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अलगाव और मिट्टी, Rhizosphere, और जड़ों में बारहमासी घास प्रयोगों में माइक्रोबियल समुदायों के विश्लेषण

doi: 10.3791/57932 Published: July 24, 2018

Summary

endosphere, rhizosphere, और मृदा में नमूनों के प्रसंस्करण के साथ ही क्षेत्र से संयंत्र जड़ों की खुदाई डीएनए निष्कर्षण और डेटा विश्लेषण विधियों सहित विस्तार से वर्णित हैं । यह कागज अन्य प्रयोगशालाओं को मृदा, endosphere, और rhizosphere microbiomes के अध्ययन के लिए इन तकनीकों का उपयोग करने के लिए सक्षम बनाया गया है ।

Abstract

संयंत्र और मृदा microbiome अध्ययन भूमिकाओं को समझने के लिए तेजी से महत्वपूर्ण होते जा रहे हैं सूक्ष्मजीवों कृषि उत्पादकता में खेलते हैं । इस पांडुलिपि का उद्देश्य कैसे तेजी से नमूना मिट्टी, rhizosphere, और दोहराया क्षेत्र परीक्षणों के endosphere और नमूना प्रकार, उपचार, और संयंत्र जीनोटाइप के कारण माइक्रोबियल समुदायों में हो सकता है कि परिवर्तन का विश्लेषण करने पर विस्तार प्रदान करने के लिए है । इन तरीकों को प्रदर्शित करने के लिए प्रयोग किया जाता प्रयोग दोहराया क्षेत्र दो, शुद्ध, गर्म मौसम घास (Panicum virgatum और Andropogon gerardii) और एक कम विविधता घास मिश्रण (ए. gerardii, Sorghastrum युक्त भूखंडों के होते हैं nutans, और Bouteloua curtipendula)। संक्षेप में, पौधों की खुदाई कर रहे हैं, जड़ों की एक किस्म काट रहे हैं और फॉस्फेट बफर में रखा, और फिर rhizosphere इकट्ठा करने के लिए हिल. जड़ें ब्लीच और इथेनॉल (ेतोः) के साथ निष्फल बर्फ और सतह पर प्रयोगशाला के लिए लाया जाता है । rhizosphere फ़िल्टर और केंद्रापसारक द्वारा केंद्रित है । जड़ गेंद चारों ओर से मिट्टी की खुदाई प्लास्टिक की थैलियों में रखा गया है और लैब जहां मिट्टी की एक छोटी राशि डीएनए निकालने के लिए लिया जाता है के लिए लाया । डीएनए जड़ों, मिट्टी, और rhizosphere से निकाला जाता है और फिर 16S rRNA जीन के V4 क्षेत्र के लिए प्राइमरों के साथ परिवर्धित । Amplicons अनुक्रम, तो खुला पहुंच bioinformatics उपकरण के साथ विश्लेषण कर रहे हैं । इन तरीकों शोधकर्ताओं का परीक्षण करने के लिए अनुमति कैसे माइक्रोबियल समुदाय विविधता और संरचना नमूना प्रकार, उपचार, और संयंत्र जीनोटाइप के कारण बदलता है । सांख्यिकीय मॉडल के साथ इन तरीकों का उपयोग करना, प्रतिनिधि परिणाम प्रदर्शित वहां जड़ों, rhizosphere, और मिट्टी के माइक्रोबियल समुदायों में महत्वपूर्ण मतभेद हैं । तरीकों यहां प्रस्तुत कैसे क्षेत्र के नमूनों को इकट्ठा करने के लिए कदम का पूरा सेट प्रदान करते हैं, को अलग, निकालने, यों, बढ़ाना, और अनुक्रम डीएनए, और सूक्ष्म जीवाणु समुदाय विविधता और प्रतिरूपित क्षेत्र परीक्षणों में संरचना का विश्लेषण ।

Introduction

Microbiome अनुसंधान समझ और ऐसे पोषक तत्व सायक्लिंग, कार्बनिक पदार्थ कारोबार के रूप में पारिस्थितिकी तंत्र प्रक्रियाओं से छेड़छाड़ के लिए महत्वपूर्ण निहितार्थ है, और विकास या मिट्टी के निषेध1,2। अनुसंधान के इस क्षेत्र में भी प्राकृतिक संयंत्र समुदायों और agroecosystems की उत्पादकता पर मिट्टी रोगाणुओं के प्रभावों को समझने के लिए महान क्षमता रखती है । जबकि कई अध्ययनों कि प्राकृतिक पारिस्थितिकी प्रणालियों में मिट्टी microbiome पर ध्यान केंद्रित किया है, कम agroecosystems3में संयंत्र rhizosphere और endosphere रोगाणुओं पर ध्यान केंद्रित किया है । नेब्रास्का में, कृषि राज्य के बड़े हिस्सों में परिदृश्य पर हावी है, इन मिट्टी का अध्ययन कर जहां कृषि महत्वपूर्ण फसलों अनुसंधान के लिए एक महत्वपूर्ण विषय हो गए हैं । इस तरीके कागज के उद्देश्य के लिए प्रोटोकॉल का एक मानक सेट के साथ शोधकर्ताओं को प्रदान करने के लिए agroecosystems में मौजूद रोगाणुओं का वर्णन है, कैसे संयंत्र जड़ों rhizosphere और endosphere में माइक्रोबियल समुदायों को संशोधित करने के लिए, और अंततः कार्यों को समझें इन रोगाणुओं मिट्टी स्वास्थ्य और संयंत्र उत्पादकता में खेलते हैं ।

यहां प्रस्तुत विधि4दूसरों के द्वारा इस्तेमाल किया तरीकों से थोड़ा अलग है,5 कि इस पत्र में जो रोगाणुओं की जड़ के अंदर विशेष रूप से कर रहे है और कैसे वे रोगाणुओं से तुरंत में जड़ के बाहर से अलग है सीखने के उद्देश्य से है rhizosphere । इस अध्ययन में प्रयुक्त amplicon अनुक्रमण डीएनए नमूने में पाया माइक्रोबियल taxa की पहचान करता है और जांचकर्ताओं कैसे समुदायों नमूना प्रकार या उपचार के आधार पर बदल निर्धारित करने के लिए अनुमति देता है । इस प्रोटोकॉल और एक बहुत ही प्रोटोकॉल Lundberg एट अल द्वारा इस्तेमाल के बीच प्रमुख मतभेदों में से एक । 6 कि बजाय sonication के, इस प्रोटोकॉल ब्लीच और इथेनॉल के साथ सतह नसबंदी का उपयोग करता है जड़ों से rhizosphere को दूर । दूसरों को भी उपयोग किया है सतह नसबंदी प्रभावी ढंग से7,8,9,10. इन तरीकों को अंय तरीकों से अधिक लाभप्रद नहीं हैं, लेकिन थोड़ा अलग है । इन तरीकों को विशेष रूप से अच्छी तरह से बड़े क्षेत्र प्रयोगों के लिए अनुकूल है क्योंकि पर्याप्त लोगों के साथ यह १५० प्रति दिन क्षेत्र भूखंडों पर प्रक्रिया के लिए संभव है, जो लगभग ४५० नमूने जब endosphere, rhizosphere, और मिट्टी में विभाजित करने के लिए कहते हैं । इस पांडुलिपि विवरण में क्षेत्र में नमूना के लिए इस्तेमाल किया तरीकों का वर्णन, प्रयोगशाला में सामग्री की प्रक्रिया, निकालने और डीएनए अनुक्रम, और परिणामस्वरूप अनुक्रमण डेटा का विश्लेषण करने के लिए कदम का एक संक्षिप्त सिंहावलोकन प्रदान करता है.

