Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove

Environment

Isolering og analyse av mikrobielle samfunn i jord, Rhizosphere og røtter i staude gresset eksperimenter

doi: 10.3791/57932 Published: July 24, 2018

Summary

Utgravningen av plante røtter fra feltet og behandling av prøver i endosphere, rhizosphere og jord er beskrevet i detalj, inkludert DNA utvinning og data analyse metoder. Dette papiret er utformet slik at andre laboratorier for å bruke disse teknikkene for studiet av jord, endosphere og rhizosphere microbiomes.

Abstract

Plante- og jord microbiome studier blir stadig viktigere for forståelse roller mikroorganismer spille i landbruket produktivitet. Hensikten med denne oppgaven er å gi detaljer om hvordan du raskt prøve jord, rhizosphere og endosphere av replikerte feltforsøk og analysere endringer som kan oppstå i de mikrobielle samfunnene eksempel type, behandling og plante genotype. Eksperimentet brukes til å vise disse metodene består av replikerte feltet tomter som inneholder to, rene, varme sesongen gress (Panicum virgatum og Andropogon gerardii) og en lav-mangfold gress blanding (A. gerardii, Sorghastrum nutans, og Bouteloua curtipendula). Kort, planter er utgravd, en rekke røtter er kuttet og plassert i fosfatbuffer, og deretter rystet for å samle rhizosphere. Røttene er brakt til laboratoriet på is og overflaten sterilisert med blekemiddel og etanol (EtOH). Rhizosphere er filtrert og konsentrert med sentrifugering. Utgravde jord fra rundt roten ballen er plassert i plastposer og brakt til lab der en liten mengde jord tas for DNA utdrag. DNA er utdraget fra røttene, jord og rhizosphere og deretter forsterkes med primere for V4 regionen 16S rRNA genet. Amplicons er i rekkefølge, og deretter analysert med åpen tilgang Bioinformatikk-verktøy. Disse metodene tillater forskere å teste hvordan mikrobielle samfunn mangfoldet og komposisjon varierer på grunn av prøvetype behandling, og plante genotype. Bruker disse metodene sammen med statistiske modeller, viser representant resultatene det er betydelige forskjeller i mikrobielle samfunn røtter, rhizosphere og jord. Metoder som presenteres her gir et komplett sett med trinn for hvordan du feltet prøver, isolere, pakke ut, kvantifisere, forsterke og sekvens DNA, og analysere mikrobielle samfunn mangfold og komposisjon i replikerte feltforsøk.

Introduction

Microbiome forskning har viktige implikasjoner for å forstå og manipulere Økosystemprosesser som næringsstoffer sykling, organisk materiale omsetning, og utvikling eller hemming av jord patogener1,2. Dette området av forskning har også stort potensial for å forstå konsekvensene av jord mikrober på produktiviteten av naturlige plantesamfunn og agroecosystems. Mens det er mange studier som har fokusert på jord microbiome i naturlige økosystemer, har færre fokusert på anlegget rhizosphere og endosphere mikrober i agroecosystems3. I Nebraska dominerer jordbruk landskapet over store deler av staten, gjør studiene i disse jord der agriculturally viktig avlinger dyrkes et viktig emne for forskning. Formålet med utredningen metoder er å gi forskerne en standardsettet med protokoller for å beskrive mikrobene finnes i agroecosystems, for å avgjøre hvordan planterøttene endre de mikrobielle samfunnene i rhizosphere og endosphere, og til slutt Forstå funksjonene disse mikrobene spille i jord helse og plante produktivitet.

Metoden som presenteres her er litt forskjellig fra metoder som brukes av andre4,5 i at dette papiret er rettet mot læring som mikrober er utelukkende i roten og hvordan de skiller seg fra mikrober umiddelbart utenfor roten i den rhizosphere. Den amplicon sekvensering brukt i denne studien identifiserer de mikrobielle taxa i DNA-prøve og lar etterforskere til å bestemme hvordan samfunnene endres avhengig av prøvetype eller behandling. En av de viktigste forskjellene mellom denne protokollen og en veldig lignende protokoll brukes av Lundberg et al. 6 er at i stedet for sonication, denne protokollen bruker overflaten sterilisering med blekemiddel og etanol fjerner rhizosphere fra røttene. Andre har også brukt overflaten sterilisering effektivt7,8,9,10. Disse metodene er ikke mer fordelaktig enn andre metoder, men litt annerledes. Disse metodene er spesielt godt egnet for store felteksperimenter fordi med nok folk er det mulig å behandle over 150 feltet tomter per dag, som legger opp til ca 450 prøver når delt i endosphere, rhizosphere og jord. Dette manuskriptet beskriver i detalj metoder brukt for å prøve i feltet, behandle materialet i laboratoriet, ekstra og sekvens DNA, og gir en kort oversikt over trinnene for å analysere sekvensering resultatdataene.

Protocol

1.-feltet Beskrivelse

  1. Beskriv eksperimentelle feltet områder i samlingen perioder. Bestemme plasseringen av feltet (breddegrad, lengdegrad og høyde) bruk en GPS.
  2. Beskrive prøvetaking dybde, prøvetidspunkt og jord tekstur.
  3. Miljøfaktorer spille en viktig rolle i utformingen av mikrobielle samfunn. Spille klimainformasjon om årlige middeltemperaturen, årlig nedbør, tidligere års vekstskifte, jordarbeiding praksis, metoden for befruktning, og feltet stedets historie. Automatisert værstasjoner eller andre enheter er nyttig å registrere daglig nedbør og temperatur over en vekstsesong.

