Ex vivo bukspyttkjertelen Holme studier er viktig for diabetes forskning. Eksisterende teknikker å studere kulturperler holmer i sin opprinnelige 3-dimensjonale arkitektur er tidkrevende, ineffektive og sjelden brukt. Dette verket beskriver en ny, enkel og effektiv metode for å generere høy kvalitet parafinsnitt av hele kulturperler holmer.
Eksperimenter ved hjelp av isolerte bukspyttkjertelen småøyer er viktig for diabetes forskning, men holmer er dyrt og begrensede overflod. Holmer inneholder en mikset-celle befolkningen i en strukturert arkitektur som påvirker funksjonen menneskelige holmer er mye variabel i celle type komposisjon. Gjeldende brukte metoder å studere kulturperler holmer inkluderer molekylære studier utført på hele holmer, lumping ulike Holme celletyper sammen, eller mikroskopi eller molekylære studier på spredt Holme celler, forstyrre Holme arkitektur. For i vivo Holme studier er parafin-embedded bukspyttkjertelen snitting en kraftfull teknikk for å vurdere celle-spesifikke resultater i sine opprinnelige bukspyttkjertelen omgivelser. Studere etter kultur holmer av parafin snitting vil gi flere fordeler: påvisning av flere resultater på samme holmer (potensielt også nøyaktig samme øyene, bruker serielle deler), celle-spesifikk målinger og opprettholde opprinnelig Holme celle-celle og celle-undergrunnen interaksjoner både under eksperimentelle eksponering og for analyse. Men isolerte eksisterende teknikker for innebygging holmer etter kultur er ineffektiv, tidkrevende, utsatt for tap av materiale, og generelt produsere deler med utilstrekkelig Holme tall å være nyttig for kvantifisere resultater. Klinisk patologi er laboratorium cellen blokk forberedelse utilgjengelig og upraktisk for grunnleggende forskningslaboratorier. Vi har utviklet en forbedret, forenklet benk toppen metoden som genererer seksjoner med robust avkastning og distribusjon av holmer. Fast holmer er resuspended i varme histologiske agarose gel og pipetted i en flat plate på en standard objektglass, slik at øyene er distribuert i et fly. Etter standard dehydrering og innebygging, kan 4-5 µm inndelingene (10 +) bli kuttet fra samme Holme blokk. Bruker denne metoden, kan histologiske og immunofluorescent analyser utføres på mus, rotte og menneskelige holmer. Dette er en effektiv, rimelig, tidsbesparende å vurdere celle spesifikk, intakt-arkitektur resultatene fra kulturperler holmer.
Bukspyttkjertelen holmer Langerhans, den eneste kilden til sirkulerende insulin, er en kritisk vev for etterforskere studere diabetes mellitus. Fra noen gitt organisme har holmer variabel størrelse, celle type frekvens og arkitektur1,2,3. Den konvensjonelle strategien å studere i vivo struktur og endokrine celle sammensetning av bukspyttkjertelen holmer er ved snitting bukspyttkjertelen vev4,5. Siden holmer utgjør bare en brøkdel av bukspyttkjertelen mobilnettet innholdet, utføres molekylære studier på isolerte småøyer. Ex vivo Holme cellekulturer eksperimenter testing respons på næringsstoffer, gi gene modulering (hva, signaltransduksjon) eller eksperimentelle behandlinger viktig innsikt i mekanismer modulerende endokrine celle overlevelse, spredning og funksjon 5 , 6.
Ex vivo Holme eksperimenter er ofte analysert ved hjelp av molekylære studier av hele holmer eller histologiske eller molekylære studier av spredt Holme celler dyrket i monolayer5,6. Molekylær analyse av hele holmer introduserer den alvorlige påminnelse blander celletyper, som kan gi falsk negativt eller falske positive resultater når extrapolated til en enkelt celle type. Celle spredning på coverslips for post kultur mikroskopi tillater celle spesifikk utfallet måling, men forstyrrer Holme arkitektur, som kan endre svar til intervensjon og utelukker identifikasjon av arkitektur-relaterte resultater. Dessuten, kan vanligvis bare en enkelt utfall måles; for eksempel for å måle beta-celle spredning og beta-celledød under samme vilkår, må to separate forsøk utføres. Disse metodene er også blind for Inter Holme variasjon, et område av økende interesse i feltet. Sortering Holme celler av flowcytometri for celle spesifikk molekylære studier eller encellede RNA studier er elegant men dyre, tidkrevende, begrenset av vev overflod, arkitektur-utrydde, og ikke godt egnet til rutinemessig celle kulturanalyser 5 , 7. AC confocal imaging av hele-mount immunostained holmer gir høy kvalitet intakt-arkitektur data, men er arbeidsintensiv, og data fra hvert utvalg er begrenset til resultater identifiserbar i en enkelt immunostai-8.