Protocol

1. फ़ील्ड साइट वर्णन

  1. संग्रह अवधियों के दौरान प्रायोगिक फ़ील्ड साइटों का वर्णन करें । GPS का उपयोग करके फ़ील्ड (अक्षांश, देशांतर और ऊंचाई) का स्थान निर्धारित करें.
  2. नमूना गहराई, नमूना समय, और मिट्टी की बनावट का वर्णन करें ।
  3. पर्यावरणीय कारकों माइक्रोबियल समुदायों को आकार देने में महत्वपूर्ण भूमिका निभाते हैं । रिकॉर्ड जलवायु जानकारी जैसे वार्षिक माध्य तापमान, वार्षिक वर्षा, पूर्व वर्षों की फसल रोटेशन, जुताई प्रथाओं, निषेचन की विधि, और क्षेत्र स्थल का इतिहास । स्वचालित मौसम स्टेशनों या अन्य उपकरणों के लिए दैनिक वर्षा और तापमान एक बढ़ते मौसम पर रिकॉर्ड करने के लिए उपयोगी होते हैं ।

2. संग्रह और मिट्टी, Rhizosphere, और रूट क्षेत्र के नमूनों का प्रसंस्करण

  1. पौधों की खुदाई ।
    1. नमूना के लिए संयंत्र सामग्री के बारे में जानकारी युक्त एक स्टिकी नोट के साथ एक धोने पैन और बाल्टी लेबल. प्लॉट नंबर, प्लांट जीनोटाइप, और पादप प्रजातियों जैसी जानकारी शामिल करें । प्लॉट करने के लिए लेबल बाल्टी ले और मैदान में स्थापित कार्य केंद्र पर पीछे धोने पैन छोड़ दें ।
    2. पियर्स मिट्टी 30 सेमी की गहराई करने के लिए एक फावड़ा के साथ मिट्टी में संयंत्र पकड़ पार्श्व जड़ों के किसी भी कटौती करने के लिए । अनुमानित मात्रा 18 सेमी3है । बेतरतीब ढंग से चुनें और साजिश के भीतर विभिन्न क्षेत्रों से प्रति भूखंड दो पौधों को इकट्ठा ।
    3. फावड़ा लाभ और लेबल बाल्टी में जड़ गेंद जगह द्वारा संयंत्र जड़ों राजमहल । क्षेत्र में कार्य केंद्र के लिए वापस खुदाई रूट गेंद के साथ लेबल बाल्टी लाओ । काट और aboveground संयंत्र बायोमास त्यागें ।
  2. मिट्टी की जड़ों और थोक मिट्टी के संग्रह से हटाने ।
    1. जड़ों को मैन्युअल रूप से मिट्टी हटाने या एक कुदाल या एक हाथ का उपयोग करने के लिए जड़ों से मिट्टी को हटाने के लिए हिलाओ । जड़ें मिलाना बहुत रेतीले मिट्टी में मिट्टी हटाने के लिए पर्याप्त है । प्रसंस्करण स्टेशन के पास दस्ताने और जगह जड़ें पहनें ।
    2. जड़ों को मिलाने के बाद मिट्टी के थोक भाव को धोकर पैन में रखेंगे । धोकर पैन में मिट्टी मिलाएं और एक हाथ से आयोजित टिलर के साथ किसी भी मिट्टी clods तोड़ । मिट्टी का एक नमूना है कि एक लेबल, १७.७ x १९.५ सेमी ज़िप भंडारण बैग और एक ठंडी जगह में या बर्फ पर जगह में मलबे से मुक्त है प्लेस ।
  3. जड़ों और rhizosphere का संग्रह ।
    1. छंटाई कैंची का प्रयोग ७०% ेतोः में निष्फल, उत्पाद शुल्क जड़ों की एक किस्म, लगभग 4 से 6 प्रति पौधे और लंबाई में 9-12 सेमी के आसपास प्रत्येक रूट । एक लेबल ५० एमएल ट्यूब में autoclaved के ३५ मिलीलीटर, फॉस्फेट बफर (६.३३ g/l णः2पीओ4, ८.५ g/l Na2HPO4 निर्जल, pH = ६.५, २०० µ l/l surfactant) युक्त (फिट करने के लिए आवश्यक के रूप में काटने की जरूरत के रूप में काटना) ।
      नोट: surfactant ( सामग्री की तालिकादेखें) फॉस्फेट बफर autoclaving के बाद जोड़ा गया था. जड़ गेंद और जड़ लंबाई की मात्रा संयंत्र उंर और प्रजातियों के पौधे के आधार पर बदलती हैं ।
    2. 2 मिनट के लिए शेक ट्यूबों जड़ों की सतह से rhizosphere जारी करने के लिए । संदंश ७०% ेतोः में निष्फल के साथ, ट्यूब से जड़ों को हटाने, कागज तौलिए पर संक्षेप में दाग, और एक नया में जगह, ५० मिलीलीटर ट्यूब लेबल । दोनों rhizosphere और बर्फ पर जड़ों युक्त एक युक्त ट्यूब प्लेस ।

3. प्रयोगशाला में फील्ड नमूनों की प्रोसेसिंग

  1. क्षेत्र संग्रह के बाद जड़ों की सतह नसबंदी ।
    नोट: मैदान से लौटने के बाद जितनी जल्दी हो सके सतह बंध्याकरण करें । यदि यह एक ही दिन में जड़ों निष्फल सतह के लिए संभव नहीं है, 4 डिग्री सेल्सियस पर दुकान जड़ों जब तक संसाधित ।
    1. ५०% ब्लीच के लगभग ३५ मिलीलीटर + ०.०१% जोड़ें 20 से ५० मिलीलीटर रूट ट्यूबों क्षेत्र में एकत्र के बीच । हिला ५० एमएल ट्यूबों के लिए 30 से ६० सेकंड । बंद डालो ५०% ब्लीच और ७०% ेतोः के ३५ मिलीलीटर जोड़ें । एक और 30 से ६० सेकंड के लिए हिलाओ ।
    2. बंद डालो ७०% ेतोः और बाँझ के ३५ मिलीलीटर, ultrapure पानी जोड़ें । 1 मिनट के लिए हिलाओ । पानी को धोकर दो बार दोहराएं ।
      नोट: हमारी सतह नसबंदी उपचार सुनिश्चित करने के लिए पर्याप्त है, हम पिछले कुल्ला से पानी के नमूने चढ़ाया और बैक्टीरिया की कोई वृद्धि नहीं मनाया (पी. वांग, अप्रकाशित डेटा, २०१४) । अंय जांचकर्ताओं रूट नसबंदी दक्षता के लिए परीक्षण किया है समान तरीकों9,10का उपयोग कर ।
    3. दाग साफ कागज तौलिए पर सूखी जड़ें । प्रत्येक नमूने के लिए एक साफ कागज तौलिया का प्रयोग करें ।
      ध्यान दें: कागज तौलिए का उपयोग करने से पहले निष्फल किया जा सकता है । हम अपने कागज तौलिए निष्फल नहीं है । हालांकि, हम नमूना प्रति 1 कागज तौलिया का उपयोग करें और तौलिया रखने के लिए इस्तेमाल किया जब तक लिपटे ।
    4. बाँझ संदंश और छंटाई कैंची का उपयोग करना, जड़ों में लगभग 5 मिमी टुकड़ों में कटौती और एक साफ में जगह काट जड़ों, 15 मिलीलीटर शंकु ट्यूब लेबल । नमूने पर-८० ° c आगे संसाधित होने तक संग्रहीत ।
  2. प्रोसेसिंग rhizosphere नमूने ।
    1. शेक ५० एमएल ट्यूब क्षेत्र से rhizosphere नमूने युक्त पूरे नमूने resuspend । एक बाँझ, १००-µm-जाल सेल छलनी का उपयोग ( सामग्री की तालिकादेखें), एक नया ५० मिलीलीटर ट्यूब में resuspend नमूना फ़िल्टर ।
    2. कमरे के तापमान पर 5 मिनट के लिए ३००० x g पर ट्यूबों केंद्रापसारक । तुरंत बंद डालो और supernatant को त्यागें ।
    3. बर्फ पर ५० मिलीलीटर ट्यूबों में rhizosphere छर्रों प्लेस । rhizosphere छर्रों और निलंबित करने के लिए भंवर के लिए (बिना surfactant) बाँझ फॉस्फेट बफर की १.५ मिलीलीटर जोड़ें.
    4. प्लास्टिक एक साफ, लेबल, 2 मिलीलीटर microfuge ट्यूब में निलंबित तरल । १५,८७१ एक्स जी में कमरे के तापमान पर 2 मिनट के लिए ट्यूब स्पिन । तुरंत supernatant बंद डालो और साफ कागज तौलिए पर ट्यूब नाली ।
    5. जब तक आगे की कार्रवाई की-20 डिग्री सेल्सियस पर छर्रों की दुकान ।
      नोट: चरण 3.2.2-3.2.4 भंडारण के लिए नमूना ट्यूब आकार को कम करने के लिए किया जाता है । यह अधिक स्थान पर छोटे 2 मिलीलीटर ट्यूबों ५० मिलीलीटर ट्यूबों की तुलना में स्टोर करने के लिए कुशल है ।
  3. डीएनए निष्कर्षण और मृदा विश्लेषण के लिए प्रसंस्करण मिट्टी के नमूने ।
    1. एक बाँझ धातु रंग का प्रयोग, एक साफ भरने, डीएनए निष्कर्षण के लिए मिट्टी के लगभग 3 ग्राम के साथ 2 मिलीलीटर ट्यूब लेबल । किसी भी छोटे जड़ टुकड़े और मलबे से बचें । -20 डिग्री सेल्सियस पर इस मिट्टी के नमूने की दुकान । प्रत्येक नमूने के बीच ७०% ेतोः में कुल्ला धातु रंग ।
    2. एक साफ धो पैन में, खड़ी छलनी में मिट्टी के थैले खाली ( सामग्री की तालिकादेखें), छोटे छलनी के शीर्ष पर बड़ा छलनी, और मैंयुअल रूप से दोनों छलनी के माध्यम से मिट्टी छलनी । सावधानी से नमूनों के बीच छलनी साफ करने के लिए एक ब्रश का उपयोग करें ।
    3. एक अलग सेट १०० को छलनी मिट्टी के १२५ ग्राम में एक १७.७ x १९.५ सेमी भविष्य मिट्टी भौतिक और बनावट विश्लेषण के लिए ज़िपित बैग । कम अवधि के भंडारण के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर मिट्टी के बैग रखें ।
  4. मिट्टी की नमी के लिए प्रसंस्करण मिट्टी के नमूने ।
    1. एक पैमाने पर एक लेबल ब्राउन पेपर बैग धड़ा । उपाय ४० ब्राउन कागज बैग में छलनी मिट्टी की ४५ जी । ५५-६० डिग्री सेल्सियस के लिए सेट एक सुखाने ओवन में एक डाटा शीट और जगह बैग पर ब्राउन पेपर बैग और मिट्टी का वजन रिकॉर्ड ।
    2. ७२ घंटे के बाद, सुखाने ओवन से बैग निकालें । मिट्टी के बैग को कम से 30 मिनट के लिए ठंडा और फिर वजन की अनुमति दें ।
    3. वजन को रिकॉर्ड करने के लिए स्केल को जीरो पर बारदाना लगाएं और स्केल पर ब्राउन पेपर बैग रखें । सूत्र का उपयोग कर प्रत्येक नमूने के लिए मिट्टी की नमी के प्रतिशत की गणना:
      Equation
      नोट: मिट्टी की नमी विधि केलॉग जैविक स्टेशन दीर्घकालिक पारिस्थितिक अनुसंधान (केबीएस LTER) से है । केबीएस LTER अपनी वेबसाइट (https://Lter.kbs.msu.edu/) पर शोधकर्ताओं के लिए स्थापित प्रोटोकॉल की एक विस्तृत श्रृंखला प्रदान करता है ।

