Utgravningen av plante røtter fra feltet og behandling av prøver i endosphere, rhizosphere og jord er beskrevet i detalj, inkludert DNA utvinning og data analyse metoder. Dette papiret er utformet slik at andre laboratorier for å bruke disse teknikkene for studiet av jord, endosphere og rhizosphere microbiomes.
Plante- og jord microbiome studier blir stadig viktigere for forståelse roller mikroorganismer spille i landbruket produktivitet. Hensikten med denne oppgaven er å gi detaljer om hvordan du raskt prøve jord, rhizosphere og endosphere av replikerte feltforsøk og analysere endringer som kan oppstå i de mikrobielle samfunnene eksempel type, behandling og plante genotype. Eksperimentet brukes til å vise disse metodene består av replikerte feltet tomter som inneholder to, rene, varme sesongen gress (Panicum virgatum og Andropogon gerardii) og en lav-mangfold gress blanding (A. gerardii, Sorghastrum nutans, og Bouteloua curtipendula). Kort, planter er utgravd, en rekke røtter er kuttet og plassert i fosfatbuffer, og deretter rystet for å samle rhizosphere. Røttene er brakt til laboratoriet på is og overflaten sterilisert med blekemiddel og etanol (EtOH). Rhizosphere er filtrert og konsentrert med sentrifugering. Utgravde jord fra rundt roten ballen er plassert i plastposer og brakt til lab der en liten mengde jord tas for DNA utdrag. DNA er utdraget fra røttene, jord og rhizosphere og deretter forsterkes med primere for V4 regionen 16S rRNA genet. Amplicons er i rekkefølge, og deretter analysert med åpen tilgang Bioinformatikk-verktøy. Disse metodene tillater forskere å teste hvordan mikrobielle samfunn mangfoldet og komposisjon varierer på grunn av prøvetype behandling, og plante genotype. Bruker disse metodene sammen med statistiske modeller, viser representant resultatene det er betydelige forskjeller i mikrobielle samfunn røtter, rhizosphere og jord. Metoder som presenteres her gir et komplett sett med trinn for hvordan du feltet prøver, isolere, pakke ut, kvantifisere, forsterke og sekvens DNA, og analysere mikrobielle samfunn mangfold og komposisjon i replikerte feltforsøk.
Microbiome forskning har viktige implikasjoner for å forstå og manipulere Økosystemprosesser som næringsstoffer sykling, organisk materiale omsetning, og utvikling eller hemming av jord patogener1,2. Dette området av forskning har også stort potensial for å forstå konsekvensene av jord mikrober på produktiviteten av naturlige plantesamfunn og agroecosystems. Mens det er mange studier som har fokusert på jord microbiome i naturlige økosystemer, har færre fokusert på anlegget rhizosphere og endosphere mikrober i agroecosystems3. I Nebraska dominerer jordbruk landskapet over store deler av staten, gjør studiene i disse jord der agriculturally viktig avlinger dyrkes et viktig emne for forskning. Formålet med utredningen metoder er å gi forskerne en standardsettet med protokoller for å beskrive mikrobene finnes i agroecosystems, for å avgjøre hvordan planterøttene endre de mikrobielle samfunnene i rhizosphere og endosphere, og til slutt Forstå funksjonene disse mikrobene spille i jord helse og plante produktivitet.
Metoden som presenteres her er litt forskjellig fra metoder som brukes av andre4,5 i at dette papiret er rettet mot læring som mikrober er utelukkende i roten og hvordan de skiller seg fra mikrober umiddelbart utenfor roten i den rhizosphere. Den amplicon sekvensering brukt i denne studien identifiserer de mikrobielle taxa i DNA-prøve og lar etterforskere til å bestemme hvordan samfunnene endres avhengig av prøvetype eller behandling. En av de viktigste forskjellene mellom denne protokollen og en veldig lignende protokoll brukes av Lundberg et al. 6 er at i stedet for sonication, denne protokollen bruker overflaten sterilisering med blekemiddel og etanol fjerner rhizosphere fra røttene. Andre har også brukt overflaten sterilisering effektivt7,8,9,10. Disse metodene er ikke mer fordelaktig enn andre metoder, men litt annerledes. Disse metodene er spesielt godt egnet for store felteksperimenter fordi med nok folk er det mulig å behandle over 150 feltet tomter per dag, som legger opp til ca 450 prøver når delt i endosphere, rhizosphere og jord. Dette manuskriptet beskriver i detalj metoder brukt for å prøve i feltet, behandle materialet i laboratoriet, ekstra og sekvens DNA, og gir en kort oversikt over trinnene for å analysere sekvensering resultatdataene.
