필드에서 식물 뿌리의 발굴 뿐만 아니라 endosphere, rhizosphere, 및 토양 샘플의 처리는 DNA 추출 및 데이터 분석 방법 등 자세하게에서 설명 되어 있습니다. 이 문서는 토양, endosphere, rhizosphere microbiomes의 연구에 대 한 이러한 기법을 사용 하 여 다른 실험실을 사용 하도록 설계 되었습니다.
식물 및 토양 미생물 연구 이해 역할 미생물 농업 생산성에서 재생에 대 한 점점 더 중요 한 되 고 있다. 이 논문의 목적은 빠르게 토양, rhizosphere, 및 endosphere 복제 된 현장 실험의 샘플 유형, 치료, 및 식물 유전자 미생물 지역 사회에서 발생할 수 있는 변경 내용을 분석 하는 방법에 정보를 제공 하도록. 이러한 메서드를 보여 주기 위해 사용 하는 실험 웜 시즌 잔디 2, 순수를 포함 하는 복제 필드 플롯의 구성 (Panicum virgatum 및 Andropogon gerardii) 및 낮은 다양성 잔디 혼합물 (A. gerardii, Sorghastrum nutans, 및 Bouteloua curtipendula). 간단히, 식물 발굴, 다양 한 뿌리는 잘라 고 인산 염 버퍼에 배치 다음 동요는 rhizosphere를 수집 하. 뿌리는 얼음 및 표면 소독 표 백제와 에탄올 (EtOH) 실험실에 주어진 다. rhizosphere 필터링 하 고 원심 분리에 의해 집중. 루트 볼 주위에서 발굴된 토양 비닐 봉지에 배치 하 고 토양의 작은 금액을 DNA 추출에 대 한 촬영은 연구실로 가져. DNA는 뿌리, 토양, 및 rhizosphere에서 추출 하 고 16S rRNA 유전자의 v 4 영역에 대 한 뇌관으로 증폭. Amplicons 시퀀싱, 다음 오픈 액세스 생물 정보학 도구와 분석. 이러한 방법을 연구원 미생물 지역 사회 성과 구성 샘플 유형, 치료, 인해 다릅니다 어떻게 테스트 하 고 유전자를 식물. 통계 모델과 함께 이러한 방법을 사용 하 여, 대표적인 결과 입증 뿌리, rhizosphere, 및 토양 미생물 지역 사회에 중요 한 차이가 있다. 여기에 제시 하는 방법 단계 필드 샘플을 수집, 분리, 추출, 계량, 증폭, 및 DNA 시퀀싱 하는 방법에 대 한의 완전 한 세트를 제공 하 고 미생물 지역 사회 성과 복제 필드 재판에서 조성 분석.
미생물 연구 이해 하 고 조작 영양소 사이클링, 유기 물 회전율, 및 개발 또는 토양 병원 균1,2의 저해 등 생태계의 프로세스에 대 한 중요 한 의미를 갖는다. 연구의이 분야는 또한 천연 식물 지역 사회와 agroecosystems의 생산성에 토양 미생물의 영향을 이해 하기 위한 큰 잠재력을 보유 하고있다. 자연 생태계에서 토양 미생물에 초점을 맞춘 많은 연구는, 적은 agroecosystems3공장 rhizosphere 및 endosphere 미생물에 집중 했다. 네브라스카, 농업 농업으로 중요 한 작물 연구에 대 한 중요 한 주제를 재배는 이러한 토양의 연구를 만드는 국가의 큰 부분에 걸쳐 풍경을 지배. 이 방법 종이의 목표는 식물의 뿌리에는 rhizosphere와 endosphere, 그리고 결국 미생물 지역 사회를 수정 하는 방법을 확인 하려면 agroecosystems에 미생물을 설명 하는 프로토콜의 표준 세트와 연구자를 제공 하기 이러한 미생물 토양 건강 및 공장 생산성에서 재생 하는 기능을 이해 합니다.