4. डीएनए निकालने के लिए प्रोसेस्ड रूट के नमूनों की तैयारी ।

  1. जमे हुए रूट सामग्री पीस ताकि नमूना समरूप है ।
    1. साफ spatulas के साथ एक प्लास्टिक चोंच में तरल नाइट्रोजन डालो और एक साफ मोर्टार और मूसल में पीस प्रक्रिया भर में जमे हुए नमूने रखने के लिए ।
    2. जमे हुए ऊतक को मोर्टार में रखें और मूसल को महीन पाउडर में पीस लें । लगातार नमूने जमे रखने के लिए पीस भर में तरल नाइट्रोजन जोड़ें ।
    3. एक साफ में जमीन ऊतक जगह के लिए एक रंग का प्रयोग करें, 2 मिलीलीटर ट्यूब लेबल । पर स्टोर-८० ° c ।

5. ९६ में मिट्टी और Rhizosphere नमूनों से डीएनए का निष्कर्षण-अच्छी तरह से प्रारूप

  1. ९६-खैर प्लेटों में मिट्टी के नमूने लोड हो रहा है ।
    1. ७०% ेतोः और 1% ब्लीच के साथ कार्य क्षेत्र नीचे पोंछें । इन कदमों के दौरान लैब दस्ताने पहनें । -20 डिग्री सेल्सियस भंडारण से मिट्टी के नमूने निकालें और एक बर्फ बाल्टी में गल करने की अनुमति दें ।
    2. एक ९६-अच्छी तरह से निष्कर्षण प्लेट कि डीएनए निष्कर्षण किट के साथ प्रदान की जाती है से सील चटाई कवर निकालें । जबकि उपयोग में नहीं साफ रखने के लिए 2 कागज पोंछे के बीच सील चटाई कवर रखें । संदूषण से बचने के लिए, गोंद 8-well पीसीआर स्ट्रिप्स ९६-well निष्कर्षण प्लेट के 12 कॉलम को कवर करने के लिए उपयोग करें ।
    3. एक पैमाने पर एक बाँझ तौलना-कीप (आकार एसएम) धड़ा और मिट्टी के २०० से २५० मिलीग्राम बाहर वजन ।
      नोट: इन बाँझ कीप एक तरफ चपटा कर रहे हैं, तो कीप एक पैमाने पर फ्लैट देता है. कीप मिट्टी से भर जाता है और सीधे एक अच्छी तरह से रखा गया है । इस तकनीक के नमूनों के नुकसान से बचा जाता है, छलकने को कम करता है, और पार संक्रमण से बचाता है ।
    4. निष्कर्षण थाली के पहले अच्छी तरह से उजागर करने के लिए, ध्यान से चिपकने वाला पट्टी ऊपर उठाया, उपयुक्त अच्छी तरह से भरा वजन-कीप की गर्दन जगह है, और धीरे उचित अच्छी तरह से मिट्टी के नमूने गाइड । चिपकने वाला पट्टी को अच्छी तरह से कवर बदलें ।
    5. प्लेट के हर कुआं के लिए इस प्रक्रिया को दोहराएँ, प्रत्येक नमूने के लिए एक नया, बाँझ कीप का उपयोग कर जब तक थाली भर जाता है. एक निष्कर्षण रिक्त नियंत्रण के रूप में एक अच्छी तरह से खाली छोड़ दें ।
      नोट: एक अच्छी तरह से एक नकारात्मक (खाली) नियंत्रण के रूप में सेवा करने के लिए हर निष्कर्षण थाली पर खाली छोड़ दिया है । इस नियंत्रण में मौजूद हो सकता है जो दूषित पदार्थों के लिए किट एजेंट11
    6. निकासी की थाली पर सील चटाई कवर बदलें और थाली में स्टोर-20 ° c जब तक डीएनए निष्कर्षण के लिए तैयार है ।
  2. ९६-अच्छी तरह से प्लेटों में rhizosphere नमूने लोड हो रहा है ।
    1. से rhizosphere नमूने निकालें-20 डिग्री सेल्सियस भंडारण और एक बर्फ बाल्टी में गल करने के लिए अनुमति देते हैं ।
    2. डीएनए निष्कर्षण प्लेट तैयार करने के लिए ऊपर कदम 5.1.2 का पालन करें ।
    3. एक पैमाने पर एक साफ कागज पोंछे जगह है, तो पैमाने पर एक बाँझ धातु रंग धड़ा । सावधानी से एक नमूना ट्यूब से rhizosphere गोली से कुछ बाहर स्कूप करने के लिए रंग का प्रयोग करें । स्केल करने के लिए रंग लौटें और rhizosphere नमूना के २०० और २५० मिलीग्राम के बीच तौलना ।
    4. सावधानी से निष्कर्षण थाली के पहले अच्छी तरह से उजागर करने के लिए चिपकने वाला पट्टी लिफ्ट, अच्छी तरह से में भरा रंग कोण, और एक बाँझ दंर्तखोदनी के साथ उपयुक्त अच्छी तरह से rhizosphere सामग्री परिमार्जन.
    5. पानी में धातु रंग कुल्ला, नमूनों के बीच ७०% ेतोः द्वारा पीछा किया । थाली के हर कुआं के लिए इस प्रक्रिया को दोहराने जब तक थाली भर जाता है, एक अच्छी तरह से खाली छोड़ एक निकासी रिक्त नियंत्रण के रूप में ।
  3. ९६ में rhizosphere और मिट्टी के नमूनों से डीएनए का निष्कर्षण-अच्छी तरह से प्रारूप ।
    1. एक मिट्टी के लिए अनुकूलित किट का उपयोग कर मिट्टी और rhizosphere डीएनए निकालें ( सामग्री की तालिकादेखें), निर्माता के प्रोटोकॉल के बाद ।
      नोट: हम इस विशिष्ट किट का उपयोग करने के लिए मिट्टी और rhizosphere डीएनए की क्षमता की वजह से अलग करने के लिए स्वामित्व रिएजेंट humic एसिड और अंय शक्तिशाली पीसीआर मिट्टी में पाया अवरोधकों को दूर ।
  4. डीएनए ठहराव.
    1. ९२ नमूने और मानकों के 4 सांद्रता एक किट का उपयोग कर ( सामग्री की तालिकादेखें; मानक शामिल हैं), निर्माता के प्रोटोकॉल के अनुसार ।
    2. शेष 4 नमूने है कि प्लेट से हटा दिया गया चार मानकों के लिए कुओं को समायोजित करने के लिए एक किट का उपयोग कर ( सामग्री की तालिकादेखें), निर्माता के प्रोटोकॉल के अनुसार ।