Metodene som er beskrevet i dette manuskriptet bør aktivere forskere å lett inn i feltet av jord og plante metagenomics. Gjennom årene har vi forbedret våre metoder siden gjennomføre eksperimentet beskrevet i dette manuskriptet. Én endring er at vi nå pre etiketten rør før du går ut til feltet utvalg. Våre lab bruker en barcoding og en etikettskriver. Etikettrykkeren ikke bare sparer tid da merking rør, men også gjør alt enklere å spore og identifisere prøver uten vagaries av menneskelig hånd skriver. En annen kritisk punkt er at vi prøver å behandle materialet etter å bringe det tilbake fra feltet så snart som mulig. Vi ønsker å fryse jord brukes for DNA-analyse, sterilisere og fryse røttene, og filtrere og fryse rhizosphere innen 12 36 timer etter hjemkomsten fra feltet. DNA utvinning prosedyrene er lang med mange trinn, spesielt for jord og rhizosphere, så vi kjøpte en robot (Kingfisher Flex, ThermoFisher) som minimerer hendene på tiden for DNA utvinning protokoller, reduserer menneskelig feil som kan være innført, og forbedrer konsekvensen i de helt forskjellige grupper av jord, røtter eller rhizosphere behandles. Når du arbeider med plantemateriale er det viktig å bestemme hvilken rot å bli studert eller å ta en rekke rot typer å få et “representativt utvalg”. Opprettholde røtter og forlater i en frossen tilstand når gjennomføre DNA utdrag er viktig, som er å sikre det er ingen krysskontaminering mellom eksempler Når du fyller 96-brønns DNA utvinning plater. En annen viktig faktor å vurdere er antall gjentak skal brukes når designe felteksperimenter og bruker en komplett randomisert design mulig26. Det kan være nødvendig å ha et stort antall gjentak å oppdage små forskjeller på grunn av høy feltet variasjon. Endelig erfaring er det viktig å sørge for jord ikke er for våt når graving røttene. Hvis jord er mettet med vann det er ikke bare rotete å jobbe med, men det er også svært vanskelig å definere rhizosphere og fjerne jord fra røttene.
En endring som ble gjort tidlig under utviklingen av disse metodene ble i stedet for risting rør for hånd for å frigjøre rhizosphere vi oppgradert til vortexers drevet av en gass generator å gjøre arbeidet enklere i feltet og mer standardisert i form av tid og måte at hver rør var urolig. En begrensning av amplicon sekvensering tilnærming er at taksonomisk oppløsningen av resultatene er ofte begrenset og mange OTUs er ukjent eller bare kjent på familie- eller slekt. Dette feltet forskning raskt utvikler seg så det er viktig å være klar over nye og utviklingsland tilnærminger, spesielt for dataanalyse som kan øke oppløsningen til resultatene.
Disse protokollene er bare for å studere bakterier og archaea, ikke sopp. Bruk av forskjellige primere for forsterkning vil tillate studiet av sopp fellesskap med de samme DNA prøver27,28. Disse metodene krever ikke kjøp av store mengder utstyr fordi metodene kan forenkles. Metodene vi beskriver her er hovedsakelig for å bestemme “som er det”, men feltet raskt utvikler seg til be viktige spørsmål om funksjonen, som kan rettes ved å bruke hagle sekvensering metoder, isolasjon og testing av funksjonaliteten til mikrober, eller sekvensering hele mikrobielle genomer.
