endosphere, rhizosphere, और मृदा में नमूनों के प्रसंस्करण के साथ ही क्षेत्र से संयंत्र जड़ों की खुदाई डीएनए निष्कर्षण और डेटा विश्लेषण विधियों सहित विस्तार से वर्णित हैं । यह कागज अन्य प्रयोगशालाओं को मृदा, endosphere, और rhizosphere microbiomes के अध्ययन के लिए इन तकनीकों का उपयोग करने के लिए सक्षम बनाया गया है ।
संयंत्र और मृदा microbiome अध्ययन भूमिकाओं को समझने के लिए तेजी से महत्वपूर्ण होते जा रहे हैं सूक्ष्मजीवों कृषि उत्पादकता में खेलते हैं । इस पांडुलिपि का उद्देश्य कैसे तेजी से नमूना मिट्टी, rhizosphere, और दोहराया क्षेत्र परीक्षणों के endosphere और नमूना प्रकार, उपचार, और संयंत्र जीनोटाइप के कारण माइक्रोबियल समुदायों में हो सकता है कि परिवर्तन का विश्लेषण करने पर विस्तार प्रदान करने के लिए है । इन तरीकों को प्रदर्शित करने के लिए प्रयोग किया जाता प्रयोग दोहराया क्षेत्र दो, शुद्ध, गर्म मौसम घास (Panicum virgatum और Andropogon gerardii) और एक कम विविधता घास मिश्रण (ए. gerardii, Sorghastrum युक्त भूखंडों के होते हैं nutans, और Bouteloua curtipendula)। संक्षेप में, पौधों की खुदाई कर रहे हैं, जड़ों की एक किस्म काट रहे हैं और फॉस्फेट बफर में रखा, और फिर rhizosphere इकट्ठा करने के लिए हिल. जड़ें ब्लीच और इथेनॉल (ेतोः) के साथ निष्फल बर्फ और सतह पर प्रयोगशाला के लिए लाया जाता है । rhizosphere फ़िल्टर और केंद्रापसारक द्वारा केंद्रित है । जड़ गेंद चारों ओर से मिट्टी की खुदाई प्लास्टिक की थैलियों में रखा गया है और लैब जहां मिट्टी की एक छोटी राशि डीएनए निकालने के लिए लिया जाता है के लिए लाया । डीएनए जड़ों, मिट्टी, और rhizosphere से निकाला जाता है और फिर 16S rRNA जीन के V4 क्षेत्र के लिए प्राइमरों के साथ परिवर्धित । Amplicons अनुक्रम, तो खुला पहुंच bioinformatics उपकरण के साथ विश्लेषण कर रहे हैं । इन तरीकों शोधकर्ताओं का परीक्षण करने के लिए अनुमति कैसे माइक्रोबियल समुदाय विविधता और संरचना नमूना प्रकार, उपचार, और संयंत्र जीनोटाइप के कारण बदलता है । सांख्यिकीय मॉडल के साथ इन तरीकों का उपयोग करना, प्रतिनिधि परिणाम प्रदर्शित वहां जड़ों, rhizosphere, और मिट्टी के माइक्रोबियल समुदायों में महत्वपूर्ण मतभेद हैं । तरीकों यहां प्रस्तुत कैसे क्षेत्र के नमूनों को इकट्ठा करने के लिए कदम का पूरा सेट प्रदान करते हैं, को अलग, निकालने, यों, बढ़ाना, और अनुक्रम डीएनए, और सूक्ष्म जीवाणु समुदाय विविधता और प्रतिरूपित क्षेत्र परीक्षणों में संरचना का विश्लेषण ।