6. ९६ में रूट नमूनों से डीएनए का निष्कर्षण-अच्छी तरह से प्रारूप ।

  1. ९६-अच्छी तरह से प्लेटों में रूट नमूने लोड हो रहा है ।
    1. ७०% ेतोः और 1% ब्लीच के साथ कार्य क्षेत्र नीचे पोंछें । इन कदमों के दौरान दस्ताने पहनें ।
    2. सूखी बर्फ के साथ एक बाल्टी में नमूने रखकर हर समय जमे हुए जमीन जड़ नमूने रखें ।
    3. एक प्लास्टिक के चोंच को तरल नाइट्रोजन के साथ भरें और प्लास्टिक के यूरिन में antistatic microspatulas और बाँझ गरिष्ठ-कीप (size XSM) को ठंडा होने के लिए लगाएं ।
    4. ९६-अच्छी तरह निष्कर्षण मनका थाली है कि किट के साथ प्रदान की जाती है और यह 2 कागज पोंछे के बीच जगह को साफ रखने के समय उपयोग में नहीं है से सील चटाई कवर निकालें ।
      नोट: इस किट के नए संस्करण, समय हम इन डीएनए निकालने प्रदर्शन के बाद जारी, निष्कर्षण मनका प्लेटों की आपूर्ति के लिए उपयोगकर्ता की आवश्यकता है । सामग्री की तालिकामें, हम इन आइटमों को ऑर्डर करने के लिए आवश्यक विक्रेता कैटलॉग जानकारी सूचीबद्ध है ।
    5. संदूषण से बचने के लिए, गोंद 8-well पीसीआर स्ट्रिप्स ९६-well निष्कर्षण प्लेट के 12 कॉलम को कवर करने के लिए उपयोग करें ।
    6. सूखी बर्फ पर निष्कर्षण मनका थाली प्लेस जमे हुए कुओं में नमूने रखने के लिए ।
    7. सावधानी से चिपकने वाली पट्टी लिफ्ट ऊपर निष्कर्षण थाली के पहले अच्छी तरह से उजागर करने के लिए, भरा वजन की गर्दन जगह उपयुक्त अच्छी तरह से कीप, और जमीन रूट ऊतक के 3 रंग स्कूप जोड़ें । चिपकने वाला पट्टी को अच्छी तरह से कवर बदलें ।
      नोट: मिट्टी और rhizosphere बर्फ पर गल रहे है पहले वजन, जबकि संयंत्र सामग्री बाहर जमे हुए तौला जाता है । फ्रोजन संयंत्र ऊतक, विशेष रूप से छोटी मात्रा, गल बिना एक पैमाने पर तौलना करने के लिए मुश्किल है । वजन परीक्षण जमीन रूट ऊतक पर किया गया था कि कितने रंग स्कूप पर्याप्त थे निर्धारित करने के लिए । ध्यान दें कि किट के निर्माता ऊतक की एक सटीक राशि की आवश्यकता नहीं है, लेकिन लगभग ५० मिलीग्राम की सिफारिश की । विभिन्न पौध नमूना प्रकार अलग अलग होंगे और उपयोगकर्ता के लिए उचित राशि निर्धारित करने की आवश्यकता होगी ।
    8. थाली भर जाने तक हर कुआं के लिए इस प्रक्रिया को दोहराएं ।
    9. पर स्टोर प्लेट-20 ° c डीएनए निष्कर्षण के लिए तैयार है जब तक ।
  2. जड़ ऊतक के डीएनए निष्कर्षण ।
    1. एक संयंत्र के लिए अनुकूलित किट का उपयोग कर डीएनए निकालें ( सामग्री की तालिकादेखें) निर्माता के प्रोटोकॉल का पालन ।
      नोट: हम इस किट है कि विशेष रूप से संयंत्र के ऊतकों को जड़ नमूनों से अधिकतम पैदावार को प्राप्त करने के लिए डिज़ाइन किया गया है का उपयोग करें । मिट्टी और rhizosphere के विपरीत, humic एसिड और अंय पदार्थों जड़ ऊतक के लिए एक समस्या के कम कर रहे हैं ।
  3. चरण ५.४ में के रूप में डीएनए मात्रा ।

7. प्रवर्धन और अलग डीएनए अनुक्रमण ।

  1. Gohl एट अल में वर्णित के रूप में एक सबूत पढ़ने पोलीमरेज़ ( सामग्री की तालिकादेखें) के साथ 16S जीन के V4 क्षेत्र बढ़ाना । अनुक्रमण से पहले अलग अनुक्रमण प्राइमरों और पूल के साथ 12 बारकोड नमूने । Gohl एट अल द्वारा वर्णित तरीकों का उपयोग कर अनुक्रम12 V4 प्राइमरों (पूरक फ़ाइल 1) के साथ एक दो कदम पीसीआर प्रक्रिया का उपयोग कर ।
    नोट: इन चरणों के लिए कुछ विधियां विवरण में वर्णित है कहीं12,13,14 और इसलिए यहां वर्णित नहीं किया जाएगा । रूट नमूनों के लिए, ॄणा ब्लॉकर्स को संयंत्र के ऊतकों से plastid डीएनए की मात्रा को कम करने के लिए जोड़ा गया था, जो पहले पूरी तरह से15बताई गई है । दो नियंत्रण अनुक्रमण में इस्तेमाल किया गया, एक नकारात्मक नियंत्रण जो निष्कर्षण प्लेट खाली नियंत्रण शामिल (कदम 5.1.5 के बाद ध्यान दें देखें), और बैक्टीरियल डीएनए की एक ज्ञात जनसंख्या का एक नकली समुदाय ( सामग्री की तालिकादेखें) जो एक सकारात्मक रूप में सेवा नियंत्रण.
    नोट: अधिकांश मामलों में, MiSeq एजेंट किट v3 2 X ३०० आधार युग्मित अंत मोड में उपयोग किए जाते हैं । इस पांडुलिपि में नमूनों के लिए, Illumina HiSeq २५०० का उपयोग रैपिड मोड में २५० मीन्स-end (2 x २५०) मोड के साथ किया गया था । सभी सैंपल एक ही लेन में सीक्वेंस किए गए थे ।
  2. माइक्रोबियल समुदाय विश्लेषण के लिए एक पाइपलाइन के माध्यम से अनुक्रमण डेटा की प्रक्रिया (USEARCH वी 9.2.64, QIIME वी 1.9.1 और RStudio वी 3.4.3 16) ।
    1. USEARCH17का उपयोग कर sequencing डेटा तैयार करें ।
      नोट: USEARCH पूर्ण निर्देश (https://www.drive5.com/usearch/) के साथ ऑनलाइन उपलब्ध है ।
    2. division इंडेक्सिंग डेटा का उपयोग कर अनुक्रमण पढ़ता या बारकोड्स असाइन करने के लिए नमूने के लिए Illumina पढ़ता है ।
    3. मर्जेड-एंड पढ़ता आम सहमति अनुक्रम प्राप्त करने के लिए । आदेश का उपयोग करें: usearch-fastq_mergepairs * R1 *. fastq-relabel @-fastq_maxdiffs 10-fastq_minmergelen २३०-fastq_maxmergelen ३२०-fastq_pctid ८०-fastqout मर्ज. fq.
      नोट: पैरामीटर संदर्भित USEARCH अनुदेश मैनुअल के माध्यम से सेट कर रहे हैं ।
    4. प्राइमरी जुगाड़ में होने वाले प्रतिस्थापन से बचने के लिए प्राइमरी के sequencing डेटा से निकालें, जो कि पीसीआर रिएक्शन की वजह से हो सकता है । आदेश का उपयोग करें: usearch-fastx_truncate मर्ज. fq-stripleft 19-stripright 20-fastqout छीन. fq.
    5. कम गुणवत्ता वाले पढ़ता को निकालने के लिए sequencing डेटा फ़िल्टर और उच्च गुणवत्ता संचालन वर्गीकरण इकाई (ओटू) अनुक्रम रखें । आदेश का उपयोग करें: usearch-fastq_filter छीन लिया । fq-fastq_maxee १.०-fastaout छान. एफए.
  3. USEARCH में OTUs उत्पन्न करें ।
    1. अद्वितीय ओटू अनुक्रम के सेट को पहचानने के लिए पुनरावृत्ति निष्पादित करें । आदेश का उपयोग करें: usearch-fastx_uniques छान. एफए-fastaout नय. एफए-sizeout-relabel Uniq.
    2. ९७ – १००% अनुक्रम अद्वितीय OTUs निर्दिष्ट करने के लिए समानता के साथ क्लस्टर OTUs. आदेश का उपयोग करें: usearch-cluster_otus नय. एफए-minsize 2-otus otus. एफए-relabel ओटू.
      नोट: यह चरण भी संकुल OTUs से हटाने singletons और sequencing डेटा से chimeras को निकालने को शामिल है ।
    3. USEARCH में एक ओटू तालिका बनाएं । आदेश का उपयोग करें: usearch-usearch_global छीन लिया. fq-डीबी otus. एफए-कतरा प्लस-आईडी ०.९७-otutabout otutable. txt.
      नोट: यह आदेश प्रत्येक नमूने के लिए सभी OTUs के पढ़ता (गिनता) की संख्या के साथ एक तालिका जनरेट करता है । ओटू तालिका अंतर बहुतायत विश्लेषण और माइक्रोबियल विविधता विश्लेषण सहित बहाव चरणों के लिए प्रयोग किया जाता है । ओटू तालिका का उदाहरण पूरक चित्रा 2 में दिखाया गया है ।
    4. QIIME v 1.9.1 18में एक rarefaction विश्लेषण आचरण ।
      नोट: rarefaction वक्र sequencing की गहराई ठीक से माइक्रोबियल समुदाय नमूने कि क्या यह निर्धारित करने के लिए ओटू तालिका का उपयोग कर परिकलित की जाती है । rarefaction curves का उदाहरण पूरक चित्रा 3में दिखाया गया है ।
    5. आचरण एक अल्फा विविधता विश्लेषण18. प्रत्येक नमूने के भीतर माइक्रोबियल समुदाय की विविधता की गणना करने के लिए QIIME v 1.9.1 में alpha_rarefaction. py का उपयोग करें ।
      नोट: इस विश्लेषण में शैनन19, सिम्पसन20और Chao121जैसे विविधता सूचकांकों का परिकलन करता है.
    6. आचरण एक बीटा विविधता विश्लेषण18,22। पायथन लिपि का प्रयोग करें: QIIME v 1.9.1 ब्रे में beta_diversity_through_plots. py-कर्टिस समानता मैट्रिक्स ।
      नोट: यह विश्लेषण नमूनों के बीच माइक्रोबियल समुदाय संरचना की तुलना करता है ।
    7. समूहों के बीच सांख्यिकीय विश्लेषण आचरण । RStudio16में शाकाहारी पैकेज23 वी 2.4.5 में अदोनिस और anova समारोह का उपयोग कर PERMONOVA के लिए परिकलित दूरी मैट्रिक्स का उपयोग करें । आचरण प्रधानाचार्य के विहित विश्लेषण निर्देशांक (कैप) विश्लेषण शाकाहारी पैकेज में capscale समारोह का उपयोग. RStudio में ggplot2 पैकेज24 v 2.2.1 का उपयोग कर डेटा विज़ुअलाइज़ ।

