ikke velegnet til rutinemæssig celle kultur analyser 5 , 7. Konfokal billeddannelse af hele-mount immunostained Holme giver data af høj kvalitet intakt-arkitektur, men er arbejdskraftintensive, og data indhentet fra hver prøve er begrænset til resultater kan identificeres i en enkelt immunfarvning8.
Mulighed for at skabe høj kvalitet paraffinsnit af post kultur hele Holme vil løse mange af disse bekymringer. Høje omkostninger, lav-overflod islet væv fra unikke genetiske modeller eller menneskelige organdonorer, eller Holme status post in vivo eller in vitro- eksperimentelle manipulation, er værdifulde. At opnå flere paraffinsnit fra de samme øer ville tillade flere celle-type-specifikke, intakt-arkitektur analyser fra det samme eksperiment.
Eksisterende teknikker til at generere islet pellets til skæring er ufuldkommen. Histologi-optimeret Agarosen er en vandig lavt smeltepunkt gel, der er almindeligt anvendt i behandlingen af histologiske og cytologiske prøver herunder små eller fragmenterede vævsprøver, som er vanskelige at processen9. Én islet indlejring tilgang er at suspendere holmene i Agarosen i et microcentrifuge rør, centrifugeres pellet materialet, hente plug agar og derefter behandle og integrere for skæring10,11. Uddrager den størknede prøve fra bunden af røret er tidskrævende og vanskeligt, fører til lejlighedsvis fragmentering af prøven og risiko for personskade. Holmene er koncentreret i spidsen af stik, fører til utilstrækkelig islet distribution i sektioner fra denne metode. Runde bunden af stikket komplicerer indlejring sådan, at en Holmen-fattige region kan blive præsenteret for skæring. Samlet set fører denne metode til lavt udbytte og klumpet islet distribution i de efterfølgende afsnit.
Denne nye metode er en forenklet og forbedret metode til forberedelse af holmen sektioner. Holme er koncentreret i en lille mængde og derefter placeret på den glatte overflade af et objektglas til at danne en lille skive med Holme i et enkelt fly. Histogel-Holmen disken er efterfølgende behandlet for paraffin indlejring i en forkortet dehydrering og xylen infiltration protokol. Den tidligere tilgang, som koncentrerer sig Holme i bunden af et mikrofuge rør, er også udført som en sammenligning. Denne nye teknik forbedrer udbyttet af Holme pr. sektion, fordelingen af Holme i hvert afsnit, og tager mindre tid til at overføre islet blokke til kassetter. Denne teknik er nyttig til Holmen biologer og andre forskere studerer små stykker af væv, der ønsker at maksimere produktiv brug af en lav-overflod væv ved at måle flere resultater på en enkelt prøve i sin oprindelige væv arkitektur.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle procedurer, der involverer dyr blev godkendt af UMass skole institutionelle dyr lægebehandling og brug udvalget. Menneskelige islet undersøgelser blev bestemt ved UMass institutionelle anmeld bestyrelsen at ikke kvalificere sig til IRB anmeldelse eller fritagelse, fordi de ikke indebærer brug af forsøgspersoner.
1. Holmen Isolation og kultur
- Isolere Holme og separat fra forurener eksokrine og duktalt væv ved hjælp af din foretrukne metode.
Bemærk: Denne metode var optimeret ved hjælp af Holme isoleret af collagenase duktalt oppustning og Ficoll adskillelse12 (gnaver) eller efter forsendelse Holme fra den integrerede Islet Distribution Program (IIDP13; menneske). Holme blev håndplukket med en P200 mikropipette. - For at optimere islet morfologi, tillade Holme at inddrive natten over i 10 mL komplet islet medium (RPMI med 10% FBS, penicillin/streptomycin og 5,5 mmol/L glukose) i en fugtig kammer, som indeholder 5% CO2 ved 37 ° C. Selvom dette trin ikke er påkrævet at få sektioner, holmene er mere intakt efter en restitutionsperiode (Se figur 2).