Microbiome अनुसंधान समझ और ऐसे पोषक तत्व सायक्लिंग, कार्बनिक पदार्थ कारोबार के रूप में पारिस्थितिकी तंत्र प्रक्रियाओं से छेड़छाड़ के लिए महत्वपूर्ण निहितार्थ है, और विकास या मिट्टी के निषेध1,2। अनुसंधान के इस क्षेत्र में भी प्राकृतिक संयंत्र समुदायों और agroecosystems की उत्पादकता पर मिट्टी रोगाणुओं के प्रभावों को समझने के लिए महान क्षमता रखती है । जबकि कई अध्ययनों कि प्राकृतिक पारिस्थितिकी प्रणालियों में मिट्टी microbiome पर ध्यान केंद्रित किया है, कम agroecosystems3में संयंत्र rhizosphere और endosphere रोगाणुओं पर ध्यान केंद्रित किया है । नेब्रास्का में, कृषि राज्य के बड़े हिस्सों में परिदृश्य पर हावी है, इन मिट्टी का अध्ययन कर जहां कृषि महत्वपूर्ण फसलों अनुसंधान के लिए एक महत्वपूर्ण विषय हो गए हैं । इस तरीके कागज के उद्देश्य के लिए प्रोटोकॉल का एक मानक सेट के साथ शोधकर्ताओं को प्रदान करने के लिए agroecosystems में मौजूद रोगाणुओं का वर्णन है, कैसे संयंत्र जड़ों rhizosphere और endosphere में माइक्रोबियल समुदायों को संशोधित करने के लिए, और अंततः कार्यों को समझें इन रोगाणुओं मिट्टी स्वास्थ्य और संयंत्र उत्पादकता में खेलते हैं ।
यहां प्रस्तुत विधि4दूसरों के द्वारा इस्तेमाल किया तरीकों से थोड़ा अलग है,5 कि इस पत्र में जो रोगाणुओं की जड़ के अंदर विशेष रूप से कर रहे है और कैसे वे रोगाणुओं से तुरंत में जड़ के बाहर से अलग है सीखने के उद्देश्य से है rhizosphere । इस अध्ययन में प्रयुक्त amplicon अनुक्रमण डीएनए नमूने में पाया माइक्रोबियल taxa की पहचान करता है और जांचकर्ताओं कैसे समुदायों नमूना प्रकार या उपचार के आधार पर बदल निर्धारित करने के लिए अनुमति देता है । इस प्रोटोकॉल और एक बहुत ही प्रोटोकॉल Lundberg एट अल द्वारा इस्तेमाल के बीच प्रमुख मतभेदों में से एक । 6 कि बजाय sonication के, इस प्रोटोकॉल ब्लीच और इथेनॉल के साथ सतह नसबंदी का उपयोग करता है जड़ों से rhizosphere को दूर । दूसरों को भी उपयोग किया है सतह नसबंदी प्रभावी ढंग से7,8,9,10. इन तरीकों को अंय तरीकों से अधिक लाभप्रद नहीं हैं, लेकिन थोड़ा अलग है । इन तरीकों को विशेष रूप से अच्छी तरह से बड़े क्षेत्र प्रयोगों के लिए अनुकूल है क्योंकि पर्याप्त लोगों के साथ यह १५० प्रति दिन क्षेत्र भूखंडों पर प्रक्रिया के लिए संभव है, जो लगभग ४५० नमूने जब endosphere, rhizosphere, और मिट्टी में विभाजित करने के लिए कहते हैं । इस पांडुलिपि विवरण में क्षेत्र में नमूना के लिए इस्तेमाल किया तरीकों का वर्णन, प्रयोगशाला में सामग्री की प्रक्रिया, निकालने और डीएनए अनुक्रम, और परिणामस्वरूप अनुक्रमण डेटा का विश्लेषण करने के लिए कदम का एक संक्षिप्त सिंहावलोकन प्रदान करता है.