2. innsamling og behandling av jord, Rhizosphere og rot feltet prøver

  1. Utgravningen av planter.
    1. Merke en vask panne og bøtte med en klistrelapp som inneholder informasjon om plantemateriale som skal avsøkes. Inkluderer informasjon som plott, plante genotype og plantearter. Bærer merket bøtte til handlingen og etterlate vask pannen ved etablert i feltet.
    2. Pierce jord med en spade til et dyp på 30 cm å kutte noen av lateral røttene holde anlegget i jord. Omtrentlig volumet er 18 cm3. Tilfeldig velge og samle to planter per tomten fra ulike områder innen tomten.
    3. Grave planterøttene ved å utnytte spade og plasser roten ballen i merket bøtte. Bringe merket bøtte med utgravde roten ballen tilbake til arbeidsstasjonen i feltet. Avskåret og forkaste aboveground anlegget biomasse.
  2. Fjerning av røtter og samling av bulk jord.
    1. Riste røtter å manuelt fjerne jord eller bruke en spade eller en håndholdt tiller for å fjerne jord fra røttene. Risting røttene er tilstrekkelig å fjerne jord i svært sandholdig jord. Bruk hansker og plasser røtter behandling stasjon.
    2. Etter risting røttene, vil mesteparten av jord være i vask pannen. Bland jord i vask pannen og bryte opp noen jord klumper med en håndholdt ror. Plass et utvalg av jord som er fri for rusk i en merket, 17,7 x 19,5 cm glidelås lagringen bag og sted på et kjølig sted eller på is.
  3. Samling av røtter og rhizosphere.
    1. Med beskjæring saks sterilisert i 70% EtOH, avgiftsdirektoratet en rekke røtter, ca 4 til 6 røtter per plante og hver rot rundt 9-12 cm i lengde. Plasser forbrukeravgift røttene (kutte for å passe) i en merket 50 mL tube som inneholder 35 mL autoklaveres, fosfat-bufferen (6.33 finans NaH2PO4, 8,5 finans Na2HPO4 vannfri, pH = 6.5 200 µl finans surfactant).
      Merk: Surfactant (se Tabell of Materials) til etter autoklavering fosfat bufferen. Volumet av rot ballen og rot lengder varierer avhengig av anlegget alder og plantearter.
    2. Riste rør i 2 minutter å løslate rhizosphere fra overflaten av røttene. Med tang sterilisert i 70% EtOH, Fjern røttene fra tuben, blot kort på papir håndklær, og plasser i en ny, merket 50 mL tube. Plass begge røret som inneholder rhizosphere og den som inneholder røtter på is.

3. behandling av feltet eksempler i laboratoriet

  1. Overflaten sterilisering av røtter etter feltet samling.
    Merk: Utføre overflaten sterilisering så snart som mulig etter hjemkomsten fra feltet. Hvis det ikke er mulig å overflaten sterilisere røttene på samme dag, lagre røtter på 4 ° C til behandlet.
    1. Legge til ca 35 mL av 50% blekemiddel + 0,01% mellom 20 til 50 mL rot rør samlet i feltet. Riste 50 mL rør i 30 til 60 sekunder. Hell av 50% blekemiddel og legge 35 mL av 70% EtOH. Rist for en annen 30 til 60 sekunder.
    2. Hell av 70% EtOH og legge 35 mL steril, ultrapure vann. Riste i 1 minutt. Gjenta vann vask to ganger.
      Merk: For å sikre våre overflaten sterilisering behandling er nok, vi belagt prøver av vann fra siste skylling og observerte ingen vekst av bakterier (s. Wang, upublisert data, 2014). Andre etterforskere har testet for rot sterilisering effektivitet bruker lignende metoder9,10.
    3. Blot røtter tørr på ren papirhåndklær. Bruk en ren tørkepapir for hvert utvalg.
      Merk: Papirhåndklær kan steriliseres før bruk. Vi ikke sterilisere våre papirhåndklær. Men vi bruker 1 papirhåndkle per prøve og holde håndklær pakket til brukes.
    4. Sterilt tang og beskjæring saks, skjær røttene i ca 5 mm biter og sted kuttet røtter i en ren, merket 15 mL konisk rør. Lagre prøver-80 ° c før videre behandlet.
  2. Prosessering rhizosphere prøver.
    1. Riste 50 mL rør som inneholder rhizosphere prøver-feltet til å resuspend hele utvalget. Bruke en steril, 100 µm mesh celle sil (se Tabell for materiale), filter resuspended prøven i en ny 50 mL tube.
    2. Sentrifuge rør 3000 x g i 5 minutter ved romtemperatur. Umiddelbart hell av og kast nedbryting.
    3. Plass rhizosphere pellets i 50 mL rørene på is. Legge til 1,5 mL steril fosfatbuffer (uten surfactant) rhizosphere pellets og vortex å suspendere.
    4. Pipetter suspendert væske inn i et rent, merket, 2 mL microfuge rør. Spinne rør 15,871 x g i 2 minutter ved romtemperatur. Umiddelbart hell av nedbryting og avløp rørene på ren papirhåndklær.
    5. Lagre pellets på 20 ° C til ytterligere behandlet.
      Merk: Trinn 3.2.2 - 3.2.4 er gjort for å redusere tube utvalgsstørrelsen for lagring. Det er mer plass effektivt å lagre mindre 2 mL rør forhold til 50 mL rør.
  3. Behandler jordprøver for DNA utvinning og jord analyse.
    1. Bruker sterilt metall spatula, fylle en ren, merket 2 mL tube med ca 3 g jord for DNA utvinning. Unngå lite rot stykker og rusk. Lagre eksempelfilen jord på 20 ° C. Skyll metall spatula i 70% EtOH mellom hvert utvalg.
    2. I en ren vask panne, tømme posen av jord i stablet sikter (se Tabell for materiale), større sil over mindre silen og manuelt sil jord gjennom begge sikter. Bruk pensel til å Rengjør sikter mellom eksempler.
    3. Avsette 100 til 125 g soldet jord i en 17,7 x 19,5 cm zippered bag for fremtidige jord mekanisk- og tekstur analyse. Plass poser av jord i 4 ° C for kortsiktige lagring.
  4. Behandler jordprøver for fuktighet i jorda.
    1. Tara en merket brun papirpose på en skala. Mål 40 45 g soldet jord i brun papirpose. Registrere vekten av brun papirpose og jord på et dataark og sted poser i tørking ovn satt til 55-60 ° C.
    2. Etter 72 timer, fjerne poser fra tørking ovnen. Tillate jord poser avkjøles i minst 30 min og deretter veie.
    3. For å registrere vekten, Tara skalaen til null og Plasser de brune papirposer på skalaen. Beregning av jordfuktighet for hvert utvalg bruker formelen:
      Equation
      Merk: Metoden jord fuktighet er fra Kellogg biologiske stasjon lang sikt økologiske forskning (KBS LTER). KBS LTER gir en rekke etablerte protokoller for forskere på deres hjemmeside (https://Lter.kbs.msu.edu/).

4. forberedelse av behandlet rot eksempler for DNA utdrag.

  1. Grind frosne Rotmateriale slik at prøven er homogen.
    1. Hell flytende nitrogen i en plast kanne med rene spatler og en ren morter å holde prøver frosset hele sliping prosessen.
    2. Plasser frossent i mørtelen og male med støter til et fint pulver. Legger stadig til flytende nitrogen gjennom sliping å oppbevare prøver frosset.
    3. Bruk en slikkepott til å plassere bakken vev i en ren, merket 2 mL tube. Butikken på-80 ° C.