2. Holmen fiksation
- Ved hjælp af en lav-bindende P200 tip, håndplukke ca 250 islet ækvivalenter (IEQ)13 ved hjælp af en kalibreret gitter under et stereomikroskop ind i en 1,5 mL lave bindende mikrofuge rør. Lav-bindende tips og rør reducere islet tab.
- Tillad Holme at bilægge til bunden af det mikrofuge rør. Fjern de fleste supernatanten med P200 afpipetteres spids, pas på ikke for at fjerne enhver Holme.
- Der tilsættes 1 mL PBS. Der centrifugeres rør i en swingende spand centrifuge indtil hastigheden når 200 x g og derefter stoppe spin. Fjern supernatanten. Gentag PBS vask, for i alt to skylninger.
- Tilsættes 500 µL af 10% formalin løsning eller 4% frisklavet PARAFORMALDEHYD. Fix ved stuetemperatur i 30 minutter. For de udfald, der undersøges i denne metode, var disse fiksering metoder umulig at skelne. Kortere fiksering kan også være muligt; Det anbefales at optimere fiksering varighed for ønskede resultat.
- Fjerne fiksativ med P200 spids.
- Der tilsættes 1 mL PBS. Der centrifugeres rør indtil hastigheden når 200 x g og derefter stoppe spin. Fjern supernatanten. Gentag PBS vask, for i alt to skylninger.
- Gå straks til næste trin.
3. forberedelse af holmen disk (figur 1)
- Ved første brug, smelte gel (f.eks. Histogel) ved 70 ° C og gøre delprøver i 1,5 mL mikrofuge rør til langtidsopbevaring. Rumfanget er ikke kritisk, da delprøver kan genbruges.
- Varm gel (ca. 100 µL pr. sample) ved 70 ° C ved at placere mikrofuge tube indeholder gel alikvot i en varme blok sat til 70 ° C.
- Overføre Agarosen blå perler (10 µL for hver enkelt prøve) i en 1,5 mL ren mikrofuge rør. Grundigt resuspend perlerne før pipettering.
Bemærk: Blå perler er blandet med Holme til at bistå med visuelle identifikation af det integrerede materiale i knappen Agarosen og paraffin blok. Antallet af blå perler anvendes er ikke afgørende for resultatet, men undgå overdreven perler (> 5 x antallet af Holme) til at give optimal distribution af Holme i sektioner. - Vaske de blå perler med 1mL PBS, to gange. Spin perler 1 min på 800 x g for hver vask. Efter den anden vask, resuspend perler i (n+ 2) x 10 µL PBS, hvor n er antallet af prøveglassene; for eksempel for 2 prøveglassene, ville PBS volumen til at tilføje til perlerne være 40 µL.
- Centrifugeres mikrofuge rør indeholdende Holme (korte spin til 200 x g) og fjerne de fleste af supernatanten. Skære fra spidsen af en 10 µL mikropipette tip med en saks eller en kniv og tilføje 10 µL af perler til hver Holmen tube, ved hjælp af en ren tip for hver prøve. Bland ikke (for at undgå at miste Holme).
- Der centrifugeres Holme og perler (korte spin til 200 x g). Fjern så meget PBS som muligt med en uklippet 10 µL mikropipette spids.
- Label objektglas for eksempel identifikation. To til tre prøver kan være forberedt på de enkelte dias. Sted diaset på bænk nær varme blok med varmede gel. Skær spidsen af tre til fem 20 µL lave bindende mikropipette tips pr. prøve med et barberblad eller saks. Indlæse to P20 Mikropipetter med cut tips til at tillade hurtige Skift fra den ene til den anden.