इस पांडुलिपि में वर्णित विधियों को वैज्ञानिकों को मृदा और पादप metagenomics के क्षेत्र में आसानी से प्रवेश करने के लिए सक्षम बनाना चाहिए । इन वर्षों में, हम इस पांडुलिपि में वर्णित प्रयोग के आयोजन के बाद से हमारे तरीकों परिष्कृत किया है । एक परिवर्तन यह है कि हम अब पूर्व लेबल ट्यूबों क्षेत्र के लिए बाहर जाने के लिए नमूना से पहले । हमारी प्रयोगशाला एक barcoding प्रणाली और एक लेबल प्रिंटर का उपयोग करता है । लेबल प्रिंटर न केवल समय बचाता है जब लेबल ट्यूब, लेकिन यह भी सब कुछ आसान ट्रैक करने के लिए और सही ढंग से मानव हाथ लेखन के अनियमितता बिना नमूनों की पहचान करने के लिए बनाता है. एक और महत्वपूर्ण मुद्दा यह है कि हम इसे वापस लाने के बाद जितनी जल्दी हो सके क्षेत्र से सामग्री की प्रक्रिया की कोशिश करो । हम डीएनए विश्लेषण के लिए इस्तेमाल मिट्टी फ्रीज, बंध्याकरण और जड़ों फ्रीज, और फिल्टर और 12 से ३६ घंटे के भीतर rhizosphere फ्रीज मैदान से लौटने के बाद उद्देश्य । डीएनए निष्कर्षण प्रक्रियाओं विशेष रूप से मिट्टी और rhizosphere के लिए कई कदम, के साथ लंबे होते हैं, तो हम एक रोबोट खरीदा (किंगफिशर फ्लेक्स, ThermoFisher) कि डीएनए निष्कर्षण प्रोटोकॉल के लिए समय पर हाथ कम कर देता है, मानव त्रुटि है कि पेश किया जा सकता है कम हो जाती है, और मिट्टी, जड़ों, या rhizosphere के विभिंन बैचों तरीके में स्थिरता में सुधार संसाधित कर रहे हैं । जब संयंत्र सामग्री के साथ काम करने के लिए रूट प्रकार पर फैसला करने के लिए अध्ययन किया जा करने के लिए या जड़ प्रकार की एक किस्म लेने के लिए एक “प्रतिनिधि नमूना प्राप्त करने के लिए महत्वपूर्ण है.” जड़ों और एक जमे हुए राज्य में पत्तियों को बनाए रखने जब डीएनए निकालने का आयोजन महत्वपूर्ण है, के रूप में सुनिश्चित करना है वहां कोई पार के नमूनों के बीच संदूषण जब ९६-अच्छी तरह से डीएनए निष्कर्षण प्लेटें भरना है । एक अंय महत्वपूर्ण कारक पर विचार करने के लिए इस्तेमाल किया जा दोहराने की संख्या है जब क्षेत्र प्रयोगों डिजाइनिंग और एक पूरी यादृच्छिक डिजाइन का उपयोग कर जहां संभव26। उच्च क्षेत्र परिवर्तनशीलता के कारण यह छोटे मतभेदों का पता लगाने के लिए दोहराने की एक बड़ी संख्या है करने के लिए आवश्यक हो सकता है । अंत में, हमारे अनुभव से यह सुनिश्चित करने के लिए मिट्टी भी गीला नहीं कर रहे है जब जड़ों खुदाई आवश्यक है । मिट्टी पानी के साथ संतृप्त कर रहे हैं, तो यह न केवल गन्दा के साथ काम करने के लिए है, लेकिन यह भी rhizosphere को परिभाषित करने के लिए और जड़ों से मिट्टी हटाने के लिए बहुत मुश्किल है ।