5. utvinning av DNA fra jord og Rhizosphere prøver i 96-brønnen Format

  1. Laster inn jordprøver i 96-brønnen platene.
    1. Tørke ned arbeidsområdet med 70% EtOH og 1% blekemiddel. Bruk lab hansker i disse trinnene. Fjerne jord prøvene fra 20 ° C lagring og la tine i en isen bøtte.
    2. Fjern tetting mat dekselet fra en 96-brønns utvinning plate som følger med DNA utvinning kit. Plass tetting mat dekselet mellom 2 materiale som papirhåndklær å holde ren mens den ikke er i bruk. Å unngå forurensning, bruke selvklebende 8-vel PCR strimler for å dekke 12 kolonnene i 96-brønnen utvinning platen.
    3. Tara en steril veie-trakt (størrelse SM) på en skala og veier ut 200 til 250 mg av jord.
      Merk: Disse sterilt trakter er flat på den ene siden så trakten ligger flatt på en skala. Trakten er fylt med jord og plassert direkte inn i en brønn. Denne teknikken unngår tap av prøver, minimerer søl og forhindrer kryss-smitte.
    4. Avdekke den første brønnen av utvinning plate, nøye løft selvklebende stripen, sted av fylt veie-trakten til riktig godt, og forsiktig guide jordprøve i riktig brønnen. Erstatte lim stripen for å dekke brønnen.
    5. Gjenta denne prosessen for hver godt av plate, med en ny, sterile trakt for hver prøve til platen er fylt. La en godt tom som en tom kontroll for utvinning.
      Merk: En godt tomt på hver utvinning-plate for å tjene som en negativ (tom). Kontrollerer for miljøgifter som kan finnes i kit reagenser11.
    6. Erstatte tetting mat dekselet på utvinning plate og lagre platen ved 20 ° C til du er klar for DNA utvinning.
  2. Laster inn rhizosphere prøver i 96-brønnen platene.
    1. Fjerne rhizosphere prøvene fra 20 ° C lagring og la tine i en isen bøtte.
    2. Følg fremgangsmåten ovenfor for å forberede DNA utvinning platen 5.1.2.
    3. Plasser en ren papir tørke på en skala og Tara sterilt metall spatula på skalaen. Bruk spatula å nøye scoop ut noen av rhizosphere pellets fra et utvalg rør. Veie mellom 200 og 250 mg rhizosphere prøven hjem spatula til skala.
    4. Forsiktig løfte selvklebende stripen å avdekke den første brønnen av utvinning plate, vinkel fylt spatula i brønnen og skrape av rhizosphere materialet i riktig brønnen med en bakteriefri tannpirker.
    5. Skyll metall spatula i vann, etterfulgt av 70% EtOH mellom eksempler. Gjenta denne prosessen for hver godt av platen til platen er fylt, forlate en godt tom som en tom kontroll for utvinning.
  3. Utvinning av DNA fra rhizosphere og jord prøvene i 96-brønnen format.
    1. Ekstra jord og rhizosphere DNA bruker en kit optimalisert for jord (se Tabell for materiale), etter produsentens protokoll.
      Merk: Vi bruker denne bestemte kit for å isolere jord og rhizosphere DNA hensyn til evnen av proprietære reagensene fjerne humic syre og andre kraftige PCR hemmere finnes i jord.
  4. DNA kvantifisering.
    1. Kvantifisere 92 prøver og 4 konsentrasjoner av standard med en kit (se Tabell for materiale; standarder er inkludert), i henhold til produsentens protokollen.
    2. Kvantifisere resterende 4 prøvene som ble fjernet fra platen til brønner for fire standarder ved hjelp av en kit (se Tabell for materiale), i henhold til produsentens protokollen.

6. utvinning av DNA fra roten eksempler i 96-brønnen Format.

  1. Laster inn roten prøver i 96-brønnen platene.
    1. Tørke ned arbeidsområdet med 70% EtOH og 1% blekemiddel. Bruk hansker i disse trinnene.
    2. Holde bakken rot prøver frosset i alle tider ved å plassere prøver i en bøtte med tørris.
    3. Fylle en plast beaker med flytende nitrogen og plasser antistatiske microspatulas og sterile veie-trakter (størrelse XSM) i plast begeret avkjølt.
    4. Fjern tetting mat dekselet fra 96-brønns utvinning perle platen som følger med kit og plasser den mellom 2 materiale som papirhåndklær å holde ren mens den ikke er i bruk.
      Merk: Den nyere versjonen av denne kit, utgitt etter den tid vi utført disse DNA utdrag, krever at brukeren å levere utvinning perle platene. I Tabellen for materiale, har vi listet katalogen leverandørinformasjonen måtte bestille disse artiklene.
    5. Å unngå forurensning, bruke selvklebende 8-vel PCR strimler for å dekke 12 kolonnene i 96-brønnen utvinning platen.
    6. Sted utvinning perle plate tørris å oppbevare prøver i brønnene frosset.
    7. Nøye løft selvklebende stripen å avdekke den første brønnen av utvinning plate, sett av fylt veie-trakten i riktig brønnen og legge 3 slikkepott kuler av bakken rot vev. Erstatte lim stripen for å dekke brønnen.
      Merk: Jord og rhizosphere tint på is før veier, mens plantemateriale veies frossen. Frosne anlegget vev, spesielt små mengder, er vanskelig å veie på en skala uten tining. Veie testene ble gjort på bakken rot vev å avgjøre hvor mange slikkepott kuler var tilstrekkelig. Merk at produsenten av kit krever ikke en nøyaktig mengde vev, men anbefaler rundt 50 mg. ulike anlegg prøven vil variere, og brukeren må bestemme riktig.
    8. Gjenta denne prosessen for hver godt av platen til platen er fylt.
    9. Lagre platen ved 20 ° C til du er klar for DNA utvinning.
  2. DNA utvinning av rot vev.
    1. Ekstra DNA ved å bruke en kit optimalisert for planter (se Tabell for materiale) etter produsentens protokoll.
      Merk: Vi bruker dette settet som er utviklet spesielt for plante vev for å oppnå maksimal avkastning fra roten prøvene. I motsetning til jord og rhizosphere er humic syre og andre forurensninger mindre problem for rot vevet.
  3. Kvantifisere DNA som i trinn 5.4.

7. forsterkning og sekvensering isolert DNA.