Representative Results

प्रतिनिधि इस पांडुलिपि में प्रस्तुत एक क्षेत्र नेब्रास्का के विश्वविद्यालय-लिंकन कृषि अनुसंधान प्रभाग खेत मीड, NE के पास २०१२ में स्थापित साइट से आया है । प्रयोग करने से पहले, साइट एक मकई के रूप में प्रबंधित किया गया था-सोयाबीन रोटेशन . अध्ययन साइट मिट्टी के तीन विभिंन प्रकार पर स्थित था, लेकिन डेटा के रूप में अगर मापा मिट्टी संपत्तियों में सभी परिवर्तनों को लगाया उपचार के कारण थे विश्लेषण किया गया ।

क्षेत्र साइट दो निहित, शुद्ध, switchgrass का खड़ा है (virgatum सीवी लिबर्टी) और बिग bluestem (ए. gerardii) के रूप में अच्छी तरह से एक कम विविधता घास बड़े bluestem युक्त मिश्रण, indiangrass (एस nutans), और ' विभ ' sideoats नाटी ( B. curtipendula). तीन गर्म मौसम घास भूखंडों एक यादृच्छिक पूरा ब्लॉक डिजाइन कि तीन बार दोहराया गया था में थे । तीन अलग घास के भूखंडों में नेस्टेड दो नाइट्रोजन (एन) निषेचन उपचार, जो ५६ (N1) और ११२ (N2) केजी N हा-1 के एप्लाइड यूरिया थे । बढ़ते मौसम के अंत में microbiome सैंपलिंग के समय, मिट्टी निहित ८.० ± १.१ (मतलब ± एसडी) भूखंडों में पीपीएम नाइट्रेट ११२ किग्रा n हेक्टेयर के साथ निषेचित-1 और ६.८ ± ०.७ (मतलब + एसडी) भूखंडों में पीपीएम नाइट्रेट ५६ किग्रा n ha-1के साथ निषेचित । भूखंडों का वर्ष में एक बार निषेचन हुआ था । गर्म मौसम घास भूखंडों मुख्य भूखंडों (८००० एम2) और N उपचार के रूप में नामित किया गया विभाजित भूखंड (४००० एम2) थे । बड़े bluestem को ' बोनांजा ' और ' सोने ' के 50:50 मिश्रण के रूप में वरीयता दी गई थी और Indiangrass को ' स्काउट ' और ' वॉरियर ' के 50:50 मिश्रण के रूप में वरीयता दी गई थी । भूखंड २०१२ में लगाए गए थे, और पहली N आवेदन २०१३ के वसंत में हुई ।

15 सितंबर २०१४ को मिट्टी व जड़ नमूना का आयोजन किया गया था । नीचे वर्णित कार्य एक विभाजित भूखंड के रूप में स्थापित किया गया था कि एक क्षेत्र पर आयोजित किया गया था तीन के साथ यादृच्छिक डिजाइन (चित्रा 1) । endosphere के लिए सभी नमूनों की औसत अनुक्रमण गहराई निम्नानुसार थे: ४८७१ ± ५७११ (± एसडी मतलब), rhizosphere: ४०७२६ ± १४६८४, मिट्टी: ३८१८४ ± ९०४३ । इन प्रयोगों में भिंनता के सबसे बड़े स्रोतों में से एक, वर्णित विधियों का उपयोग कर, नमूना प्रकार (चित्रा 2) के बीच पाया माइक्रोबियल समुदायों में अंतर है । इस प्रतिनिधि डाटा सेट में, rhizosphere और मिट्टी endosphere (चित्रा 2a) के अलावा एक दूसरे के लिए संरचना में अधिक समान प्रतीत होते हैं । हालांकि, वहां भी थे अत्यधिक महत्वपूर्ण (पी = ०.००१) rhizosphere और मिट्टी (चित्रा बी) के बीच माइक्रोबियल समुदाय संरचना में अंतर । कुल भिन्नता नमूना प्रकार द्वारा विश्लेषण इन प्रयोगों में के लिए खाते में 26% था.

अल्फा विविधता विश्लेषण से पता चला कि endosphere में माइक्रोबियल समुदायों के रूप में मिट्टी और rhizosphere (चित्रा 3) की तुलना में नमूना विविधता में कम थे । किसी भी डिब्बे में घास प्रजातियों के बीच विविधता में केवल महत्वपूर्ण अंतर बड़े bluestem और switchgrass के endosphere नमूनों के बीच थे, switchgrass के साथ काफी अधिक माइक्रोबियल प्रजातियों विविधता (चित्रा 3) । सापेक्ष बहुतायत विश्लेषण (चित्रा 4) सभी नमूना प्रकार में Actinobacteria द्वारा पीछा Proteobacteria के प्रभुत्व पर प्रकाश डाला गया । मिट्टी और rhizosphere भी Acidobacteria और Chloroflexi का प्रभुत्व है जबकि endosphere Bacteriodetesके एक बड़े रिश्तेदार बहुतायत था ।

इस प्रयोग में, पौधों N उर्वरक के दो अलग मात्रा के साथ बड़े हो गए थे और इसलिए हम डेटा का विश्लेषण करने के लिए निर्धारित है कि वहां उपचार प्रभाव थे । उपचार प्रभाव कुल भिन्नता के 12% के लिए हिसाब लेकिन समंवय में दो उपचार अलग देखो हालांकि काफी अलग नहीं थे (चित्रा 5). यह दृश्य निरीक्षण या गुणात्मक निर्णय के बजाय इन डेटासेट के लिए सांख्यिकीय विश्लेषण के महत्व पर प्रकाश डाला गया.