- Bruger den første mikropipette, tilføje 15-20 µL af varm gel til Holme/perler mikrofuge rør; Bland straks, at undgå bobler; og anvende flydende Holme-agar-perler blandingen på diaset til at danne en < 1 cm diameter disken. Placer disken tæt på kanten af dias i forlader plads til de ydre gel ring (næste trin). Tryk på diasset forsigtigt et par gange for at bilægge Holme og perler.
- Ved hjælp af en anden mikropipette, tilføje 20 µL af varm gel til prøveglas. Ved hjælp af den første mikropipette, mix nye gel med enhver resterende Holme/perler, re opvarmning i den varme blok, hvis det begynder at størkne, derefter anvende denne blanding til diasset, omgiver den oprindelige disk. Gentag som nødvendigt, ved hjælp af yderligere pre-cut tips, indtil disken har den ønskede størrelse og tykkelse.
Bemærk: Håndtering geléagtig disken er lettere, hvis den udvendige ring er lidt tykkere. Normalt er 3 x 20 µL af gel tilstrækkelig. Dette trin minimerer tab af Holme ved tube vasker og tilføjer Holmen-fattige Agarosen uden på disken til at lette disc håndtering. - Udarbejde hver disk individuelt og holde nøje styr på prøve ordre hvis placere flere diske på hvert dias.
- Placere diasene på en flad overflade af våde is, med en dækning, i 10 minutter eller indtil gel størkner. Det er vanskeligere at skubbe disken ud glasset, hvis det udtørrer.
- Label biopsi forarbejdning/embedding væv kassetter med blyant, én pr. prøve. Tørre bagsiden af diaset for at undgå at fugte den blå papir.
- Bruger den sløve kanten af et barberblad, forsigtigt skubbe disken i hver retning for at frigøre det fra glasset. Når det glider nemt, langsomt skubbe disken fra objektglas på den blå silkepapir. Placer disken, flade side ned, direkte på papiret.
- Holde disc flad, fold papiret omkring den diskette hen til forhindre bevægelse, læg disken i foldet papir i kassetten, og luk kassetten. Hvis disken ikke glider rent ud glasset, tilføje flere gel og/eller returnere dias til is for et par minutter.
- Dykke kassette i PBS i et bægerglas. Processen for paraffin indlejring samme dag for optimal morfologi.
4. paraffin indlejring
Bemærk: Proces islet gel diske til paraffinblokke ved hjælp af en forkortet dehydrering serien som beskrevet nedenfor. Denne teknik blev optimeret ved hjælp af en automatiseret processor, men manuel behandling skal producere lignende resultater.
- Fordyb kassetter i 85% ethanol i 15 minutter.
- Fordyb kassetter i 95% ethanol i 15 minutter.
- Fordyb kassetter i 100% ethanol i 15 minutter. Gentag to gange i alt tre vasker.
- Fordyb kassetter i xylen i 15 minutter. Gentag to gange i alt tre vasker.
- Fordyb kassetter i smeltet paraffin i 10 minutter.
- Overføre kassetter til frisk smeltet paraffin for 10-30 minutter.
- Forsigtigt åbne kassetten og udpakke den blå papir. Fjern gel disk, at holde styr på den flade overflade, der var imod at papiret. Integrere disken i en lille støber, med den flade (Holm-holdige) del ned, parallelt med skærefladen. Efter stik, forsigtigt fjerne det fra kassetten og integrere den i en lille skimmel med spidsen pegende ind mod skærefladen.
5. paraffin skæring og farvning
- Label dias sekventielt, hvis seriel sektioner er påkrævet.
- Har 5 µm paraffinsnit skåret af en erfaren histotechnologist. For at maksimere udbyttet, gemme alle sektioner indeholder materiale. Generelt, indsamle 20 sektioner giver mulighed for erobringen af de fleste af materialet.