  1. Forsterke V4 regionen 16S genet med et bevis lese utvalg (se Tabell for materiale) som beskrevet i Gohl et al. 12 strekkode prøver med forskjellige indeksering primere og basseng før sekvensering. Rekkefølge ved hjelp av metodene beskrevet av Gohl et al12 en PCR totrinnsprosess med V4 primere (ekstra fil 1).
    Merk: Noen av metodene for fremgangsmåten er beskrevet i detalj andre steder12,13,14 og derfor ikke er beskrevet her. For roten prøver, ble PNA blokkering lagt til redusere plastid DNA forsterket fra anlegget vevet, som har vært fullt ut beskrevet15. To kontroller ble brukt i sekvensering, en negativ kontroll som inkluderte utvinning plate tom kontrollene (se merknad etter trinn 5.1.5), og en uekte kjent innbyggere bakteriell DNA (se Tabell for materiale) som tjente som en positiv kontroll.
    Merk: MiSeq reagens Kits v3 brukes oftest i 2 X 300 base sammenkoblede sluttmodus. For prøvene i dette manuskriptet, ble Illumina HiSeq 2500 brukt i rask modus med 250 parvise-end (2 x 250) modus. Alle prøven ble sekvensert i samme kjørefelt.
  2. Behandle sekvensering dataene gjennom en rørledning for mikrobiell samfunnet analyser (USEARCH v9.2.64, QIIME v1.9.1 og RStudio v3.4.3 16).
    1. Forberede sekvensering dataene med USEARCH17.
      Merk: USEARCH er tilgjengelig online med full instruksjoner (https://www.drive5.com/usearch/).
    2. Demultiplex sekvensering dataene med indeks leser eller strekkoder tilordne Illumina leser smakebiter.
    3. Flette sammen-end-leser for å få konsensus sekvenser. Bruke kommandoen: usearch-fastq_mergepairs * R1*.fastq-relabel @ - fastq_maxdiffs 10 - fastq_minmergelen 230 - fastq_maxmergelen 320 - fastq_pctid 80 - fastqout merged.fq.
      Merk: Parametrene er satt gjennom henviser USEARCH bruksanvisningen.
    4. Fjerne primerne fra sekvensering data å unngå erstatninger i primer sekvenser, som skyldes PCR reaksjonen. Bruke kommandoen: usearch-fastx_truncate merge.fq - stripleft 19 - stripright 20 - fastqout stripped.fq.
    5. Filtrere sekvensering data for å fjerne den lav kvalitet lest og holder høy kvalitet taksonomisk driftsenhet (OTU) sekvenser. Bruke kommandoen: usearch-fastq_filter stripped.fq-fastq_maxee 1.0 - fastaout filtered.fa.
  3. Generere OTUs i USEARCH.
    1. Utføre dereplication for å identifisere settet med unike OTU sekvenser. Bruke kommandoen: usearch-fastx_uniques filtered.fa - fastaout uniques.fa - sizeout-relabel Uniq.
    2. Klynge OTUs med 97 – 100% sekvens likheten til å angi de unike OTUs. Bruke kommandoen: usearch-cluster_otus uniques.fa - minsize 2 - otus otus.fa-relabel Otu.
      Merk: Dette trinnet omfatter også fjerning av singletons fra de grupperte OTUs og fjerning av chimeras sekvensering data.
    3. Opprette en OTU-tabell i USEARCH. Bruke kommandoen: usearch-usearch_global stripped.fq - db otus.fa-tråd pluss - id 0,97 - otutabout otutable.txt.
      Merk: Denne kommandoen genererer en tabell med mange leser (teller) av alle OTUs for hvert utvalg. Tabellen OTU brukes til nedstrøms trinn inkludert differensial overflod analyser og mikrobiell mangfold analyser. Eksempel på OTU tabell vises i supplerende figur 2.
    4. Utfør en rarefaction analyse QIIME v1.9.1 18.
      Merk: Rarefaction kurven beregnes ved hjelp av tabellen OTU å finne ut om dybden av sekvensering riktig prøver mikrobiell samfunnet. Eksempel på rarefaction kurver vises i supplerende figur 3.
    5. Gjennomføre en alfa mangfold analyse18. Bruke alpha_rarefaction.py i QIIME v1.9.1 for å beregne mangfoldet i det mikrobielle samfunnet i hver prøve.
      Merk: Denne analysen beregner mangfold indekser som Shannon19, Simpson20og Chao121.
    6. Gjennomføre en beta mangfold analyse18,22. Bruke Python-skript: beta_diversity_through_plots.py i QIIME v1.9.1 Bray-Curtis dissimilarity matrise.
      Merk: Denne analysen sammenligner mikrobielle samfunn sammensetningen mellom eksempler.
    7. Utføre statistiske analyser mellom grupper. Bruk avstand matriser beregnet for PERMONOVA bruke funksjonen adonis og anova vegan pakken23 v2.4.5 i RStudio16. Utfør kanoniske analyse av rektor koordinater (CAP) analyse ved hjelp av funksjonen capscale i vegan pakken. Visualisere data med ggplot2 pakke24 v2.2.1 i RStudio.

Representative Results

Representant resultatene presentert i dette manuskriptet kommer fra et felt nettsted etablert i 2012 ved University of Nebraska-Lincoln landbruk forskning divisjon gården i nærheten Mead, NE. før eksperimentet, nettstedet har blitt håndtert som en korn-soyaolje rotasjon . Studien området lå på tre ulike typer jord, men dataene ble analysert som om alle endringer i målt jordegenskaper skyldtes behandlinger pålagt.

Webområdet feltet inneholdt to, ren, står switchgrass (P. virgatum cv frihet) og store bluestem (A. gerardii), i tillegg til en lav-mangfold gress blanding med store bluestem, indiangrass (S. nutans) og 'Butte' sideoats grama) B. curtipendula). Tre varme sesongen gress tomter var i en randomisert fullstendig bolk design som ble replikert tre ganger. Nestet i tre forskjellige gress tomter var to nitrogen (N) befruktning behandlinger, som var 56 (N1) og 112 (N2) kg N ha-1 av anvendt urea. Ved microbiome prøvetaking på slutten av vekstsesongen, jord inneholdt 8.0 ± 1.1 (gjennomsnittlig ± SD) ppm nitrat i tomter befruktet med 112 kg N ha-1 og 6.8 ± 0,7 (betyr + SD) ppm nitrat i tomter befruktet med 56 kg N ha-1. Tomter hadde blitt befruktet en gang i året. Varme sesongen gresset tomter ble utpekt som main plott (8000 m2) og N behandlinger var delt tomter (4000 m2). Store bluestem ble sådd som en 50/50 blanding av "Bonanza" og "Gullgruve" og Indiangrass ble sådd som en 50/50 blanding av "Speideren" og "Warrior". Tomtene ble plantet i 2012, og det første N programmet skjedde våren 2013.

Jord og rot prøvetaking ble utført på 15 September 2014. Arbeidet beskrevet nedenfor ble utført på et felt som ble konfigurert som en delt-komplott randomisert design med tre replikat (figur 1). Gjennomsnittlig sekvensering dybden av alle prøver for endosphere var som følger: 4871 ± 5711 (gjennomsnittlig ± SD), rhizosphere: 40726 ± 14684, jord: 38184 ± 9043. En av de største kildene til variasjon i disse eksperimentene, ved hjelp av metodene beskrevet, er forskjellen i mikrobielle samfunn funnet mellom utvalg (figur 2). I denne representant datasett synes rhizosphere og jord å være mer like i sammensetning til hverandre enn endosphere (figur 2A). Men det var også svært signifikant (p = 0,001) forskjeller i mikrobielle samfunn sammensetningen mellom rhizosphere og jord (figur 2B). Totalt variasjonen regnskapsføres i disse forsøkene analysert av prøven var 26%.