एक संशोधन है कि जल्दी पर इन तरीकों के विकास के दौरान किया गया था बजाय हाथ से ट्यूबों मिलाते हुए rhizosphere हम एक गैस जनरेटर के द्वारा संचालित करने के लिए काम आसान क्षेत्र में और अधिक मानकीकृत के मामले में बनाने के लिए उंनयन जारी समय और तरीके कि प्रत्येक ट्यूब उत्तेजित हो गया था । amplicon अनुक्रमण दृष्टिकोण की एक सीमा है कि वर्गीकरण के परिणामों के समाधान अक्सर सीमित है और कई OTUs अज्ञात है या केवल परिवार या जीनस स्तर पर जाना जाता है । अनुसंधान का यह क्षेत्र तेजी से विकसित हो रहा है इसलिए नए और विकासशील दृष्टिकोणों के बारे में जानकारी होना जरूरी है, विशेषकर उन आंकड़ों के विश्लेषण के लिए जो परिणामों के समाधान को बढ़ा सकते हैं ।
इन प्रोटोकॉल केवल बैक्टीरिया और archaea, कवक नहीं अध्ययन करने के लिए कर रहे हैं । प्रवर्धन के लिए अलग प्राइमरों के उपयोग कवक समुदायों के अध्ययन के लिए एक ही डीएनए नमूने का उपयोग कर के लिए अनुमति देगा27,28। इन विधियों में से बड़ी मात्रा में उपकरणों की खरीद की आवश्यकता नहीं है क्योंकि विधियों को सरलीकृत किया जा सकता है । तरीकों हम यहां का वर्णन का निर्धारण “जो वहां है” के लिए मुख्य रूप से कर रहे हैं, लेकिन क्षेत्र जल्दी से समारोह के बारे में महत्वपूर्ण सवाल है, जो शॉटगन अनुक्रमण विधियों, अलगाव और परीक्षण की कार्यक्षमता का उपयोग करके संबोधित किया जा सकता है में विकसित हो रहा है रोगाणुओं, या अनुक्रमण पूरे माइक्रोबियल जीनोम ।
प्रतिनिधि परिणाम माइक्रोबियल समुदायों कि वर्णित तरीकों का उपयोग कर पहचाना जा सकता है में मतभेद पर प्रकाश डाला । डेटा विश्लेषण के लिए एक बीटा-विविधता दृष्टिकोण का उपयोग करना22, नमूना प्रकार के बीच संरचना अंतर दिखाया गया. ये अंतर स्पष्ट रूप से सबसे अंय अध्ययनों में देखा गया है, जहां endosphere, rhizosphere, और मिट्टी अद्वितीय माइक्रोबियल समुदायों3होते हैं । शैनन विविधता सूचकांक endosphere, rhizosphere, और मिट्टी में प्रत्येक संयंत्र प्रजातियों के भीतर मौजूद माइक्रोबियल प्रजातियों की बहुतायत और यहां तक कि निर्धारित करने के लिए गणना की गई थी । के रूप में इस अध्ययन में दिखाया गया है और कई अंय लोगों में, अल्फा विविधता मिट्टी में सबसे अधिक है, rhizosphere में थोड़ा कम है और फिर endosphere3,5,29में काफी कम । इन परिणामों से संकेत मिलता है कि यहां वर्णित विधियों endosphere, rhizosphere, और मिट्टी में संरचना परिवर्तन की पहचान के लिए उपयुक्त हैं ।