- Gemme sektioner ved stuetemperatur. Sektioner er indstillet til rutinemæssig histologiske pletter (fx, H & E) og immunofluorescens (fx insulin, glucagon og DAPI). Optimere fiksering for andre antigener, hvis nødvendigt.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
En illustreret skematisk af trin til at forberede gel disken er vist i figur 1. Denne gel disc metode resulterer i paraffinsnit, der indeholder et tilstrækkeligt antal Holme distribueres i et enkelt fly til at tillade meningsfuld kvantificering af resultater. Figur 2 viser lav forstørrelse billeder af de deraf følgende afsnit illustrerer antallet af Holme fanget pr. sektion. Generelt > 35 Holme var synlige i hvert afsnit, når 250 IEQ blev brugt under proceduren, og > 10 sektioner (4-5 µm) indeholdende Holme blev fremstillet af hver prøve. Øge antallet af Holme anvendes proceduren for øget antallet af Holme i afsnittene. Holme i sektioner var strukturelt forskelligartede og af varierende størrelser, støtter det nye koncept og interessante data kan opnås ved hjælp af sektioner i stedet teknikker blind for Inter islet forskelle. Metoden arbejdede lige så godt for gnavere Holme isoleret i laboratoriet (rotte, mus) og for menneskers Holme modtaget efter afsendelse af IIDP. Gnaver Holme var mærkbart mere intakt morfologi efter post isolation opsving natten over i Holmen medium, med en glat overflade, afrundet og kompakt kugleform (fig. 2A). Menneskelige islet morfologi var ens, når indlejret på ankomstdagen eller indlejret efter efterfølgende opsving natten, måske fordi holmene havde allerede tilbagebetalt fra isolation stress inden afsendelse. Metoden microtube givet en mindre væv tværsnitsareal med færre Holme pr. sektion, og tæt pakket Holme og perler (figur 2B). Microtube billeder vist i figur 2B var det bedste vi har kunnet opnå med denne metode; en af prøverne var nødt til at blive sendt tilbage til at skære flere sektioner, fordi ingen Holme ikke blev fundet i det første sæt af sektioner.
Denne teknik genererer høje kvalitet islet sektioner for histologiske og immunfluorescens farvning (figur 3). Insulin og glukagon farvning viste diverse sammensætning og heterogenitet af holmen arkitektur. Afsnittene klart sammenfattet kendt arkitektur forskelle mellem menneskelige, mus og rotter Holme, med menneskelige Holme består af rigelige α-cellerne sammenblandet med beta-celler, der henviser til, at mus og rotter Holme viste lignende arkitektur med en beta celle kerne og alfa celler i periferien. Seriel afsnit var opnåelige; panelerne i figur 3 viser serie dele af den samme islet farvet for H & E (venstre) og immunofluorescens (til højre).
Figur 1 . Illustration af de kritiske trin for at gøre islet gel disken. Gel opvarmes til 70 ° C i varme blokken (A) overføres til det lave bindende mikrofuge rør indeholdende islet/perle pellet (B). Holmene er genopslemmes i varm gel og overført til et glas dias, sprede materialet i en disk form (C-D). Ekstra ren gel er overført til det mikrofuge rør, så alle resterende materiale er fjernet og sprede circumferentially omkring den oprindelige islet/perle-holdige disk på glas dias (E-F). Efter geldannende på is, er disken overført, flade side ned, til histologi papir (G), som er foldet og placeret i en kassette (H) til forarbejdning. