Utgrävning av växternas rötter från fältet samt bearbetning av prover till endosphere, odlingsbädden och jord beskrivs i detalj, inklusive DNA extraktion och data analysmetoder. Denna uppsats syftar till att aktivera andra laboratorier att använda dessa tekniker för studier av jorden, endosphere och odlingsbädden microbiomes.
Växt och jord mikrobiomet studier blir allt viktigare för att förstå de roller mikroorganismerna spelar produktiviteten inom jordbruket. Syftet med detta manuskript är att ge information om hur snabbt prov jord, odlingsbädden och endosphere av replikerade fältförsök och analysera förändringar som kan uppstå i de mikrobiella samhällena på grund av provtyp, behandling och växt genotyp. Experimentet används för att demonstrera dessa metoder består av replikerade fältet tomter som innehåller två, ren, varm-säsong gräs (Panicum virgatum och conopsea gerardii) och en låg-mångfald gräs blandning (A. gerardii, Sorghastrum nutans, och Bouteloua curtipendula). Kort, växter är utgrävd, en mängd rötter skär och placeras i fosfatbuffert, och sedan skakas för att samla in rhizosfären. Rötter förs till laboratoriet på is och ytan steriliseras med blekmedel och etanol (EtOH). Odlingsbädden filtreras och koncentrerad genom centrifugering. Uppgrävda massor från runt rotklumpen placeras i plastpåsar och förde till labbet där en liten mängd jord tas för DNA extraktioner. DNA extraheras från rötter, jord och odlingsbädden och sedan förstärks med grundfärg för regionen V4 av 16S rRNA-genen. Amplikoner är sekvenserade, sedan analyseras med öppen access bioinformatiska verktyg. Dessa metoder tillåter forskare att testa hur den mikrobiella gemenskapens mångfald och sammansättning varierar på grund av provtyp, behandling, och plantera genotyp. Med dessa metoder tillsammans med statistiska modeller, visar representativa resultaten finns betydande skillnader i mikrobiella samhällen av rötter, odlingsbädden och jord. Metoder som presenteras här tillhandahåller en fullständig uppsättning steg för hur du samlar in fältprov, isolera, extrahera, kvantifiera, förstärka och sekvensera DNA och analysera mikrobiell gemenskapens mångfald och sammansättning i replikerade fältförsök.
Mikrobiomet forskning har stor betydelse för förståelse och manipulera ekosystem processer såsom näringsämne Cykling, organiskt omsättning och utveckling eller hämning av jord patogener1,2. Detta område av forskning har också stor potential för att förstå effekterna av jord mikrober på produktiviteten i naturliga växt samhällen och agroecosystems. Medan det finns många studier som har fokuserat på den jord mikrobiomet i naturliga ekosystem, har färre fokuserat på anläggningen odlingsbädden och endosphere mikrober i agroecosystems3. I Nebraska dominerar jordbruket landskapet över stora delar av staten, att göra studier av dessa jordar där agriculturally viktiga grödor odlas ett viktigt ämne för forskning. Syftet med denna metoder papper är att förse forskare med en standarduppsättning protokoll att beskriva Mikroberna som är närvarande i agroecosystems, för att bestämma hur växternas rötter ändra de mikrobiella samhällena i odlingsbädden och endosphere, och att så småningom förstå de funktioner som dessa mikrober spelar i jord och växtskydd produktivitet.
Metoden presenteras här skiljer sig något från metoder som används av andra4,5 i att denna uppsats syftar till att lära sig vilka mikrober är uteslutande insidan roten och hur de skiljer sig från mikrober omedelbart utanför roten i den odlingsbädden. Amplikon sekvensering används i denna studie identifierar de mikrobiella taxa Funna i DNA-provet och gör att utredarna att avgöra hur gemenskaperna ändras beroende på Provtyp eller behandling. En av de viktigaste skillnaderna mellan denna och en mycket liknande-protokollet används av Lundberg et al. 6 är att istället för ultraljudsbehandling, detta protokoll använder surface sterilisering med blekmedel och etanol att ta bort odlingsbädden från rötterna. Andra har också använt surface sterilisering effektivt7,8,9,10. Dessa metoder är inte fördelaktigare än andra metoder, men något annorlunda. Dessa metoder är särskilt väl lämpad för stora fältexperiment eftersom med tillräckligt många människor är det möjligt att bearbeta över 150 fältet tomter per dag, vilket ger upp till ca 450 prover när uppdelad i endosphere, odlingsbädden och jord. Detta manuskript i detalj beskriver de metoder som används för provtagning i fältet, bearbeta materialet i labbet, extrahera och sekvensera DNA, och ger en kort översikt över stegen för att analysera sekvensering resulterande data.