Proteobacteria के प्रभुत्व endosphere और मिट्टी30,31,३२पर अध्ययन में एक आम खोज है । Endosphere आम तौर पर Proteobacteriaके एक उच्च सापेक्ष बहुतायत के साथ माइक्रोबियल प्रजातियों में से एक कम विविधता है । यह फिर से प्रकाश डाला गया है कि परिणाम यहां साहित्य में अंय निष्कर्षों के प्रतिनिधि हैं । इस अध्ययन में उपचार प्रभाव काफी अलग नहीं थे और इसके लिए दो प्रमुख कारण हो सकते हैं कि उपचार द्वारा लगाए गए मतभेदों को पर्याप्त विविधता का पता लगाने के लिए उत्पन्न करने के लिए पर्याप्त नहीं थे और यह नमूना के अंत में किया गया था कि मौसम बढ़ रहा है, जब खेतों पर्याप्त समय के लिए नीचे समान स्तर है, जो है जो मौसम के अंत में मापा गया था नाइट्रोजन आकर्षित किया है हो सकता है । एक अंय अध्ययन में समय की एक लंबी अवधि में इसी तरह के निषेचन की दर का उपयोग कर, microbiome की संरचना में केवल अपेक्षाकृत छोटे परिवर्तन३३मापा गया । अन्य अध्ययनों में नाइट्रोजन उर्वरक३४,३५के कारण कवक और जीवाणु दोनों समुदायों में परिवर्तन दिखाई दिया है ।
संयंत्र प्रजातियों उनके microbiomes3,३२,३६ और माइक्रोबियल समुदाय भिंनता में भी छोटे मतभेदों के निर्धारण में भूमिका निभाने के लिए जाना जाता है एक के भीतर विभिंन संयंत्र पादी के बीच प्रदर्शन किया गया है एकल प्रजातियों३७। इस अध्ययन में, माइक्रोबियल समुदाय संरचना में एक महत्वपूर्ण अंतर संयंत्र प्रजातियों के बीच पाया गया था । सभी नमूना प्रकार में यह है कि switchgrass सबसे अलग माइक्रोबियल संरचना था दिखाई दिया, लेकिन प्रजातियों के बीच अंतर केवल endosphere में सांख्यिकीय महत्वपूर्ण थे । Rhizosphere समुदाय संरचना महत्वपूर्ण हो सकता है यदि अधिक प्रतिकृति विश्लेषण के लिए उपलब्ध थे ।
संयुक्त क्षेत्र, प्रयोगशाला, और विश्लेषणात्मक प्रोटोकॉल यहां वर्णित कैसे विभिंन कारकों का अध्ययन करने के लिए एक शक्तिशाली विधि प्रदान मिट्टी, rhizosphere, और३६जड़ों के endosphere में माइक्रोबियल समुदायों की संरचना को प्रभावित करते हैं । विशेष रूप से कृषि क्षेत्रों में अध्ययन microbiomes के क्षेत्र में किया जाना काम का एक बड़ा सौदा है । कैसे पैदावार मिट्टी microbiome द्वारा बदल रहे है के बारे में महत्वपूर्ण सवाल अभी तक पूरी तरह से आविर्भाव हो । यहां तक कि सबसे बुनियादी सवालों के बारे में कैसे फसल rotations मिट्टी microbiome, कैसे समय बदल microbiome, कैसे अजैव तनाव microbiome बदल, कैसे मिट्टी के प्रकार इन कारकों के साथ सूचना का आदान प्रदान microbiome बदलने के लिए, और क्या वहां है कुछ फसलों या संयुक्त राज्य अमेरिका के क्षेत्रों में सार्वभौमिक रोगाणुओं सभी खुले सवाल कर रहे हैं । इन पद्धतियों की उपस्थिति और रोगजनक और लाभकारी बैक्टीरिया की दृढ़ता की पहचान करने के लिए महामारी विज्ञान के अध्ययन के लिए भी उपयोगी होगा । इन तरीकों के लिए एक और भविष्य के क्षितिज डीएनए संयंत्र और सूक्ष्म जीव आरएनए और metabolite डेटा के साथ यहां वर्णित तरीकों का घालमेल शुरू हो जाएगा । अतिरिक्त सुधार और अधिक चर के परीक्षण इन प्रोटोकॉल के आगे अनुकूलन के लिए महत्वपूर्ण हो जाएगा ।
The authors have nothing to disclose.