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2. Paraffinsnit gel diske indeholder et stort antal godt distribueret Holme. (A) lav forstørrelse paneler (40 X, 3 x 3 billeder syet sammen, med 15% overlap) af mus, rotte eller menneskelige islet sektioner plettet med H & E viser, at mange Holme er synlige i hver sektion. Høj forstørrelse mellemværker (200 X) Vis repræsentative Holme. Venstre paneler viser dele af Holme indlejret umiddelbart efter isolering (mus, rotter) eller forsendelse (menneskelige); rigtige paneler viser Holme indlejret efter natten opsving i kultur. Bleg blå cirkler set i 40 X billeder er perlerne inkluderet for visualisering under indlejring og skæring. Disse særlige prøver er fra en C57BL/6N mus (1 år gammel) og BBDR rotte (4 uger gamle), Holme isoleret af duktalt collagenase injektion og Ficoll adskillelse og menneskelige T2D Holme modtaget fra IIDP. (B) 250 IEQ af menneskelige Holme indlejret pr. den gamle mikrofuge tube teknik, til sammenligning. Lav forstørrelse paneler (40 X; en enkelt unstitched billed fanget alt materiale) og høj mag mellemværker (200 X) Vis repræsentative sektioner. Substratet var RPMI med 10% FBS, penicillin/streptomycin og 5,5 mmol/L glukose. Skala barer for lav forstørrelse paneler er 1000 µm; skala barer for høj forstørrelse paneler er 50 µm. venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3 . Repræsentant histokemiske og immunfluorescens farvning på serielle islet sektioner. Dele af mus, rotter og menneskelige Holme indlejret efter natten kultur var farvet for H & E og afbildet af brightfield mikroskopi (200 X, venstre). En tilstødende afsnit var plettet for insulin (rød), glukagon (grøn), monteret i DAPI-holdige medier (blå) og afbildet ved hjælp af fluorescerende mikroskopi (200 X, højre). Skalere barer: 50 µm. venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Denne modificerede gel-disk-baserede indlejring metode giver en enkel, billig, og effektiv måde at generere et højt udbytte af Holme pr. sektion. Konstruere gel disken på en flad glasoverflade letter sprede Holme i en jævn fordeling over et veldefineret område. Sprede Holme i en flad skive tilbyder fordelen, at placere mange Holme i flyet af afsnit, optimere udbyttet og giver færre Holme skal anvendes. Disc tykkelse kan justeres til at opfylde efterforskernes behov. Da flere sektioner kan opnås, kan seriel dele af de samme Holme blive analyseret, øge antallet af forskellige resultater, der kan måles på samme eksperimentel prøve. Selvom optimeret her for pancreas Holme, kunne teknikken anvendes på andre lav-overflod materiale, herunder dem med små stykker, letsmuldrende karakter eller tyktflydende prøver, der ellers ville være vanskelige at behandle. Denne metode er optimeret til frisk-fast Holme og er ikke blevet testet for andre typer af materiale, som tidligere frosne Holme. Disse sektioner kan også være nyttigt for i situ hybridisering assays til at opdage DNA eller RNA. Tilføjelse af ekstra gel tjener to formål: at maksimere islet samling og beskytte byens ø-rige disc fra forstyrrelser under håndtering/overførsel. Tynd gel disken størkner hurtigt og tillader forkortet dehydrering og xylen infiltration trin til integrering af paraffin. Danner disken på en flad overflade og ikke i en sekundær container (mikrofuge tube eller kultur plade godt) gør det lettere at fysisk overføre disken til kassette til forarbejdning. Sammenlignet med disk teknik resultater, microtube teknik havde reduceret islet udbytte og klumpet islet distribution, selvom ikke-planar væv arrangement kunne generere et højere antal Holmen-holdige sektioner.