संयंत्र-पौधों के ऊतकों और मिट्टी के microbiome में मतभेद प्रभावित समंवय का एक विवश विधि का उपयोग कर visualized थे । सांख्यिकीय मतभेद का परीक्षण करने के लिए एक PERMANOVA विश्लेषण का उपयोग कर निर्धारित किया गया था कि विशिष्ट चर, जैसे प्रजातियों के नमूने के बीच काफी अलग माइक्रोबियल समुदाय संरचना में परिणाम है । सभी नमूना प्रकार एक साथ विश्लेषण किया गया था, एक अत्यधिक महत्वपूर्ण अंतर प्रजातियों के पौधे (चित्रा 6) के कारण माइक्रोबियल समुदाय संरचना में पाया गया था । इस प्रयोग में, पौधों की प्रजातियों द्वारा खाते में भिंनता की मात्रा ६.७% थी । अंत में, प्रत्येक नमूना प्रकार का विश्लेषण किया गया व्यक्तिगत रूप से निर्धारित करने के लिए जो नमूना प्रकार के महत्वपूर्ण संयंत्र प्रजातियों प्रभाव ड्राइविंग हो सकता है. केवल endosphere में एक बहुत महत्वपूर्ण अंतर था (पी = ०.००१) अलग संयंत्र प्रजातियों (चित्रा 7) के माइक्रोबियल समुदाय रचनाओं के बीच । अन्य नमूना प्रकार में, प्रजातियों प्रभाव व्यक्तिगत रूप से विश्लेषण किया जब महत्वपूर्ण नहीं था. endosphere में, प्रजातियों के कारण प्रतिशत भिन्नता 27% थी, जबकि यह rhizosphere में कम था (18%) और मिट्टी (15%). यह आगे प्रत्येक ऊतक प्रकार व्यक्तिगत रूप से विश्लेषण के महत्व पर प्रकाश डाला गया ।

Figure 1
चित्रा 1: प्रयोगात्मक क्षेत्र डिजाइन का उदाहरण । प्रयोगात्मक फील्ड डिजाइन नेब्रास्का विश्वविद्यालय में स्थित क्षेत्र साइट के तपसिल में एक यादृच्छिक पूरा ब्लॉक डिजाइन illustrating-लिंकन ईस्टर्न नेब्रास्का अनुसंधान और मीड के पास विस्तार केंद्र, NE । पूर्ण साइट वर्णन के लिए परिणाम अनुभाग देखें । N1 कम है (५६ किग्रा n हा-1 यूरिया) और N2 (११२ किग्रा n हा-1 यूरिया) उच्च नाइट्रोजन दर है जो लागू किया गया है । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 2
चित्रा 2: बीटा विविधता endosphere, rhizosphere, और २०१४ में बारहमासी घास नमूने से मिट्टी सहित अलग नमूना प्रकार में माइक्रोबियल संरचना की तुलना विश्लेषण । विश्लेषण qiime 1.9.1 में एक अजगर स्क्रिप्ट का उपयोग करने ब्रे-कर्टिस समानता मैट्रिक्स का उत्पादन किया गया । प्रिंसिपल निर्देशांक विश्लेषण (PCoA) ब्रे-कर्टिस समानता मैट्रिक्स के आधार पर RStudio में visualized था । PCoA1 और PCoA2 PCoA विश्लेषण द्वारा समझाया पहला और दूसरा सबसे बड़ा विचरण इंगित करते हैं । PERMANOVA सांख्यिकीय विश्लेषण नमूना प्रकार के बीच के महत्व को निर्धारित करने के लिए किया गया था, और p मान शीर्ष दाएँ कोने पर दिखाया गया है । आंकड़ों में प्रत्येक प्रतीक प्रत्येक नमूने के लिए पूरे माइक्रोबियल समुदाय का प्रतिनिधित्व करते हैं । (क) Endosphere, rhizosphere और मृदा नमूना प्रकारों का एक साथ विश्लेषण किया गया. सभी ८७ नमूनों को rarefied प्रति नमूना ४८६ का जुगाड़ किया गया । (ख) Rhizosphere और मृदा के नमूनों का एक साथ विश्लेषण किया गया. सभी ५९ नमूनों को ८२३१ जुगाड़ के साथ rarefied गया । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 3
चित्रा 3: अल्फा विविधता endosphere, rhizosphere और मिट्टी में प्रत्येक प्रजाति के लिए शैनन सूचकांक का उपयोग विश्लेषण । विश्लेषण बाहर किया गया qiime 1.9.1 में एक अजगर स्क्रिप्ट का उपयोग कर । Rarefaction endosphere, rhizosphere, और मिट्टी नमूना प्रकार के लिए किया गया था क्रमशः ४८६, १७१५४ और ८२३१ नमूने प्रति अनुक्रम के साथ । बक्से 25 और 75 वां शतमक (प्रथम और तृतीय quartiles) इंगित करते हैं । बॉक्स के भीतर क्षैतिज रेखा माध्य और लाल प्लस अर्थ दिखाता है दर्शाता है । मूंछ outliers (जो काले डॉट्स के रूप में दिखाया जाता है) को छोड़कर डेटा की सीमा दिखाने के लिए है कि १.५ से अधिक बार interquartile रेंज (n = 6 sideoats नाटी मिश्रण के अलावा प्रत्येक नमूने के लिए जहां n = 5) गिर गया । endosphere में सभी पांच प्रजातियों में से शैनन सूचकांक rhizosphere और मिट्टी दोनों की तुलना में कम था । गैर पैरामीट्रिक Wilcoxon रैंक राशि परीक्षण प्रजातियों और प्रजातियों के बीच केवल महत्वपूर्ण मतभेदों के बीच महत्व निर्धारित करने के लिए इस्तेमाल किया गया था बक्से के शीर्ष पर दिखाया गया है । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 4
चित्रा 4: endosphere, rhizosphere, और मिट्टी में जाति स्तर पर सापेक्ष बहुतायत । नमूने के विभिन्न नमूनों प्रकार के बीच माइक्रोबियल संघ की बहुतायत की तुलना करने के लिए विश्लेषण किया गया (n = 29 प्रत्येक नमूना प्रकार के लिए). विश्लेषण बाहर ओटू तालिका से qiime 1.9.1 में एक अजगर स्क्रिप्ट का उपयोग किया गया था । पाइ चार्ट के अंदर के विभिंन रंग संघ को निरूपित करते हैं । प्रतिशत प्रत्येक नमूना प्रकार में प्रत्येक जाति के सापेक्ष बहुतायत इंगित करता है । जाति जानकारी राइबोसोमल डेटाबेस प्रोजेक्ट वर्गीकारक (RDP)25का उपयोग कर व्याख्या की गई थी । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 5
चित्रा 5: सभी नमूना प्रकार के बीच विवश कारक के रूप में उपचार का उपयोग विश्लेषण. प्रधानाचार्य निर्देशांक (कैप) विश्लेषण का विहित विश्लेषण यह निर्धारित करने के लिए किया गया था कि क्या उपचार के बीच माइक्रोबियल समुदाय संरचना में मतभेद थे । प्रत्येक n उपचार के लिए, n = ४२ N1 के लिए (५६ kg n हा-1) और n = ४५ N2 के लिए (११२ kg n हा-1) । ब्रे-कर्टिस समानता मैट्रिक्स qiime 1.9.1 में एक अजगर स्क्रिप्ट का उपयोग कर उत्पंन किया गया था । कैप विश्लेषण के आधार पर ब्रे-कर्टिस समानता मैट्रिक्स RStudio में कारक के रूप में इलाज के लिए विवश द्वारा किया गया था । PERMANOVA विश्लेषण का निर्धारण करने के लिए किया गया था कि क्या उपचार अंतर महत्वपूर्ण थे, और p मान शीर्ष दाएं कोने पर दिखाया गया है । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 6
चित्रा 6: सभी नमूना प्रकार के बीच विवश कारक के रूप में संयंत्र प्रजातियों का उपयोग विश्लेषण. विश्लेषण है कि क्या वहां सभी नमूना प्रकार में संयंत्र प्रजातियों के बीच माइक्रोबियल समुदाय संरचना में मतभेद थे निर्धारित करने के लिए आयोजित किया गया था । प्रिंसिपल समंवय और सभी नमूना प्रकार (endosphere, rhizosphere, और मिट्टी) के कैप विश्लेषण निर्देशांक एक ब्रे-कर्टिस समानता मैट्रिक्स का उपयोग किया गया । ब्रे-कर्टिस समानता मैट्रिक्स qiime 1.9.1 में अजगर स्क्रिप्ट का उपयोग कर उत्पंन किया गया था । कैप विश्लेषण के आधार पर ब्रे-कर्टिस समानता मैट्रिक्स RStudio में कारक के रूप में संयंत्र प्रजातियों विवश द्वारा किया गया था । PERMANOVA सांख्यिकीय विश्लेषण संयंत्र प्रजातियों के बीच महत्व का निर्धारण करने के लिए किया गया था, और पी मूल्य शीर्ष दाएं कोने पर दिखाया गया है । आंकड़ों में प्रत्येक प्रतीक है कि नमूने के लिए पूरे माइक्रोबियल समुदाय का प्रतिनिधित्व करता है । n = 18 sideoats नाटी मिश्रण के लिए n = 15 को छोड़कर सभी नमूना प्रकार में प्रत्येक प्रजातियों के लिए । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 7
चित्रा 7: टोपी विश्लेषण का उदाहरण व्यक्तिगत रूप से प्रत्येक नमूना प्रकार के लिए विवश कारक के रूप में प्रजातियों का उपयोग कर. प्रिंसिपल समंवय और टोपी विश्लेषण प्रत्येक नमूना प्रकार (endosphere, rhizosphere, और मिट्टी) का उपयोग ब्रे-कर्टिस समानता मैट्रिक्स का प्रयोग । प्रत्येक नमूना प्रकार rarefied करने के लिए ४८६, १७१५४, और ८२३१ प्रति नमूना क्रमशः endosphere, rhizosphere और मिट्टी में पढ़ता था । प्रजातियों के कारक के रूप में इस्तेमाल किया समंवय विवश था । PERMANOVA सांख्यिकीय विश्लेषण प्रत्येक नमूना प्रकार में संयंत्र प्रजातियों के बीच महत्व का निर्धारण करने के लिए किया गया था, और p मान शीर्ष दाएँ कोने पर दिखाया गया है । चित्रा में प्रत्येक प्रतीक प्रत्येक नमूने के लिए पूरे माइक्रोबियल समुदाय का प्रतिनिधित्व करता है । नमूना आकार प्रत्येक नमूना प्रकार के लिए n = 29 है, sideoats नाटी मिश्रण (n = 5) के अलावा प्रत्येक नमूना प्रकार में प्रत्येक पादप प्रजातियों के लिए n = 6. कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Discussion