Representant resultatene Uthev forskjellene i mikrobielle samfunn som kan identifiseres ved hjelp av metodene beskrevet. Bruker en beta-mangfold tilnærming til data analyse22, ble kompositoriske forskjeller vist mellom eksempler. Disse forskjellen er tydelig observert i de fleste andre studier der endosphere, rhizosphere og jord inneholder unike mikrobielle samfunn3. Shannon mangfoldet indeksen ble beregnet for å finne overflod og jevnhet av mikrobielle arter finnes i hver plantearter i endosphere, rhizosphere og jord. Som vist i denne studien og mange andre, er alfa mangfold høyest i jord, ned litt i rhizosphere og reduserer betydelig i de endosphere3,5,29. Disse resultatene indikerer at metodene som er beskrevet her er egnet for å identifisere kompositoriske endringer i endosphere, rhizosphere og jord.
Dominans av Proteobacteria er en vanlig funn i studier på endosphere og jord30,31,32. Endosphere har vanligvis et lavere mangfold av mikrobielle arter med en høyere relative overflod av Proteobacteria. Dette igjen understreker at resultatene her er representant for andre funn i litteraturen. Behandling effektene i denne studien var ikke signifikant forskjellig og to store grunner for det kan være at forskjellene pålagt av behandlingene ikke var stor nok til å generere nok variasjon til å oppdage og at tallgrunnlaget ble gjort på slutten av den voksende sesongen, når feltene kan ha hatt tid til å trekke ned nitrogen til lignende nivåer, som er det som ble målt på slutten av sesongen. I en annen studie med lignende befruktning priser over lengre tid, ble bare relativt små endringer i sammensetningen av microbiome målt33. Andre studier har vist endringer i både sopp og bakteriell samfunn på grunn av nitrogen gjødsel34,35.
Plantearter er kjent for å spille roller ved deres microbiomes3,32,36 og selv små forskjeller i mikrobielle samfunn variasjon er blitt demonstrert mellom ulike anlegg genotyper innenfor en én art37. I denne studien fant en betydelig forskjell i mikrobielle samfunn sammensetningen mellom plantearter. I alle prøve typer viste det seg at switchgrass hadde mest distinkte mikrobiell sammensetningen, men forskjellene mellom arter var bare statistisk signifikant i endosphere. Rhizosphere samfunnet komposisjon kan ha blitt betydelig hvis flere gjentak var tilgjengelig for analyse.
Den kombinerte feltet, lab og analytisk protokoller beskrevet her gir en kraftig metode for å studere hvordan ulike faktorer innflytelse sammensetningen av mikrobielle samfunn i jord, rhizosphere og endosphere av røtter36. Det er mye arbeid som må gjøres innen studerer microbiomes, spesielt i landbruket felt. Viktige spørsmål om hvordan avkastning er endret av jord microbiome har ennå å bli fullt belyst. Selv de mest grunnleggende spørsmålene om hvordan vekstskifter påvirke jord microbiome, hvordan timing endrer microbiome, hvordan abiotiske stress endrer microbiome, hvordan jordtype samhandler med disse faktorene for å endre microbiome, og om det er universell mikrober i visse avlinger eller regioner i USA er alle åpne spørsmål. Disse metodene vil også være nyttig for Epidemiologiske studier å identifisere tilstedeværelse og utholdenhet av sykdomsfremkallende og gunstige bakterier. En annen fremtidige horisonten for at disse metodene skal start integrere DNA-metodene som er beskrevet her med anlegget og mikrobe RNA og metabolitten data. Ytterligere forbedring og testing av flere variabler vil være viktig for videre optimalisering av disse protokollene.
The authors have nothing to disclose.
Utviklingen av dette manuskriptet er støttet av National Science Foundation EPSCoR Center for rot og Rhizobiome Innovation Award OIA-1557417. Datainnsamling ble støttet av midler fra University of Nebraska-Lincoln, landbruket forskning og utvikling og Luke stipend fra USDA. Vi erkjenner også støtte fra USDA-ARS og støtte ble gitt av landbruk og mat forskning initiativ konkurransedyktige tilskudd nr 2011-68005-30411 fra USDA National Institute of Food og landbruk til å opprette og administrere disse feltene.