Alpha mangfold analyse viste at de mikrobielle samfunnene i endosphere var lavere i utvalg mangfold i forhold til jord og rhizosphere (Figur 3). Det eneste betydelige forskjellene i mangfold mellom gressarter i alle rom var mellom de endosphere prøvene av store bluestem og switchgrass, med switchgrass har betydelig høyere mikrobiell artsmangfoldet (Figur 3). Den relative overflod analysen (Figur 4) høydepunkter av Proteobacteria etterfulgt av Actinobacteria i alle prøve typer. Jord og rhizosphere er også dominert av AcidobacteriumGeothrixHolophagaChloracidobacterium og Chloroflexi mens endosphere hadde en større relative overflod av Bacteriodetes.

I dette eksperimentet, planter ble dyrket med to ulike mengder N gjødsel og derfor vi analyserte data for å fastslå om det var behandling effekter. Behandling effekter utgjorde 12% av den totale varianten, men var ikke signifikant forskjellig selv om ordineringen de to behandlingene se forskjellige (figur 5). Dette understreker viktigheten av statistiske analyser for disse datasett stedet visuell inspeksjon eller kvalitative vurderinger.

Plante-påvirket forskjeller i microbiome av anlegget vev og jord var visualisert bruke en begrenset ordinasjon. Statistisk forskjellene var fast bestemt på å bruke en PERMANOVA analyse for å teste om bestemte variabler, som arter, føre signifikant forskjellig mikrobielle samfunn sammensetningen mellom eksempler. Når alle prøve typer ble analysert sammen, fant en svært betydelig forskjell i mikrobielle samfunn sammensetning på grunn av plantearter (figur 6). I dette eksperimentet var hvor mye variasjon regnskapsføres etter plantearter 6,7%. Til slutt ble hver eksempel type analysert individuelt for å finne ut hvilke av de eksempler kan kjøre betydelig plante arter effekten. Bare i endosphere var der en svært betydelig forskjell (p = 0,001) mellom mikrobielle samfunn komposisjoner av forskjellige plantearter (figur 7). I andre eksempel typer var arter effekten ikke betydelig når analysert individuelt. Endosphere var den prosent variasjonen skyldes arter 27%, mens det var lavere i rhizosphere (18%) og jord (15%). Dette ytterligere understreker viktigheten av å analysere hver vev type individuelt.

Figure 1
Figur 1: eksempel av eksperimentelle feltet. Eksperimentell feltutforming illustrerer en randomisert fullstendig bolk design i tre eksemplarer av feltet nettstedet University of Nebraska-Lincoln østlige Nebraska forskning og Extension Center nær Mead, NE. Full området Beskrivelse kan du se delen resultater. N1 er lav (56 kg N ha-1 urea) og N2 (112 kg N ha-1 urea) er høyere nitrogen kursen som ble brukt. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 2
Figur 2: Beta mangfold analyse sammenligne mikrobiell sammensetningen i forskjellige utvalg typer inkluderer endosphere, rhizosphere og jord fra staude gresset prøvetaking i 2014. Analyse ble gjennomført med et Python-skript i QIIME1.9.1 for å produsere Bray-Curtis dissimilarity matrix. Viktigste koordinater analyse (PCoA) basert på Bray-Curtis dissimilarity matrix var visualisert i RStudio. PCoA1 og PCoA2 angir første og nest største variansen forklares med PCoA analysen. PERMANOVA statistisk analyse var utført for å avgjøre betydningen mellom prøven, og p verdien vises øverst til høyre. Hvert symbol i tallene representerer hele mikrobiell samfunnet for hvert utvalg. (A) Endosphere, rhizosphere og jord eksempel typer ble analysert sammen. Alle 87 prøvene var sjeldne i 486 sekvenser per prøve. (B) Rhizosphere og jord ble analysert sammen. Alle 59 prøvene var sjeldne med 8231 sekvenser. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 3
Figur 3: Alpha mangfold analyse ved hjelp av Shannon indeks for hver art i endosphere, rhizosphere og jord. Analyse ble gjennomført med et Python-skript i QIIME1.9.1. Rarefaction ble gjort for endosphere, rhizosphere og jord eksempel typer henholdsvis med 486, 17154 og 8231 sekvenser per prøve. Bokser angir de 25 og 75te persentil (første og tredje kvartiler). Den vannrette linjen i boksen angir median og røde pluss viser middelverdien. Værhår vise dataområdet i unntatt outliers (som er vist som sorte prikker) som falt mer enn 1,5 ganger interquartile området (n = 6 for hver prøve bortsett fra sideoats grama blande hvor n = 5). Shannon indeksen for alle fem arter i endosphere var lavere enn både rhizosphere og jord. Ikke-parametriske Diversified rang summen test ble brukt til å bestemme betydningen mellom arter og bare betydelige forskjeller mellom arter ble vist på boksene. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 4
Figur 4: Relative overflod på rekke nivået i endosphere, rhizosphere og jord. Prøvene ble analysert for å sammenligne overflod av mikrobielle stamtreet blant forskjellige prøver typer (n = 29 for hver eksempel). Analyse ble gjennomført med et Python-skript i QIIME1.9.1 fra tabellen OTU. De forskjellige fargene i sektordiagrammet betegne stamtreet. Prosentandelen angir den relative overfloden av hver rekke i hver prøvetype. Rekke informasjonen ble merket med Ribosomal databaseprosjektet klassifiserer (RDP)25. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 5
Figur 5: analyse ved hjelp av behandling som egenskapen faktor mellom alle eksempel. Kanoniske analyse av rektor koordinater (CAP) analyse var utført for å avgjøre om det var forskjeller i mikrobielle samfunn sammensetningen mellom behandlingene. For hver N behandling, n = 42 for N1 (56 kg N ha-1) og n = 45 for N2 (112 kg N ha-1). Bray-Curtis dissimilarity matrix ble generert ved hjelp av et python-skript i QIIME1.9.1. CAP analyse basert på Bray-Curtis dissimilarity matrix ble gjort av begrensende behandling som faktor i RStudio. PERMANOVA-analyse ble gjennomført for å fastslå om behandling forskjellene var betydelig, og p verdien vises øverst til høyre. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 6
Figur 6: analyse ved hjelp av plantearter som egenskapen faktor mellom alle eksempel. Analyse ble gjennomført for å fastslå om det var forskjeller i mikrobielle samfunn sammensetningen mellom plantearter i alle prøve typer. Viktigste koordinater koordinering og CAP analyse av alle utvalg (endosphere, rhizosphere og jord) ble gjort ved hjelp av en Bray-Curtis dissimilarity matrise. Bray-Curtis dissimilarity matrix ble generert ved hjelp av Python-skript i QIIME1.9.1. CAP analyse basert på Bray-Curtis dissimilarity matrix ble gjort av begrensende plantearter som faktor i RStudio. PERMANOVA statistisk analyse var utført for å avgjøre betydningen mellom plantearter og P verdien vises øverst til høyre. Hvert symbol i tallene representerer hele mikrobiell samfunnet for den prøven. n = 18 til hver art i alle prøve typer unntatt n = 15 for sideoats grama blanding. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 7
Figur 7: eksempel på CAP analyse med arter som egenskapen faktor for hver eksempel individuelt. Viktigste koordinere koordinering og CAP analyse av hver eksempel (endosphere, rhizosphere og jord) bruker Bray-Curtis dissimilarity matrise. Hver eksempel type var sjeldne 486, 17154 og 8231 leser per eksempel henholdsvis i endosphere, rhizosphere og jord. Arter ble brukt som faktor for å begrense ordineringen. PERMANOVA statistisk analyse var utført for å avgjøre betydningen mellom plantearter i hver eksempel type, og p verdien vises øverst til høyre. Hvert symbol i figuren representerer hele mikrobiell samfunnet for hvert utvalg. Utvalgsstørrelsen er n = 29 for hver prøve, n = 6 for hver plantearter i hver prøvetype unntak sideoats grama mix (n = 5). Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Discussion