इस पांडुलिपि में वर्णित विधियों को वैज्ञानिकों को मृदा और पादप metagenomics के क्षेत्र में आसानी से प्रवेश करने के लिए सक्षम बनाना चाहिए । इन वर्षों में, हम इस पांडुलिपि में वर्णित प्रयोग के आयोजन के बाद से हमारे तरीकों परिष्कृत किया है । एक परिवर्तन यह है कि हम अब पूर्व लेबल ट्यूबों क्षेत्र के लिए बाहर जाने के लिए नमूना से पहले । हमारी प्रयोगशाला एक barcoding प्रणाली और एक लेबल प्रिंटर का उपयोग करता है । लेबल प्रिंटर न केवल समय बचाता है जब लेबल ट्यूब, लेकिन यह भी सब कुछ आसान ट्रैक करने के लिए और सही ढंग से मानव हाथ लेखन के अनियमितता बिना नमूनों की पहचान करने के लिए बनाता है. एक और महत्वपूर्ण मुद्दा यह है कि हम इसे वापस लाने के बाद जितनी जल्दी हो सके क्षेत्र से सामग्री की प्रक्रिया की कोशिश करो । हम डीएनए विश्लेषण के लिए इस्तेमाल मिट्टी फ्रीज, बंध्याकरण और जड़ों फ्रीज, और फिल्टर और 12 से ३६ घंटे के भीतर rhizosphere फ्रीज मैदान से लौटने के बाद उद्देश्य । डीएनए निष्कर्षण प्रक्रियाओं विशेष रूप से मिट्टी और rhizosphere के लिए कई कदम, के साथ लंबे होते हैं, तो हम एक रोबोट खरीदा (किंगफिशर फ्लेक्स, ThermoFisher) कि डीएनए निष्कर्षण प्रोटोकॉल के लिए समय पर हाथ कम कर देता है, मानव त्रुटि है कि पेश किया जा सकता है कम हो जाती है, और मिट्टी, जड़ों, या rhizosphere के विभिंन बैचों तरीके में स्थिरता में सुधार संसाधित कर रहे हैं । जब संयंत्र सामग्री के साथ काम करने के लिए रूट प्रकार पर फैसला करने के लिए अध्ययन किया जा करने के लिए या जड़ प्रकार की एक किस्म लेने के लिए एक "प्रतिनिधि नमूना प्राप्त करने के लिए महत्वपूर्ण है." जड़ों और एक जमे हुए राज्य में पत्तियों को बनाए रखने जब डीएनए निकालने का आयोजन महत्वपूर्ण है, के रूप में सुनिश्चित करना है वहां कोई पार के नमूनों के बीच संदूषण जब ९६-अच्छी तरह से डीएनए निष्कर्षण प्लेटें भरना है । एक अंय महत्वपूर्ण कारक पर विचार करने के लिए इस्तेमाल किया जा दोहराने की संख्या है जब क्षेत्र प्रयोगों डिजाइनिंग और एक पूरी यादृच्छिक डिजाइन का उपयोग कर जहां संभव26। उच्च क्षेत्र परिवर्तनशीलता के कारण यह छोटे मतभेदों का पता लगाने के लिए दोहराने की एक बड़ी संख्या है करने के लिए आवश्यक हो सकता है । अंत में, हमारे अनुभव से यह सुनिश्चित करने के लिए मिट्टी भी गीला नहीं कर रहे है जब जड़ों खुदाई आवश्यक है । मिट्टी पानी के साथ संतृप्त कर रहे हैं, तो यह न केवल गन्दा के साथ काम करने के लिए है, लेकिन यह भी rhizosphere को परिभाषित करने के लिए और जड़ों से मिट्टी हटाने के लिए बहुत मुश्किल है ।

एक संशोधन है कि जल्दी पर इन तरीकों के विकास के दौरान किया गया था बजाय हाथ से ट्यूबों मिलाते हुए rhizosphere हम एक गैस जनरेटर के द्वारा संचालित करने के लिए काम आसान क्षेत्र में और अधिक मानकीकृत के मामले में बनाने के लिए उंनयन जारी समय और तरीके कि प्रत्येक ट्यूब उत्तेजित हो गया था । amplicon अनुक्रमण दृष्टिकोण की एक सीमा है कि वर्गीकरण के परिणामों के समाधान अक्सर सीमित है और कई OTUs अज्ञात है या केवल परिवार या जीनस स्तर पर जाना जाता है । अनुसंधान का यह क्षेत्र तेजी से विकसित हो रहा है इसलिए नए और विकासशील दृष्टिकोणों के बारे में जानकारी होना जरूरी है, विशेषकर उन आंकड़ों के विश्लेषण के लिए जो परिणामों के समाधान को बढ़ा सकते हैं ।

इन प्रोटोकॉल केवल बैक्टीरिया और archaea, कवक नहीं अध्ययन करने के लिए कर रहे हैं । प्रवर्धन के लिए अलग प्राइमरों के उपयोग कवक समुदायों के अध्ययन के लिए एक ही डीएनए नमूने का उपयोग कर के लिए अनुमति देगा27,28। इन विधियों में से बड़ी मात्रा में उपकरणों की खरीद की आवश्यकता नहीं है क्योंकि विधियों को सरलीकृत किया जा सकता है । तरीकों हम यहां का वर्णन का निर्धारण "जो वहां है" के लिए मुख्य रूप से कर रहे हैं, लेकिन क्षेत्र जल्दी से समारोह के बारे में महत्वपूर्ण सवाल है, जो शॉटगन अनुक्रमण विधियों, अलगाव और परीक्षण की कार्यक्षमता का उपयोग करके संबोधित किया जा सकता है में विकसित हो रहा है रोगाणुओं, या अनुक्रमण पूरे माइक्रोबियल जीनोम ।

प्रतिनिधि परिणाम माइक्रोबियल समुदायों कि वर्णित तरीकों का उपयोग कर पहचाना जा सकता है में मतभेद पर प्रकाश डाला । डेटा विश्लेषण के लिए एक बीटा-विविधता दृष्टिकोण का उपयोग करना22, नमूना प्रकार के बीच संरचना अंतर दिखाया गया. ये अंतर स्पष्ट रूप से सबसे अंय अध्ययनों में देखा गया है, जहां endosphere, rhizosphere, और मिट्टी अद्वितीय माइक्रोबियल समुदायों3होते हैं । शैनन विविधता सूचकांक endosphere, rhizosphere, और मिट्टी में प्रत्येक संयंत्र प्रजातियों के भीतर मौजूद माइक्रोबियल प्रजातियों की बहुतायत और यहां तक कि निर्धारित करने के लिए गणना की गई थी । के रूप में इस अध्ययन में दिखाया गया है और कई अंय लोगों में, अल्फा विविधता मिट्टी में सबसे अधिक है, rhizosphere में थोड़ा कम है और फिर endosphere3,5,29में काफी कम । इन परिणामों से संकेत मिलता है कि यहां वर्णित विधियों endosphere, rhizosphere, और मिट्टी में संरचना परिवर्तन की पहचान के लिए उपयुक्त हैं ।