Kritiske trin i protokollen omfatter væv fiksering, dannelse af gel disken, paraffin indlejring, og skæring. Med hensyn til fiksering, som er testet af H & E og immunfluorescens for insulin og glukagon, blev ingen forskel fundet mellem PFA og formalin eller fiksering varighed spænder fra 10-30 minutter (ikke vist). Dog skal fiksering intensitet og varighed være optimeret til slutbrugerens behov. Den vigtigste nyskabelse er indeholdt i denne protokol er forberedelsen af gel islet disken; kritiske trin er sammenfattet i figur 1. Nøglen skridt omfatter ved hjælp af en lille mængde af gel for at koncentrere væv i et lille område og danner disken på en flad overflade for at arrangere væv i et enkelt fly skæring. Brug af lav-bindende mikrofuge rør og tips og en swingende spand centrifuge for alle spins forbedrer væv udbytte; Holme holde sig til plast efter fiksering. Tilsætning af let synlige perler bistår med disc dannelse, integrering og skæring. At fjerne så meget PBS som muligt før du tilføjer gel er afgørende for at undgå at udvande agarosegelelektroforese, hvilket fører til dårlig størkning og besvær overfører disken til papiret. Holder den tynde disk intakt, mens skubbe det fra glas dias til papiret kan være udfordrende. Hvis en rynke opstår i disken, gør det muligt at vende tilbage til den oprindelige position, tilføje flere gel og re chill diaset. Med hensyn til paraffinen indlejring er det vigtigt, at disken være indlejret flat-side ned og parallelt med den i skæring. En histotechnologist oplevet med opskæring paraffinsnit er afgørende for succes i denne procedure, da materialet er koncentreret på forkanten af blokken. Overdreven vender ud af blokken kan føre til tab af prøven. Det anbefales at starte indsamling sektioner, så snart den blå perler er synlige.
Fiksering intensitet og varighed skal være optimeret til slutbrugerens specifikke væv og behov. Antallet af Holme anvendes pr. sample kan ændres, hvis det er nødvendigt; men at reducere råvare opretter sektioner med færre Holme. Tykkere eller større diske kan genereres ved hjælp af denne teknik; dehydrering og xylen infiltration trin kan være nødvendigt at blive forlænget og skal optimeres. Hvis resulterende sektioner indeholder kun en delvis disk form, overveje muligheden for, at disken ikke var indlejret parallelt på skærefladen. Hvis for få sektioner er fremstillet, kan tekniker har mistet materiale under første blok forberedelse.
Denne metode opretter sektioner indeholdende faste islet væv og som sådan, kan kun bruges for histologiske resultater. For at få et stort antal Holme pr. sektion, 200-250 IEQ blev starter materiale anvendt, som udfordrende for at generere for nogle eksperiment typer. Høj kvalitet sektioner er afhængige af at have en erfaren histotechnologist.
Evnen til at generere 10 + sektioner indeholder mange Holme fra en enkelt eksperimentelle betingelse vil give mulighed for kvantificering af flere resultater på det samme materiale, forbedre eksperimentelle effektivitet. Rutinemæssig analyse af intakt Holme kan føre til fremskridt i forståelsen i væv heterogenitet, ikke kun på et cellulært niveau, men også på niveauet islet om hvor lidt er i øjeblikket forstået. Anvende denne teknik til andre limited-overflod vævsprøver kan tilbyde ydelser til andre felter.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ingen interessekonflikter at erklære.