Metodene som er beskrevet i dette manuskriptet bør aktivere forskere å lett inn i feltet av jord og plante metagenomics. Gjennom årene har vi forbedret våre metoder siden gjennomføre eksperimentet beskrevet i dette manuskriptet. Én endring er at vi nå pre etiketten rør før du går ut til feltet utvalg. Våre lab bruker en barcoding og en etikettskriver. Etikettrykkeren ikke bare sparer tid da merking rør, men også gjør alt enklere å spore og identifisere prøver uten vagaries av menneskelig hånd skriver. En annen kritisk punkt er at vi prøver å behandle materialet etter å bringe det tilbake fra feltet så snart som mulig. Vi ønsker å fryse jord brukes for DNA-analyse, sterilisere og fryse røttene, og filtrere og fryse rhizosphere innen 12 36 timer etter hjemkomsten fra feltet. DNA utvinning prosedyrene er lang med mange trinn, spesielt for jord og rhizosphere, så vi kjøpte en robot (Kingfisher Flex, ThermoFisher) som minimerer hendene på tiden for DNA utvinning protokoller, reduserer menneskelig feil som kan være innført, og forbedrer konsekvensen i de helt forskjellige grupper av jord, røtter eller rhizosphere behandles. Når du arbeider med plantemateriale er det viktig å bestemme hvilken rot å bli studert eller å ta en rekke rot typer å få et "representativt utvalg". Opprettholde røtter og forlater i en frossen tilstand når gjennomføre DNA utdrag er viktig, som er å sikre det er ingen krysskontaminering mellom eksempler Når du fyller 96-brønns DNA utvinning plater. En annen viktig faktor å vurdere er antall gjentak skal brukes når designe felteksperimenter og bruker en komplett randomisert design mulig26. Det kan være nødvendig å ha et stort antall gjentak å oppdage små forskjeller på grunn av høy feltet variasjon. Endelig erfaring er det viktig å sørge for jord ikke er for våt når graving røttene. Hvis jord er mettet med vann det er ikke bare rotete å jobbe med, men det er også svært vanskelig å definere rhizosphere og fjerne jord fra røttene.

En endring som ble gjort tidlig under utviklingen av disse metodene ble i stedet for risting rør for hånd for å frigjøre rhizosphere vi oppgradert til vortexers drevet av en gass generator å gjøre arbeidet enklere i feltet og mer standardisert i form av tid og måte at hver rør var urolig. En begrensning av amplicon sekvensering tilnærming er at taksonomisk oppløsningen av resultatene er ofte begrenset og mange OTUs er ukjent eller bare kjent på familie- eller slekt. Dette feltet forskning raskt utvikler seg så det er viktig å være klar over nye og utviklingsland tilnærminger, spesielt for dataanalyse som kan øke oppløsningen til resultatene.

Disse protokollene er bare for å studere bakterier og archaea, ikke sopp. Bruk av forskjellige primere for forsterkning vil tillate studiet av sopp fellesskap med de samme DNA prøver27,28. Disse metodene krever ikke kjøp av store mengder utstyr fordi metodene kan forenkles. Metodene vi beskriver her er hovedsakelig for å bestemme "som er det", men feltet raskt utvikler seg til be viktige spørsmål om funksjonen, som kan rettes ved å bruke hagle sekvensering metoder, isolasjon og testing av funksjonaliteten til mikrober, eller sekvensering hele mikrobielle genomer.

Representant resultatene Uthev forskjellene i mikrobielle samfunn som kan identifiseres ved hjelp av metodene beskrevet. Bruker en beta-mangfold tilnærming til data analyse22, ble kompositoriske forskjeller vist mellom eksempler. Disse forskjellen er tydelig observert i de fleste andre studier der endosphere, rhizosphere og jord inneholder unike mikrobielle samfunn3. Shannon mangfoldet indeksen ble beregnet for å finne overflod og jevnhet av mikrobielle arter finnes i hver plantearter i endosphere, rhizosphere og jord. Som vist i denne studien og mange andre, er alfa mangfold høyest i jord, ned litt i rhizosphere og reduserer betydelig i de endosphere3,5,29. Disse resultatene indikerer at metodene som er beskrevet her er egnet for å identifisere kompositoriske endringer i endosphere, rhizosphere og jord.

Dominans av Proteobacteria er en vanlig funn i studier på endosphere og jord30,31,32. Endosphere har vanligvis et lavere mangfold av mikrobielle arter med en høyere relative overflod av Proteobacteria. Dette igjen understreker at resultatene her er representant for andre funn i litteraturen. Behandling effektene i denne studien var ikke signifikant forskjellig og to store grunner for det kan være at forskjellene pålagt av behandlingene ikke var stor nok til å generere nok variasjon til å oppdage og at tallgrunnlaget ble gjort på slutten av den voksende sesongen, når feltene kan ha hatt tid til å trekke ned nitrogen til lignende nivåer, som er det som ble målt på slutten av sesongen. I en annen studie med lignende befruktning priser over lengre tid, ble bare relativt små endringer i sammensetningen av microbiome målt33. Andre studier har vist endringer i både sopp og bakteriell samfunn på grunn av nitrogen gjødsel34,35.