Proteobacteria के प्रभुत्व endosphere और मिट्टी30,31,३२पर अध्ययन में एक आम खोज है । Endosphere आम तौर पर Proteobacteriaके एक उच्च सापेक्ष बहुतायत के साथ माइक्रोबियल प्रजातियों में से एक कम विविधता है । यह फिर से प्रकाश डाला गया है कि परिणाम यहां साहित्य में अंय निष्कर्षों के प्रतिनिधि हैं । इस अध्ययन में उपचार प्रभाव काफी अलग नहीं थे और इसके लिए दो प्रमुख कारण हो सकते हैं कि उपचार द्वारा लगाए गए मतभेदों को पर्याप्त विविधता का पता लगाने के लिए उत्पन्न करने के लिए पर्याप्त नहीं थे और यह नमूना के अंत में किया गया था कि मौसम बढ़ रहा है, जब खेतों पर्याप्त समय के लिए नीचे समान स्तर है, जो है जो मौसम के अंत में मापा गया था नाइट्रोजन आकर्षित किया है हो सकता है । एक अंय अध्ययन में समय की एक लंबी अवधि में इसी तरह के निषेचन की दर का उपयोग कर, microbiome की संरचना में केवल अपेक्षाकृत छोटे परिवर्तन३३मापा गया । अन्य अध्ययनों में नाइट्रोजन उर्वरक३४,३५के कारण कवक और जीवाणु दोनों समुदायों में परिवर्तन दिखाई दिया है ।

संयंत्र प्रजातियों उनके microbiomes3,३२,३६ और माइक्रोबियल समुदाय भिंनता में भी छोटे मतभेदों के निर्धारण में भूमिका निभाने के लिए जाना जाता है एक के भीतर विभिंन संयंत्र पादी के बीच प्रदर्शन किया गया है एकल प्रजातियों३७। इस अध्ययन में, माइक्रोबियल समुदाय संरचना में एक महत्वपूर्ण अंतर संयंत्र प्रजातियों के बीच पाया गया था । सभी नमूना प्रकार में यह है कि switchgrass सबसे अलग माइक्रोबियल संरचना था दिखाई दिया, लेकिन प्रजातियों के बीच अंतर केवल endosphere में सांख्यिकीय महत्वपूर्ण थे । Rhizosphere समुदाय संरचना महत्वपूर्ण हो सकता है यदि अधिक प्रतिकृति विश्लेषण के लिए उपलब्ध थे ।

संयुक्त क्षेत्र, प्रयोगशाला, और विश्लेषणात्मक प्रोटोकॉल यहां वर्णित कैसे विभिंन कारकों का अध्ययन करने के लिए एक शक्तिशाली विधि प्रदान मिट्टी, rhizosphere, और३६जड़ों के endosphere में माइक्रोबियल समुदायों की संरचना को प्रभावित करते हैं । विशेष रूप से कृषि क्षेत्रों में अध्ययन microbiomes के क्षेत्र में किया जाना काम का एक बड़ा सौदा है । कैसे पैदावार मिट्टी microbiome द्वारा बदल रहे है के बारे में महत्वपूर्ण सवाल अभी तक पूरी तरह से आविर्भाव हो । यहां तक कि सबसे बुनियादी सवालों के बारे में कैसे फसल rotations मिट्टी microbiome, कैसे समय बदल microbiome, कैसे अजैव तनाव microbiome बदल, कैसे मिट्टी के प्रकार इन कारकों के साथ सूचना का आदान प्रदान microbiome बदलने के लिए, और क्या वहां है कुछ फसलों या संयुक्त राज्य अमेरिका के क्षेत्रों में सार्वभौमिक रोगाणुओं सभी खुले सवाल कर रहे हैं । इन पद्धतियों की उपस्थिति और रोगजनक और लाभकारी बैक्टीरिया की दृढ़ता की पहचान करने के लिए महामारी विज्ञान के अध्ययन के लिए भी उपयोगी होगा । इन तरीकों के लिए एक और भविष्य के क्षितिज डीएनए संयंत्र और सूक्ष्म जीव आरएनए और metabolite डेटा के साथ यहां वर्णित तरीकों का घालमेल शुरू हो जाएगा । अतिरिक्त सुधार और अधिक चर के परीक्षण इन प्रोटोकॉल के आगे अनुकूलन के लिए महत्वपूर्ण हो जाएगा ।

Disclosures

लेखकों का खुलासा करने के लिए कुछ नहीं है ।

Acknowledgments

इस पांडुलिपि के विकास को नेशनल साइंस फाउंडेशन EPSCoR सेंटर फॉर रूट एंड Rhizobiome इनोवेशन अवार्ड OIA-१५५७४१७ ने समर्थन दिया है । डेटा संग्रह नेब्रास्का के विश्वविद्यालय से धन लिंकन, कृषि अनुसंधान और विकास और USDA से एक हैच अनुदान द्वारा समर्थित किया गया था । हम भी usda-ARS से समर्थन स्वीकार करते है और समर्थन कृषि और खाद्य अनुसंधान पहल प्रतिस्पर्धात्मक खाद्य और कृषि के USDA राष्ट्रीय संस्थान से अनुदान no 2011-68005-30411 द्वारा प्रदान की गई थी स्थापित करने और इन क्षेत्रों का प्रबंधन ।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Dneasy PowerSoil HTP 96 Kit Qiagen/MoBio 12955-4 Extraction kit for soil and rhizosphere
Dneasy PowerPlant HTP 96 Kit Qiagen/MoBio 13496-4 Extraction kit for roots
D-Handle Digging shovel, 101 cm L Fiskars 9669
Rapid Tiller, 40 cm L Truper 34316
Ziploc Bags, 17.7 cm x 19.5 cm Ziploc NA
Cooler Any NA
Wash pan Any NA
Plastic bucket Any NA
Gloves (work and lab) Any NA
20 cm diameter Soil sieve #8, 2360 μm mesh size Dual Manufacturing Co., Chicago IL US8-8FS
20 cm diameter Soil Sieve #4, 4750 μm mesh size Dual Manufacturing Co., Chicago IL US8-4FS
portable generator Honda brand works well NA
Sterile cell strainers 100 μm mesh size Fisher Scientific 22-363-549
NaH2PO4·H2O VWR 0823
Na2HPO4 VWR 0404
Silwet L-77 Lehman Seeds VIS-30 Surfactant
Autoclaves Any NA
Drying Oven Any NA
Scale Any Any
Bleach CLOROX - household strength NA
Tween 20 Any NA
Liquid Nitrogen Any NA
Dry Ice pellets Any NA
Ethanol Any NA
11 cm precision fine point tweezers Fisher 17456209
18 cm Straight point specimen forceps VWR 82027-436
13.5 cm Pruning Scissors Fiskars 9921
2 mL tube Any NA
15 mL PP conical tube MIDSCI C15B
50 mL PP conical tube MIDSCI C50B
Ultrapure water Millipore-sigma Milli-Q Integral, Q-POD
Qubit 2.0 fluorometer Invitrogen Q32866
Qubit dsDNA HS Assay Kit Invitrogen Q32854 For DNA quantification of removed samples
QuantiFluor dsDNA System Promega E2670 For DNA quantification
96-Well Black with Clear Flat Bottom Plates Corning 3631
pPNA PCR Blocker PNA Bio PP01-50
mPNA PCR Blocker PNA Bio MP01-50
Genomic DNA from Microbial Mock Community B (Even Low Concentration) v5.1L, for 16s rRNA Gene sequencing BEI Resources HM782D
Adhesive 8 well-strips for plates VWR 89134-434
Stainless steel beads, 3.2 mm dia Next Advance SSB32
1 ml Assay block (DNA extraction plate for the Qiagen/MoBio Dneasy PowerPlant HTP Kit) CoStar 3959
antistatic PP weighing funnel, size small for soil/rhizosphere TWD Tradewinds, INC ASWF1SPK
antistatic PP weighing funnel, size x-small for root/leaf TWD Tradewinds, INC ASWFXSCS
Genie 2 Digital Vortex Scientific Industries SI-0236
Vortex adapter for 50 mL tubes Scientific Industries SI-H506
Mortar (100 mL) and pestle Any NA
Metal micro-spatula VWR 80071-672
Disposable antistatic microspatulas VWR 231-0106
Brown Paper bag 2# (10.95 cm x 6.19 cm x 20 cm) Duro 18402
5424 Centrifuge for 2 mL tube Eppendorf 22620461
Centrifuge for 96-well plate Sigma4-16S 81510
Centrifuge rotor for 50 mL tubes Sigma4-16S 12269 - Biosafe
KAPA HiFi DNA polymerase Kapa Biosystems

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References

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अलगाव और मिट्टी, Rhizosphere, और जड़ों में बारहमासी घास प्रयोगों में माइक्रोबियल समुदायों के विश्लेषण
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McPherson, M. R., Wang, P., Marsh, E. L., Mitchell, R. B., Schachtman, D. P. Isolation and Analysis of Microbial Communities in Soil, Rhizosphere, and Roots in Perennial Grass Experiments. J. Vis. Exp. (137), e57932, doi:10.3791/57932 (2018).More

McPherson, M. R., Wang, P., Marsh, E. L., Mitchell, R. B., Schachtman, D. P. Isolation and Analysis of Microbial Communities in Soil, Rhizosphere, and Roots in Perennial Grass Experiments. J. Vis. Exp. (137), e57932, doi:10.3791/57932 (2018).

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