Muligheten til å generere høy kvalitet parafinsnitt av etter kultur hele holmer ville ta mange av disse bekymringene. Høye kostnader, lav-overflod Holme vev fra unik genetisk modeller eller menneskelig orgel givere eller holmer status innlegg i vivo eller i vitro eksperimentelle manipulasjon, er dyrebare. Få flere parafinsnitt fra samme øyene ville tillate flere celle spesifikk, intakt-arkitektur analyser fra samme eksperiment.
Eksisterende teknikker for å generere Holme pellets snitting er ufullkomne. Histology-optimalisert agarose er en vandig lavt Smeltepunkt gel som er mye brukt i behandling av histologiske og fargemaskin prøver inkludert lite eller for fragmentert vevsprøver som er vanskelige å prosessen9. En Holme innebygging tilnærming er å suspendere øyene i agarose i et microcentrifuge rør, virvel å pellets materialet, hente agar pluggen, deretter behandle og legge til snitting10,11. Utdrager befestet prøven fra bunnen av røret er tid forbruker og vanskelig, fører til sporadisk fragmentering av prøven og risiko for personskader. Øyene er konsentrert i spissen av pluggen, fører til utilstrekkelig Holme distribusjon i delene fra denne metoden. Rundt bunnen av kompliserer innebygging slik at en Holme-fattig region kan bli presentert snitting. Total, denne metoden fører til lav avkastning og klumpet seg Holme fordelingen i de resulterende delene.
Denne nye metoden er en forenklet og forbedret tilnærming for utarbeidelse av Holme deler. Holmer er konsentrert i små og deretter plassert på glatte overflaten av en microscope skyve å danne en liten plate, med øyene et enkelt fly. Histogel-Holme platen behandles deretter for parafin innebygging i en forkortet dehydrering og xylen infiltrasjon protokollen. Den forrige fremgangsmåten, som konsentrerer øyene bunnen av et microfuge rør, utføres også som en sammenligning. Denne nye teknikken forbedrer avkastningen av holmer per seksjon, distribusjon av holmer i hver del, og tar mindre tid å overføre Holme blokkene til kassetter. Denne teknikken er nyttig for Holme biologer eller andre forskere studere små biter av vev som ønsker å maksimere produktiv bruk av en lav-overflod vev ved å måle flere resultater på en enkelt prøve i sin innfødt vev arkitektur.
Denne endrede gel-disk-baserte innebygging metoden gir en enkel, billig og effektiv måte å generere en høy avkastning av holmer per seksjon. Konstruere gel platen på en flat glassoverflate forenkler spre holmer i en jevn distribusjon over et godt definert område. Spre øyene en flat plate tilbyr fordelen av å plassere mange holmer i flyet delen, optimalisere ytelse og slik at færre holmer skal brukes. Platen tykkelsen kan justeres etter etterforskere behov. Siden flere inndelinger kan oppnås, kan seriell deler av…
The authors have nothing to disclose.
Vi erkjenner takknemlig gruppen Beta-celle biologi ved UMass Diabetes Center of Excellence for nyttige råd og diskusjoner. Menneskelige bukspyttkjertelen holmer ble levert av den NIDDK-finansierte integrert Holme distribusjon Program (IIDP) på City of Hope. Dette arbeidet ble finansiert av NIH/NIDDK: R01-DK114686 (LCA), R01-DK105837 (CY), 2UC4DK098085 (IIDP) og ved American Diabetes Association gir #1-15-BS-003 (LCA) i samarbeid med rekkefølgen av Amaranth.
1.5 mL Eppendorf tube | Norgen Bioteck Corp | P/N 10113 | |
Ranin Classic Starter Kit | ShopRanin | 17008708 | |
Ranin ClassicPipette PR-2 | ShopRanin | 17008648 | |
Low Binding Tip (1000 μL) | Genesee Scientific | 24-430 | |
Low Binding Tip (200 μL) | Genesee Scientific | 24-412 | |
Low Binding Tip (20 μL) | Genesee Scientific | 24-404 | |
Low Binding Tip (10 μL) | Genesee Scientific | 24-401 | |
10% Formalin solution | Sigma | HT501128 | |
Paraformaldehyde | Electron Microscopy Sciences | 15710-S | |
Heatblock | VWR | 949312 | |
HistoGel | Thermo Scientific | HG-4000-012 | |
Agarose blue beads- Affi-gel | Bio-Rad | 153-7301 | |
Dulbecco's PBS | Life technologies | 14190-144 | |
Tissue processing cassette | Simport | M492-10 | |
Bio-Wraps | Leica-Surgipath | 3801090 | |
Citadel 2000 tissue processor | Thermo-Shandon LLC | ||
Ethanol 200 proof | Decon Laboratories, INC | 2701 | |
Xylene | Fisher Chemical | X5SK-4 | |
Paraffin | McCormick Scientific | 39503002 | |
Microtome | Thermo-Shandon LLC | Finesse ME+ | |
Insulin antibody | DAKO | A0564 | |
Glucagon antibody | Sigma | G2654 | |
Fluoroshield with DAPI | Sigma | F6057 | |
Alex fluor 594 secondary antibodies | Life technologies | A11076 | |
Alex fluor 488 secondary antibodies | Life technologies | A11001 |