Plantearter er kjent for å spille roller ved deres microbiomes3,32,36 og selv små forskjeller i mikrobielle samfunn variasjon er blitt demonstrert mellom ulike anlegg genotyper innenfor en én art37. I denne studien fant en betydelig forskjell i mikrobielle samfunn sammensetningen mellom plantearter. I alle prøve typer viste det seg at switchgrass hadde mest distinkte mikrobiell sammensetningen, men forskjellene mellom arter var bare statistisk signifikant i endosphere. Rhizosphere samfunnet komposisjon kan ha blitt betydelig hvis flere gjentak var tilgjengelig for analyse.

Den kombinerte feltet, lab og analytisk protokoller beskrevet her gir en kraftig metode for å studere hvordan ulike faktorer innflytelse sammensetningen av mikrobielle samfunn i jord, rhizosphere og endosphere av røtter36. Det er mye arbeid som må gjøres innen studerer microbiomes, spesielt i landbruket felt. Viktige spørsmål om hvordan avkastning er endret av jord microbiome har ennå å bli fullt belyst. Selv de mest grunnleggende spørsmålene om hvordan vekstskifter påvirke jord microbiome, hvordan timing endrer microbiome, hvordan abiotiske stress endrer microbiome, hvordan jordtype samhandler med disse faktorene for å endre microbiome, og om det er universell mikrober i visse avlinger eller regioner i USA er alle åpne spørsmål. Disse metodene vil også være nyttig for Epidemiologiske studier å identifisere tilstedeværelse og utholdenhet av sykdomsfremkallende og gunstige bakterier. En annen fremtidige horisonten for at disse metodene skal start integrere DNA-metodene som er beskrevet her med anlegget og mikrobe RNA og metabolitten data. Ytterligere forbedring og testing av flere variabler vil være viktig for videre optimalisering av disse protokollene.

Disclosures

Forfatterne ikke avsløre.

Acknowledgments

Utviklingen av dette manuskriptet er støttet av National Science Foundation EPSCoR Center for rot og Rhizobiome Innovation Award OIA-1557417. Datainnsamling ble støttet av midler fra University of Nebraska-Lincoln, landbruket forskning og utvikling og Luke stipend fra USDA. Vi erkjenner også støtte fra USDA-ARS og støtte ble gitt av landbruk og mat forskning initiativ konkurransedyktige tilskudd nr 2011-68005-30411 fra USDA National Institute of Food og landbruk til å opprette og administrere disse feltene.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Dneasy PowerSoil HTP 96 Kit Qiagen/MoBio 12955-4 Extraction kit for soil and rhizosphere
Dneasy PowerPlant HTP 96 Kit Qiagen/MoBio 13496-4 Extraction kit for roots
D-Handle Digging shovel, 101 cm L Fiskars 9669
Rapid Tiller, 40 cm L Truper 34316
Ziploc Bags, 17.7 cm x 19.5 cm Ziploc NA
Cooler Any NA
Wash pan Any NA
Plastic bucket Any NA
Gloves (work and lab) Any NA
20 cm diameter Soil sieve #8, 2360 μm mesh size Dual Manufacturing Co., Chicago IL US8-8FS
20 cm diameter Soil Sieve #4, 4750 μm mesh size Dual Manufacturing Co., Chicago IL US8-4FS
portable generator Honda brand works well NA
Sterile cell strainers 100 μm mesh size Fisher Scientific 22-363-549
NaH2PO4·H2O VWR 0823
Na2HPO4 VWR 0404
Silwet L-77 Lehman Seeds VIS-30 Surfactant
Autoclaves Any NA
Drying Oven Any NA
Scale Any Any
Bleach CLOROX - household strength NA
Tween 20 Any NA
Liquid Nitrogen Any NA
Dry Ice pellets Any NA
Ethanol Any NA
11 cm precision fine point tweezers Fisher 17456209
18 cm Straight point specimen forceps VWR 82027-436
13.5 cm Pruning Scissors Fiskars 9921
2 mL tube Any NA
15 mL PP conical tube MIDSCI C15B
50 mL PP conical tube MIDSCI C50B
Ultrapure water Millipore-sigma Milli-Q Integral, Q-POD
Qubit 2.0 fluorometer Invitrogen Q32866
Qubit dsDNA HS Assay Kit Invitrogen Q32854 For DNA quantification of removed samples
QuantiFluor dsDNA System Promega E2670 For DNA quantification
96-Well Black with Clear Flat Bottom Plates Corning 3631
pPNA PCR Blocker PNA Bio PP01-50
mPNA PCR Blocker PNA Bio MP01-50
Genomic DNA from Microbial Mock Community B (Even Low Concentration) v5.1L, for 16s rRNA Gene sequencing BEI Resources HM782D
Adhesive 8 well-strips for plates VWR 89134-434
Stainless steel beads, 3.2 mm dia Next Advance SSB32
1 ml Assay block (DNA extraction plate for the Qiagen/MoBio Dneasy PowerPlant HTP Kit) CoStar 3959
antistatic PP weighing funnel, size small for soil/rhizosphere TWD Tradewinds, INC ASWF1SPK
antistatic PP weighing funnel, size x-small for root/leaf TWD Tradewinds, INC ASWFXSCS
Genie 2 Digital Vortex Scientific Industries SI-0236
Vortex adapter for 50 mL tubes Scientific Industries SI-H506
Mortar (100 mL) and pestle Any NA
Metal micro-spatula VWR 80071-672
Disposable antistatic microspatulas VWR 231-0106
Brown Paper bag 2# (10.95 cm x 6.19 cm x 20 cm) Duro 18402
5424 Centrifuge for 2 mL tube Eppendorf 22620461
Centrifuge for 96-well plate Sigma4-16S 81510
Centrifuge rotor for 50 mL tubes Sigma4-16S 12269 - Biosafe
KAPA HiFi DNA polymerase Kapa Biosystems