De metoder som beskrivs i detta manuskript bör göra det möjligt för forskare att enkelt ange fältet av jord och växt metagenomik. Genom åren har vi förfinat våra metoder sedan genomför de experiment som beskrivs i detta manuskript. En förändring är att vi nu före etiketten rör innan du går ut till fältet till provet. Vårt labb använder ett barcoding system och en etikettskrivare. Etikettskrivaren sparar inte bara tid då märkning rör, men också gör allting lättare att spåra och att korrekt identifiera prover utan nyckfulla av mänsklig hand skrivande. En annan kritisk punkt är att vi försöker bearbeta materialet efter bringande den tillbaka från fältet så snart som möjligt. Vi strävar efter att frysa den jord som används för DNA-analys, sterilisera och frysa rötterna, och filtrera och frysa odlingsbädden inom 12 till 36 timmar efter återkomsten från fältet. DNA extraktion förfarandena är lång med många steg, särskilt för jord och odlingsbädden, så vi köpte en robot (kungsfiskare Flex, ThermoFisher) som minimerar händerna på tid för DNA extraktion protokoll, minskar mänskliga fel som kan införas, och förbättrar samstämmigheten i de sätt olika partier av marken, rötter eller odlingsbädden bearbetas. När du arbetar med växtmaterial är det viktigt att besluta på vilken rot studeras eller att ta en mängd rot typer att få ett ”representativt urval”. Att upprätthålla rötter och lämnar i fryst tillstånd när genomför de DNA extraktioner är viktigt, vilket är att säkerställa att det finns ingen korskontamination mellan prover när du fyller 96 brunnar DNA extraktion plattor. En annan viktig faktor att beakta är antalet replikat som ska användas när designa fältexperiment och använda en komplett randomiserad design om möjligt26. Det kan vara nödvändigt att ha ett stort antal replikat att upptäcka små skillnader på grund av kicken sätter in variabilitet. Slutligen från vår erfarenhet är det viktigt att se till jordar inte är alltför våt när grävning rötterna. Om marken är mättad med vatten är det inte bara rörigt att arbeta med, men det är också mycket svårt att definiera i odlingsbädden och ta bort jorden från rötterna.
En ändring som gjordes tidigt under utvecklingen av dessa metoder var istället för skakningar rören för hand för att släppa den odlingsbädden vi uppgraderade till vortexers som drivs av en gasgenerator för att göra arbetet lättare och mer standardiserat i termer av tid och sätt att varje tub var upprörd. En begränsning med metoden amplikon sekvensering är att resultaten taxonomisk upplösning är ofta begränsad och många OTUs är okänd eller bara kända på familj- eller släkte. Forskningsområdet utvecklas snabbt så det är viktigt att vara medveten om nya och utveckla metoder, särskilt för dataanalys som kan förbättra resolutionen av resultaten.
Dessa protokoll är endast för att studera bakterier och arkéer, inte svampar. Användning av olika grundfärger för förstärkning kommer att möjliggöra studiet av svamp samhällen med de samma DNA prover27,28. Dessa metoder kräver inte inköp av stora mängder utrustning eftersom metoderna kan förenklas. De metoder som vi beskriver här är främst för att bestämma ”vem är det”, men fältet är att snabbt utvecklas till viktiga frågor om funktion, som kan åtgärdas med hjälp av shotgun sekvenseringsmetoder, isolering och testa funktionaliteten i mikrober eller sekvensering hela mikrobiell genomen.
De representativa resultat belysa skillnader i mikrobiella samhällen som kan identifieras med hjälp av de metoder som beskrivs. Med en beta-mångfald metod till data analys22, visades kompositionella skillnader mellan provtyper. Dessa skillnaden tydligt har observerats i de flesta andra studier där endosphere, odlingsbädden och jord innehåller unika mikrobiella samhällen3. Shannon mångfaldsindex beräknades för att bestämma överflöd och jämnhet av mikrobiell arten som finns inom varje växtarter i endosphere, odlingsbädden och jord. Som framgår i denna studie och i många andra, är alfa mångfald högst i smutsa, minska något i odlingsbädden och sedan minskar betydligt i endosphere3,5,29. Dessa resultat tyder på att de metoder som beskrivs här är lämpliga för att identifiera kompositionella förändringar i endosphere, odlingsbädden och jord.
Herravälden av Proteobacteria är ett vanligt konstaterande i studier på endosphere och jord30,31,32. Endosphere har i allmänhet en lägre mångfald av mikrobiell art med en högre relativa överflöd av Proteobacteria. Detta belyser återigen att resultaten här är representativa för andra fynd i litteraturen. Behandling effekterna i denna studie var inte signifikant och två stora skäl för det kan vara att skillnaderna som införts av behandlingarna inte var tillräckligt stor för att generera tillräcklig variation att upptäcka och att denna provtagning var klar i slutet av den växande säsongen, när fälten kan ha haft tillräcklig tid att dra ner kvävet till liknande nivåer, vilket är vad mättes i slutet av säsongen. I en annan studie med liknande befruktning priser över en längre tidsperiod, var endast relativt små förändringar i sammansättningen av mikrobiomet uppmätta33. Andra studier har visat förändringar i både svamp och bakteriella samhällen på grund av kväve gödselmedel34,35.