इस पांडुलिपि के विकास को नेशनल साइंस फाउंडेशन EPSCoR सेंटर फॉर रूट एंड Rhizobiome इनोवेशन अवार्ड OIA-१५५७४१७ ने समर्थन दिया है । डेटा संग्रह नेब्रास्का के विश्वविद्यालय से धन लिंकन, कृषि अनुसंधान और विकास और USDA से एक हैच अनुदान द्वारा समर्थित किया गया था । हम भी usda-ARS से समर्थन स्वीकार करते है और समर्थन कृषि और खाद्य अनुसंधान पहल प्रतिस्पर्धात्मक खाद्य और कृषि के USDA राष्ट्रीय संस्थान से अनुदान no 2011-68005-30411 द्वारा प्रदान की गई थी स्थापित करने और इन क्षेत्रों का प्रबंधन ।
Dneasy PowerSoil HTP 96 Kit | Qiagen/MoBio | 12955-4 | Extraction kit for soil and rhizosphere |
Dneasy PowerPlant HTP 96 Kit | Qiagen/MoBio | 13496-4 | Extraction kit for roots |
D-Handle Digging shovel, 101 cm L | Fiskars | 9669 | |
Rapid Tiller, 40 cm L | Truper | 34316 | |
Ziploc Bags, 17.7 cm x 19.5 cm | Ziploc | NA | |
Cooler | Any | NA | |
Wash pan | Any | NA | |
Plastic bucket | Any | NA | |
Gloves (work and lab) | Any | NA | |
20 cm diameter Soil sieve #8, 2360 μm mesh size | Dual Manufacturing Co., Chicago IL | US8-8FS | |
20 cm diameter Soil Sieve #4, 4750 μm mesh size | Dual Manufacturing Co., Chicago IL | US8-4FS | |
portable generator | Honda brand works well | NA | |
Sterile cell strainers 100 μm mesh size | Fisher Scientific | 22-363-549 | |
NaH2PO4·H2O | VWR | 0823 | |
Na2HPO4 | VWR | 0404 | |
Silwet L-77 | Lehman Seeds | VIS-30 | Surfactant |
Autoclaves | Any | NA | |
Drying Oven | Any | NA | |
Scale | Any | Any | |
Bleach | CLOROX – household strength | NA | |
Tween 20 | Any | NA | |
Liquid Nitrogen | Any | NA | |
Dry Ice pellets | Any | NA | |
Ethanol | Any | NA | |
11 cm precision fine point tweezers | Fisher | 17456209 | |
18 cm Straight point specimen forceps | VWR | 82027-436 | |
13.5 cm Pruning Scissors | Fiskars | 9921 | |
2 mL tube | Any | NA | |
15 mL PP conical tube | MIDSCI | C15B | |
50 mL PP conical tube | MIDSCI | C50B | |
Ultrapure water | Millipore-sigma | Milli-Q Integral, Q-POD | |
Qubit 2.0 fluorometer | Invitrogen | Q32866 | |
Qubit dsDNA HS Assay Kit | Invitrogen | Q32854 | For DNA quantification of removed samples |
QuantiFluor dsDNA System | Promega | E2670 | For DNA quantification |
96-Well Black with Clear Flat Bottom Plates | Corning | 3631 | |
pPNA PCR Blocker | PNA Bio | PP01-50 | |
mPNA PCR Blocker | PNA Bio | MP01-50 | |
Genomic DNA from Microbial Mock Community B (Even Low Concentration) v5.1L, for 16s rRNA Gene sequencing | BEI Resources | HM782D | |
Adhesive 8 well-strips for plates | VWR | 89134-434 | |
Stainless steel beads, 3.2 mm dia | Next Advance | SSB32 | |
1 ml Assay block (DNA extraction plate for the Qiagen/MoBio Dneasy PowerPlant HTP Kit) | CoStar | 3959 | |
antistatic PP weighing funnel, size small for soil/rhizosphere | TWD Tradewinds, INC | ASWF1SPK | |
antistatic PP weighing funnel, size x-small for root/leaf | TWD Tradewinds, INC | ASWFXSCS | |
Genie 2 Digital Vortex | Scientific Industries | SI-0236 | |
Vortex adapter for 50 mL tubes | Scientific Industries | SI-H506 | |
Mortar (100 mL) and pestle | Any | NA | |
Metal micro-spatula | VWR | 80071-672 | |
Disposable antistatic microspatulas | VWR | 231-0106 | |
Brown Paper bag 2# (10.95 cm x 6.19 cm x 20 cm) | Duro | 18402 | |
5424 Centrifuge for 2 mL tube | Eppendorf | 22620461 | |
Centrifuge for 96-well plate | Sigma4-16S | 81510 | |
Centrifuge rotor for 50 mL tubes | Sigma4-16S | 12269 – Biosafe | |
KAPA HiFi DNA polymerase | Kapa Biosystems |