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Philippot, L., Raaijmakers, J. M., Lemanceau, P., vander Putten, W. H. Going back to the roots: the microbial ecology of the rhizosphere. Nature Reviews Microbiology. 11, 789-799 (2013).
  2. Fierer, N. Embracing the unknown: disentangling the complexities of the soil microbiome. Nature Review Microbiology. 15, (10), 579-590 (2017).
  3. Wang, P., et al. Shifts in microbial communities in soil, rhizosphere and roots of two major crop systems under elevated CO2 and O3. Scientific Reports. 7, (1), 15019 (2017).
  4. White, L. J., Jothibasu, K., Reese, R. N., Brözel, V. S., Subramanian, S. Spatio Temporal influence of isoflavonoids on bacterial diversity in the soybean Rhizosphere. Molecular Plant-Microbe Interactions. 28, (1), 22-29 (2015).
  5. Edwards, J., et al. Structure, variation, and assembly of the root-associated microbiomes of rice. Proceedings of the National Academy of Science of the United States of America. 112, (8), E911-E920 (2015).
  6. Lundberg, D. S., et al. Defining the core Arabidopsis thaliana root microbiome. Nature. 488, 86-90 (2012).
  7. Bougoure, D. S., Cairney, J. W. Assemblages of ericoid mycorrhizal and other root-associated fungi from Epacris pulchella (Ericaceae) as determined by culturing and direct DNA extraction from roots. Environmental Microbiology. 7, (6), 819-827 (2005).
  8. Doty, S. L., et al. Diazotrophic endophytes of native black cottonwood and willow. Symbiosis. 47, (1), 23-33 (2009).
  9. Gottel, N. R., et al. Distinct microbial communities within the endosphere and rhizosphere of populus deltoides roots across contrasting soil types. Applied and Environmental Microbiology. 77, (17), 5934-5944 (2011).
  10. Xin, G., Glawe, D., Doty, S. L. Characterization of three endophytic, indole-3-acetic acid-producing yeasts occurring in Populus trees. Mycological Research. 113, 973-980 (2009).
  11. Salter, S. J., et al. Reagent and laboratory contamination can critically impact sequence-based microbiome analyses. BMC Biolology. 12, 87 (2014).
  12. Gohl, D. M., et al. Systematic improvement of amplicon marker gene methods for increased accuracy in microbiome studies. Nature Biotechnology. 34, (9), 942-949 (2016).
  13. Kozich, J. J., Westcott, S. L., Baxter, N. T., Highlander, S. K., Schloss, P. D. Development of a dual-index sequencing strategy and curation pipeline for analyzing amplicon sequence data on the MiSeq Illumina sequencing platform. Applied Environmental Microbiology. 79, (17), 5112-5120 (2013).
  14. Caporaso, J. G., et al. Ultra-high-throughput microbial community analysis on the Illumina HiSeq and MiSeq platforms. ISME Journal. 6, (8), 1621-1624 (2012).
  15. Lundberg, D. S., Yourstone, S., Mieczkowski, P., Jones, C. D., Dangl, J. L. Practical innovations for high-throughput amplicon sequencing. Nature Methods. 10, (10), 999-1002 (2013).
  16. RStudio, T. RStudio: Integrated Development for R. RStudio, Inc. Available from: http://www.rstudio.com/ (2015).
  17. Edgar, R. C. UPARSE: highly accurate OTU sequences from microbial amplicon reads. Nature Methods. 10, (10), 996-998 (2013).
  18. Caporaso, J. G., et al. QIIME allows analysis of high-throughput community sequencing data. Nature Methods. 7, (5), 335-336 (2010).
  19. Shannon, C. A mathematical theory of communication. Bell System Technical Journal. 27, 379-423 (1948).
  20. Simpson, E. H. Measurement of diversity. Nature. 163, 688 (1949).
  21. Chao, A. Non-parametric estimation of the number of classes in a population. Scandanavian Journal of Statistics. 11, 265-270 (1984).
  22. Legendre, P. Studying beta diversity: Ecological variation partitioning by multiple regression and canonical analysis. Journal of Plant Ecology. 1, (1), 3-8 (2008).
  23. Oksanen, J., et al. The vegan package. Community Ecology Package. 10, 631-637 (2007).
  24. Wickham, H. ggplot2: Elegant graphics for data analysis. Ggplot2: Elegant Graphics for Data Analysis. Springer Nature. Switzerland. 1-212 (2009).
  25. Cole, J. R., et al. The Ribosomal Database Project (RDP-II): sequences and tools for high-throughput rRNA analysis. Nucleic Acids Research. 33, D294-D296 (2006).
  26. Wagner, M. R., et al. Host genotype and age shape the leaf and root microbiomes of a wild perennial plant. Nature Communications. 7, 12151 (2016).
  27. O'Brien, H. E., Parrent, J. L., Jackson, J. A., Moncalvo, J. M., Vilgalys, R. Fungal community analysis by large-scale sequencing of environmental samples. Applied and Environmental Microbiology. 71, (9), 5544-5550 (2005).
  28. Taylor, D. L., et al. A first comprehensive census of fungi in soil reveals both hyperdiversity and fine-scale niche partitioning. Ecological Monographs. 84, (1), 3-20 (2014).
  29. Lebeis, S. L., et al. Salicylic acid modulates colonization of the root microbiome by specific bacterial taxa. Science. 349, (6250), 860-864 (2015).
  30. Ofek-Lalzar, M., et al. Niche and host-associated functional signatures of the root surface microbiome. Nature Commununications. 5, 4950 (2014).
  31. Niu, B., Paulson, J. N., Zheng, X., Kolter, R. Simplified and representative bacterial community of maize roots. Proceedings of the National Academy of Science of the United States of America. 114, (12), E2450-E2459 (2017).
  32. Fitzpatrick, C. R., et al. Assembly and ecological function of the root microbiome across angiosperm plant species. Proceedings of the National Academy of Science of the United States of America. 115, (6), E1157-E1165 (2018).
  33. Ramirez, K. S., Lauber, C. L., Knight, R., Bradford, M. A., Fierer, N. Consistent effects of nitrogen fertilization on soil bacterial communities in contrasting systems. Ecology. 91, (12), 3463-3470 (2010).
  34. Paungfoo-Lonhienne, C., et al. Turning the table: Plants consume microbes as a source of nutrients. PLoS One. 5, (7), e11915 (2010).
  35. Yeoh, Y. K., et al. The core root microbiome of sugarcanes cultivated under varying nitrogen fertilizer application. Environmental Microbiology. 18, (5), 1338-1351 (2016).
  36. Bulgarelli, D., Schlaeppi, K., Spaepen, S., Ver Loren van Themaat, E., Schulze-Lefert, P. Structure and functions of the bacterial microbiota of plants. Annual Review of Plant Biology. 64, 807-838 (2013).
  37. Peiffer, J. A., et al. Diversity and heritability of the maize rhizosphere microbiome under field conditions. Proceedings of the National Academy of Science of the United States of America. 110, (16), 6548-6553 (2013).
Isolering og analyse av mikrobielle samfunn i jord, Rhizosphere og røtter i staude gresset eksperimenter
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

McPherson, M. R., Wang, P., Marsh, E. L., Mitchell, R. B., Schachtman, D. P. Isolation and Analysis of Microbial Communities in Soil, Rhizosphere, and Roots in Perennial Grass Experiments. J. Vis. Exp. (137), e57932, doi:10.3791/57932 (2018).More

McPherson, M. R., Wang, P., Marsh, E. L., Mitchell, R. B., Schachtman, D. P. Isolation and Analysis of Microbial Communities in Soil, Rhizosphere, and Roots in Perennial Grass Experiments. J. Vis. Exp. (137), e57932, doi:10.3791/57932 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
simple hit counter