Dneasy PowerSoil HTP 96 Kit | Qiagen/MoBio | 12955-4 | Extraction kit for soil and rhizosphere |
Dneasy PowerPlant HTP 96 Kit | Qiagen/MoBio | 13496-4 | Extraction kit for roots |
D-Handle Digging shovel, 101 cm L | Fiskars | 9669 | |
Rapid Tiller, 40 cm L | Truper | 34316 | |
Ziploc Bags, 17.7 cm x 19.5 cm | Ziploc | NA | |
Cooler | Any | NA | |
Wash pan | Any | NA | |
Plastic bucket | Any | NA | |
Gloves (work and lab) | Any | NA | |
20 cm diameter Soil sieve #8, 2360 μm mesh size | Dual Manufacturing Co., Chicago IL | US8-8FS | |
20 cm diameter Soil Sieve #4, 4750 μm mesh size | Dual Manufacturing Co., Chicago IL | US8-4FS | |
portable generator | Honda brand works well | NA | |
Sterile cell strainers 100 μm mesh size | Fisher Scientific | 22-363-549 | |
NaH2PO4·H2O | VWR | 0823 | |
Na2HPO4 | VWR | 0404 | |
Silwet L-77 | Lehman Seeds | VIS-30 | Surfactant |
Autoclaves | Any | NA | |
Drying Oven | Any | NA | |
Scale | Any | Any | |
Bleach | CLOROX – household strength | NA | |
Tween 20 | Any | NA | |
Liquid Nitrogen | Any | NA | |
Dry Ice pellets | Any | NA | |
Ethanol | Any | NA | |
11 cm precision fine point tweezers | Fisher | 17456209 | |
18 cm Straight point specimen forceps | VWR | 82027-436 | |
13.5 cm Pruning Scissors | Fiskars | 9921 | |
2 mL tube | Any | NA | |
15 mL PP conical tube | MIDSCI | C15B | |
50 mL PP conical tube | MIDSCI | C50B | |
Ultrapure water | Millipore-sigma | Milli-Q Integral, Q-POD | |
Qubit 2.0 fluorometer | Invitrogen | Q32866 | |
Qubit dsDNA HS Assay Kit | Invitrogen | Q32854 | For DNA quantification of removed samples |
QuantiFluor dsDNA System | Promega | E2670 | For DNA quantification |
96-Well Black with Clear Flat Bottom Plates | Corning | 3631 | |
pPNA PCR Blocker | PNA Bio | PP01-50 | |
mPNA PCR Blocker | PNA Bio | MP01-50 | |
Genomic DNA from Microbial Mock Community B (Even Low Concentration) v5.1L, for 16s rRNA Gene sequencing | BEI Resources | HM782D | |
Adhesive 8 well-strips for plates | VWR | 89134-434 | |
Stainless steel beads, 3.2 mm dia | Next Advance | SSB32 | |
1 ml Assay block (DNA extraction plate for the Qiagen/MoBio Dneasy PowerPlant HTP Kit) | CoStar | 3959 | |
antistatic PP weighing funnel, size small for soil/rhizosphere | TWD Tradewinds, INC | ASWF1SPK | |
antistatic PP weighing funnel, size x-small for root/leaf | TWD Tradewinds, INC | ASWFXSCS | |
Genie 2 Digital Vortex | Scientific Industries | SI-0236 | |
Vortex adapter for 50 mL tubes | Scientific Industries | SI-H506 | |
Mortar (100 mL) and pestle | Any | NA | |
Metal micro-spatula | VWR | 80071-672 | |
Disposable antistatic microspatulas | VWR | 231-0106 | |
Brown Paper bag 2# (10.95 cm x 6.19 cm x 20 cm) | Duro | 18402 | |
5424 Centrifuge for 2 mL tube | Eppendorf | 22620461 | |
Centrifuge for 96-well plate | Sigma4-16S | 81510 | |
Centrifuge rotor for 50 mL tubes | Sigma4-16S | 12269 – Biosafe | |
KAPA HiFi DNA polymerase | Kapa Biosystems |