여기에 제시 된 방법4,5 에서이 종이 어떤 미생물 학습 겨냥은 독점적으로 내부 루트 및 루트 밖에 즉시 미생물에서 서로 어떻게 다른 사람에 의해 사용 되는 방법에서 약간 차이가 있는 rhizosphere입니다. 이 연구에 사용 하는 amplicon 시퀀싱 DNA 샘플에서 발견 미생물 taxa 고 커뮤니티 샘플 형식 또는 치료에 따라 변경 하는 방법을 결정 하는 조사를 허용 합니다. 이 프로토콜 Lundberg 외 에서 사용 하는 매우 비슷한 프로토콜의 주요 차이점 중 하나 6 그 대신 쥡니다,이 프로토콜 사용 하 여 표면 살 균 표 백제와 에탄올 뿌리에서는 rhizosphere를 제거 하는. 다른 사람 또한 효과적으로 표면 살 균 사용7,8,,910. 이러한 메서드는 하지만 약간 다른 다른 방법 보다 더 유리한 있습니다. 이러한 메서드는 충분 한 사람들이 함께 그것은 endosphere, rhizosphere, 및 토양으로 분할 될 때 약 450 샘플까지 추가 하루 150 필드 플롯을 처리할 수 있기 때문에 특히 큰 필드 실험에 적합 합니다. 이 원고 분야에서 샘플, 실험실에서 자료 처리 하 고 추출 하 고, DNA 시퀀싱 하는 데 사용 하는 방법을 자세히 설명 하 고 결과 시퀀싱 데이터를 분석 하는 단계에 대 한 간략 한 개요를 제공 합니다.
이 원고에 설명 된 방법을 쉽게 토양과 식물 metagenomics의 필드를 입력 하는 과학자를 사용 해야 합니다. 년 동안, 우리는이 원고에서 설명 하는 실험을 실시 이후 우리의 방법을 세련는. 한 변화는 우리가 지금 미리 라벨 튜브 샘플 필드에 외출 하기 전에. 우리의 실험실 바코드 시스템 및 라벨 프린터를 사용합니다. 라벨 프린터는 뿐만 아니라 시간 때 라벨 튜브, 뿐만 아니라 모든 것을 쉽게 추적 하 고 올바르게 식별 인간의 손 쓰기의 vagaries 없이 샘플을 저장 합니다. 또 다른 중요 한 요점은 우리는 다시 가능한 한 빨리 필드에서 그것를 데 려 후 자료를 처리 하려고입니다. 우리는 DNA 분석에 사용 되는 토양 동결, 소독, 뿌리를 고정 필터링 그리고는 rhizosphere 필드에서 반환 된 후 12 ~ 36 시간 이내 동결 하고자 합니다. DNA 추출 절차는 토양을 rhizosphere, 특히 많은 단계로 긴 그래서 우리 DNA 추출 프로토콜에 대 한 시간에 손을 최소화, 도입 될 수 있습니다, 인간의 오류를 감소 하는 로봇 (Kingfisher 플렉스, ThermoFisher) 구입 다른 방법에 일관성을 향상 하 고 토양, 뿌리, 또는 rhizosphere의 일괄 처리 됩니다. 공장 설비 재료를 작업할 때 그것은 공부 또는 “견본”를 루트 종류의 다양 한 루트 형식을 결정 하는 것이 중요. 유지 뿌리 그리고 때 DNA 추출 수행 하는 것이 중요, 96-잘 DNA 추출 접시를 채울 때 샘플 사이의 교차 오염 없이 보장은 냉동된 상태에서 떠난다. 고려해 야 할 또 다른 중요 한 요소는 필드 실험을 디자인 하 고 완전 한를 사용 하 여 무작위로 디자인 가능한 때 사용할 복제의 번호26. 높은 분야 다양성 때문에 그것은 작은 차이 감지 하는 복제의 다 수 필요할 수 있습니다. 마지막으로, 우리의 경험에서 뿌리를 발굴 하는 때 토양은 너무 젖은 하지 있는지 확인이 필수적입니다. 토양 물으로 포화 되는 경우 그것은 작업할 더러운 하지만 그것은 또한 매우 어려운는 rhizosphere를 정의 하 고 뿌리에서 토양을 제거 하.
초기에 이러한 방법을 개발 하는 동안 만들어진 하나의 수정 했다 대신 우리 분야에 더 많은 작업을 쉽게 하기 위해 가스 발전기에 의해 구동 vortexers 업그레이드 rhizosphere 출시를 손으로 튜브를 떨고 표준화의 관점에서 시간과 방식으로 각 튜브 동요 했다. Amplicon 시퀀싱 방법의 한 가지 한계는 결과 분류학 해상도 종종 제한 됩니다 많은 OTUs는 알 수 없는 또는 유일한 알려진 가족 또는 속 수준입니다. 연구의이 분야는 새롭고 개발 방법, 데이터 분석 결과의 해상도 향상 시킬 수 있는 특히 인식 하는 것이 중요 하다 그래서 빠르게 진화 하고있다.
이러한 프로토콜은 박테리아와 archaea, 버섯 하지 공부에 합니다. 확대를 위한 다른 프라이 머를 사용 하 여 동일한 DNA 샘플27,28를 사용 하 여 곰 팡이 사회의 연구에 대 한 허용할 것 이다. 이러한 메서드는 방법 단순화 될 수 있기 때문에 대량의 장비 구매를 필요 하지 않습니다. 우리가 설명 하는 방법 “누구 가”, 결정 하는 데 주로 운항 하지만 필드의 기능을 테스트 및 샷건 시퀀싱 방법, 격리를 사용 하 여 해결 될 수 있는 함수에 대 한 중요 한 질문에 신속 하 게 진화 하 고 미생물, 또는 시퀀싱 전체 미생물 게놈입니다.