Acknowledgments
Vi parlamentsarbejdet gruppen Beta Cell Biology på UMass Diabetes Center of Excellence for nyttige råd og diskussioner. Menneskelige pancreas Holme blev leveret af den NIDDK-finansierede integrerede Islet Distribution Program (IIDP) på City of Hope. Dette arbejde blev finansieret af NIH/NIDDK: R01-DK114686 (LCA), R01-DK105837 (CY), 2UC4DK098085 (IIDP) og af American Diabetes Association yde #1-15-BS-003 (LCA) i samarbejde med rækkefølgen af amarant.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1.5 mL Eppendorf tube | Norgen Bioteck Corp | P/N 10113 | |
| Ranin Classic Starter Kit | ShopRanin | 17008708 | |
| Ranin ClassicPipette PR-2 | ShopRanin | 17008648 | |
| Low Binding Tip (1000 μL) | Genesee Scientific | 24-430 | |
| Low Binding Tip (200 μL) | Genesee Scientific | 24-412 | |
| Low Binding Tip (20 μL) | Genesee Scientific | 24-404 | |
| Low Binding Tip (10 μL) | Genesee Scientific | 24-401 | |
| 10% Formalin solution | Sigma | HT501128 | |
| Paraformaldehyde | Electron Microscopy Sciences | 15710-S | |
| Heatblock | VWR | 949312 | |
| HistoGel | Thermo Scientific | HG-4000-012 | |
| Agarose blue beads- Affi-gel | Bio-Rad | 153-7301 | |
| Dulbecco's PBS | Life technologies | 14190-144 | |
| Tissue processing cassette | Simport | M492-10 | |
| Bio-Wraps | Leica-Surgipath | 3801090 | |
| Citadel 2000 tissue processor | Thermo-Shandon LLC | ||
| Ethanol 200 proof | Decon Laboratories, INC | 2701 | |
| Xylene | Fisher Chemical | X5SK-4 | |
| Paraffin | McCormick Scientific | 39503002 | |
| Microtome | Thermo-Shandon LLC | Finesse ME+ | |
| Insulin antibody | DAKO | A0564 | |
| Glucagon antibody | Sigma | G2654 | |
| Fluoroshield with DAPI | Sigma | F6057 | |
| Alex fluor 594 secondary antibodies | Life technologies | A11076 | |
| Alex fluor 488 secondary antibodies | Life technologies | A11001 |
References
- Kim, A., Miller, K., Jo, J., Kilimnik, G., Wojcik, P., Hara, M. Islet architecture: A comparative study. Islets. 1 (2), 129-136 (2009).
- Steiner, D. J., Kim, A., Miller, K., Hara, M. Pancreatic islet plasticity: Interspecies comparison of islet architecture and composition. Islets. 2 (3), 135-145 (2010).
- Campbell-Thompson, M. L., Heiple, T., Montgomery, E., Zhang, L., Schneider, L. Staining protocols for human pancreatic islets. Journal of Visualized Experiments. (63), (2012).
- Da Silva Xavier, G.
- Sharma, R. B., et al. Insulin demand regulates β cell number via the unfolded protein response. The Journal of Clinical Investigation. 125 (10), 3831-3846 (2015).
- Stamateris, R. E., et al. Glucose Induces Mouse β-Cell Proliferation via IRS2, MTOR, and Cyclin D2 but Not the Insulin Receptor. Diabetes. 65 (4), 981-995 (2016).
- Blodgett, D. M., et al. Novel observations from next-generation rna sequencing of highly purified human adult and fetal islet cell subsets. Diabetes. 64 (9), 3172-3181 (2015).
- Brissova, M., et al. Assessment of human pancreatic islet architecture and composition by laser scanning confocal microscopy. Journal of Histochemistry & Cytochemistry. 53 (9), 1087-1097 (2005).
- Joiner, K. S., Spangler, E. A. Evaluation of HistoGelTM-embedded specimens for use in veterinary diagnostic pathology. Journal of Veterinary Diagnostic Investigation: Official Publication of the American Association of Veterinary Laboratory Diagnosticians, Inc. 24 (4), 710-715 (2012).
- Cozar-Castellano, I., Takane, K. K., Bottino, R., Balamurugan, A. N., Stewart, A. F. Induction of beta-cell proliferation and retinoblastoma protein phosphorylation in rat and human islets using adenovirus-mediated transfer of cyclin-dependent kinase-4 and cyclin D1. Diabetes. 53 (1), 149-159 (2004).
- La Fortune, K. A., Randolph, M. L., Wu, H. H., Cramer, H. M. Improvements in cell block processing: The Cell-Gel method. Cancer Cytopathology. 125 (4), 267-276 (2017).
- Alonso, L. C., et al. Glucose infusion in mice: A new model to induce beta-cell replication. Diabetes. 56 (7), 1792-1801 (2007).
- Olack, B., Omer, A., Richer, B., Weir, G. Integrated Islet Distribution Program: Islet handling tips. at. , Available from: http://iidp.coh.org/ (2018).