대표 결과 설명 된 방법을 사용 하 여 식별 될 수 있는 미생물 지역 사회에서 차이 강조 표시 합니다. 데이터 분석22에 베타-다양성 방식을 사용 하 여, 작곡 차이 샘플 종류 사이 표시 했다. 이러한 차이 명확 하 게 endosphere, rhizosphere, 및 토양 고유의 미생물 커뮤니티3을 포함 대부분의 다른 연구에서 관찰 되었습니다. Shannon 다양성 지 풍부 하 고 있는 각 식물 종에서 endosphere, rhizosphere, 및 토양 미생물 종의 균일성을 결정 하기 위해 계산 되었다. 이 연구 및 많은 다른 사람에서 같이, 알파 다양성은 토양는 rhizosphere에서 약간 감소 하 고 endosphere3,,529에서 크게 감소 후에 가장 많습니다. 이러한 결과 여기에 설명 된 메서드는 endosphere, rhizosphere, 및 토양에서 구성 변경 내용을 식별 하는 데 적합 한 나타냅니다.
Proteobacteria 의 지배력은 endosphere 및 토양30,,3132에 대 한 연구에서 일반적인 찾아내는 이다. Endosphere는 일반적으로 Proteobacteria의 더 높은 관계 되는 풍부를 가진 낮은 미생물 종의 다양성이 있다. 이 다시 여기 결과 문학에 있는 다른 발견의 대표는 강조 한다. 이 연구에서 치료 효과가 크게 다른 되었고 그에 대 한 두 가지 주요 이유는 치료에 의해 부과 된 차이 감지에 충분 한 변화를 생성 하기에 충분 되지 않은 고이 샘플링 했다의 끝에 있을 수 있습니다는 성장 계절 때 필드 비슷한 수준으로는 무슨 절 기의 끝에 측정 했다 질소 내려 그릴 충분 한 시간을 했다 수 있습니다. 또 다른 연구에서 시간의 긴 기간 동안 비슷한 수정 속도 사용 하 여, 단지 상대적으로 작은 변화는 미생물의 구성에 측정된33했다. 다른 연구 질소 비료34,35인해 곰 팡이 및 세균 지역 사회에서 변화를 보여왔다.
식물 종의 그들의 microbiomes3,,3236 결정에 역할을 알려지고 미생물 지역 사회 변화에도 작은 차이에서 다른 식물 genotypes 사이 입증 되었습니다가 단일 종37 본이 연구에서는 미생물 지역 사회 구성에 상당한 차이 식물 종 사이 발견 되었다. 모든 샘플 종류에 그것은 switchgrass 가장 뚜렷한 미생물 구성 했지만 종 간의 차이 endosphere에 통계적만 했다 나타났다. Rhizosphere 커뮤니티 구성 수 있습니다 더 많은 복제 분석에 사용할 수 있는 경우 중요 한 되고있다.
결합 된 필드, 실험실, 및 여기에서 설명 하는 분석 프로토콜, rhizosphere, 토양과 뿌리36의 endosphere에 미생물 커뮤니티의 구성 어떻게 다른 요인 영향 공부에 대 한 강력한 방법을 제공 합니다. 많은 농업 분야에서 특히 microbiomes의 지역에서 해야 할 일이 있다. 수익률 토양 미생물에 의해 변경 되는 방법에 대 한 중요 한 질문은 아직 완전히 해명 하. 자르기 회전 영향 토양 미생물, 타이밍은 미생물을 변경 하는 방법, 어떻게 비 생물 적인 긴장을 어떻게에 관한 가장 기본적인 질문에도 미생물, 변경 여부 및 토양 유형에 미생물을 변경할 이러한 요소와 상호 작용 하는 방법 특정 작물 및 미국 지역에서 보편적인 미생물 모든 관련 질문은. 이러한 방법은 존재 및 병원 성 및 유익한 박테리아의 지 속성을 식별 하기 위해 역학 연구도 유용할 것 이다. 이러한 방법에 대 한 또 다른 미래 지평선 DNA 방법 여기에 설명 된 식물 및 미생물 RNA 대사 산물 데이터 통합을 시작 하는 것입니다. 추가 개선 및 더 많은 변수 테스트 추가 이러한 프로토콜의 최적화를 위해 중요할 것 이다.
The authors have nothing to disclose.
이 원고를의 개발은 국립 과학 재단 EPSCoR 센터 루트 및 Rhizobiome 혁신 상을 OIA-1557417에 지원 됩니다. 데이터 수집 네브래스카 링컨의 대학, 농업 연구 및 개발에서 자금 및 농 무부에서 해치 교부 금에 의해 지원 되었다. 우리는 또한 미국 농 무부-ARS에서 지원 인정 하 고 지원 설정 및 이러한 필드를 관리 하는 미국 농 무부 식품 및 농업에서 농업과 음식 연구 사업 경쟁 보조금 번호 2011-68005-30411에 의해 제공 되었다.
Dneasy PowerSoil HTP 96 Kit | Qiagen/MoBio | 12955-4 | Extraction kit for soil and rhizosphere |
Dneasy PowerPlant HTP 96 Kit | Qiagen/MoBio | 13496-4 | Extraction kit for roots |
D-Handle Digging shovel, 101 cm L | Fiskars | 9669 | |
Rapid Tiller, 40 cm L | Truper | 34316 | |
Ziploc Bags, 17.7 cm x 19.5 cm | Ziploc | NA | |
Cooler | Any | NA | |
Wash pan | Any | NA | |
Plastic bucket | Any | NA | |
Gloves (work and lab) | Any | NA | |
20 cm diameter Soil sieve #8, 2360 μm mesh size | Dual Manufacturing Co., Chicago IL | US8-8FS | |
20 cm diameter Soil Sieve #4, 4750 μm mesh size | Dual Manufacturing Co., Chicago IL | US8-4FS | |
portable generator | Honda brand works well | NA | |
Sterile cell strainers 100 μm mesh size | Fisher Scientific | 22-363-549 | |
NaH2PO4·H2O | VWR | 0823 | |
Na2HPO4 | VWR | 0404 | |
Silwet L-77 | Lehman Seeds | VIS-30 | Surfactant |
Autoclaves | Any | NA | |
Drying Oven | Any | NA | |
Scale | Any | Any | |
Bleach | CLOROX – household strength | NA | |
Tween 20 | Any | NA | |
Liquid Nitrogen | Any | NA | |
Dry Ice pellets | Any | NA | |
Ethanol | Any | NA | |
11 cm precision fine point tweezers | Fisher | 17456209 | |
18 cm Straight point specimen forceps | VWR | 82027-436 | |
13.5 cm Pruning Scissors | Fiskars | 9921 | |
2 mL tube | Any | NA | |
15 mL PP conical tube | MIDSCI | C15B | |
50 mL PP conical tube | MIDSCI | C50B | |
Ultrapure water | Millipore-sigma | Milli-Q Integral, Q-POD | |
Qubit 2.0 fluorometer | Invitrogen | Q32866 | |
Qubit dsDNA HS Assay Kit | Invitrogen | Q32854 | For DNA quantification of removed samples |
QuantiFluor dsDNA System | Promega | E2670 | For DNA quantification |
96-Well Black with Clear Flat Bottom Plates | Corning | 3631 | |
pPNA PCR Blocker | PNA Bio | PP01-50 | |
mPNA PCR Blocker | PNA Bio | MP01-50 | |
Genomic DNA from Microbial Mock Community B (Even Low Concentration) v5.1L, for 16s rRNA Gene sequencing | BEI Resources | HM782D | |
Adhesive 8 well-strips for plates | VWR | 89134-434 | |
Stainless steel beads, 3.2 mm dia | Next Advance | SSB32 | |
1 ml Assay block (DNA extraction plate for the Qiagen/MoBio Dneasy PowerPlant HTP Kit) | CoStar | 3959 | |
antistatic PP weighing funnel, size small for soil/rhizosphere | TWD Tradewinds, INC | ASWF1SPK | |
antistatic PP weighing funnel, size x-small for root/leaf | TWD Tradewinds, INC | ASWFXSCS | |
Genie 2 Digital Vortex | Scientific Industries | SI-0236 | |
Vortex adapter for 50 mL tubes | Scientific Industries | SI-H506 | |
Mortar (100 mL) and pestle | Any | NA | |
Metal micro-spatula | VWR | 80071-672 | |
Disposable antistatic microspatulas | VWR | 231-0106 | |
Brown Paper bag 2# (10.95 cm x 6.19 cm x 20 cm) | Duro | 18402 | |
5424 Centrifuge for 2 mL tube | Eppendorf | 22620461 | |
Centrifuge for 96-well plate | Sigma4-16S | 81510 | |
Centrifuge rotor for 50 mL tubes | Sigma4-16S | 12269 – Biosafe | |
KAPA HiFi DNA polymerase | Kapa Biosystems |