Växtarter är känd för att spela roller vid fastställandet av deras microbiomes3,32,36 och även små skillnader i mikrobiell gemenskapen variation har påvisats mellan olika växt genotyper inom en enda art37. I denna studie sågs en signifikant skillnad i mikrobiell gemenskapen sammansättning mellan växtarter. Alla provtyper av visade att switchgrass hade mest distinkta mikrobiella sammansättningen, men skillnaderna mellan arterna var endast statistiskt signifikant i endosphere. Odlingsbädden gemenskapen sammansättning kan bli betydande om fler replikat fanns tillgängliga för analys.
Den sammanslagna fältet, lab och analytiska protokoll som beskrivs här ger en kraftfull metod för att studera hur olika faktorer påverkar sammansättningen av mikrobiella samhällen i jordar, odlingsbädden och endosphere av rötter36. I området i närheten finns det en hel del arbete att göra i området studerar microbiomes, särskilt i jordbruks områden. Viktiga frågor om hur avkastningen ändras med den jord mikrobiomet har ännu inte vara helt klarlagd. Även de mest grundläggande frågorna om hur växtföljder påverka den jord microbiom, hur timing förändrar microbiom, hur abiotisk stress förändrar microbiom, hur jordart interagerar med dessa faktorer att förändra mikrobiomet och om det finns Universal mikrober i vissa grödor eller regioner i USA är alla öppna frågor. Dessa metoder kommer också vara användbar för epidemiologiska studier för att identifiera närvaron och persistens av patogena och nyttiga bakterier. En annan framtida Horisont för dessa metoder kommer att börja integrera de DNA-metoderna som beskrivs här med växt- och mikrob RNA- och metaboliten data. Ytterligare förbättring och testning av fler variabler kommer att vara viktigt för ytterligare optimering av dessa protokoll.
The authors have nothing to disclose.
Utvecklingen av detta manuskript stöds av National Science Foundation EPSCoR Center för Root och Rhizobiome Innovation Award OIA-1557417. Datainsamlingen var stöds av medel från University of Nebraska-Lincoln, jordbruksforskning och utveckling och en lucka bidrag från USDA. Vi erkänner också stöd från USDA-ARS och stöd tillhandahölls av jordbruk och livsmedel forskning initiativ konkurrenskraftiga bidrag nr 2011-68005-30411 från USDA nationella institutet för livsmedel och jordbruk för att upprätta och hantera dessa fält.
Dneasy PowerSoil HTP 96 Kit | Qiagen/MoBio | 12955-4 | Extraction kit for soil and rhizosphere |
Dneasy PowerPlant HTP 96 Kit | Qiagen/MoBio | 13496-4 | Extraction kit for roots |
D-Handle Digging shovel, 101 cm L | Fiskars | 9669 | |
Rapid Tiller, 40 cm L | Truper | 34316 | |
Ziploc Bags, 17.7 cm x 19.5 cm | Ziploc | NA | |
Cooler | Any | NA | |
Wash pan | Any | NA | |
Plastic bucket | Any | NA | |
Gloves (work and lab) | Any | NA | |
20 cm diameter Soil sieve #8, 2360 μm mesh size | Dual Manufacturing Co., Chicago IL | US8-8FS | |
20 cm diameter Soil Sieve #4, 4750 μm mesh size | Dual Manufacturing Co., Chicago IL | US8-4FS | |
portable generator | Honda brand works well | NA | |
Sterile cell strainers 100 μm mesh size | Fisher Scientific | 22-363-549 | |
NaH2PO4·H2O | VWR | 0823 | |
Na2HPO4 | VWR | 0404 | |
Silwet L-77 | Lehman Seeds | VIS-30 | Surfactant |
Autoclaves | Any | NA | |
Drying Oven | Any | NA | |
Scale | Any | Any | |
Bleach | CLOROX – household strength | NA | |
Tween 20 | Any | NA | |
Liquid Nitrogen | Any | NA | |
Dry Ice pellets | Any | NA | |
Ethanol | Any | NA | |
11 cm precision fine point tweezers | Fisher | 17456209 | |
18 cm Straight point specimen forceps | VWR | 82027-436 | |
13.5 cm Pruning Scissors | Fiskars | 9921 | |
2 mL tube | Any | NA | |
15 mL PP conical tube | MIDSCI | C15B | |
50 mL PP conical tube | MIDSCI | C50B | |
Ultrapure water | Millipore-sigma | Milli-Q Integral, Q-POD | |
Qubit 2.0 fluorometer | Invitrogen | Q32866 | |
Qubit dsDNA HS Assay Kit | Invitrogen | Q32854 | For DNA quantification of removed samples |
QuantiFluor dsDNA System | Promega | E2670 | For DNA quantification |
96-Well Black with Clear Flat Bottom Plates | Corning | 3631 | |
pPNA PCR Blocker | PNA Bio | PP01-50 | |
mPNA PCR Blocker | PNA Bio | MP01-50 | |
Genomic DNA from Microbial Mock Community B (Even Low Concentration) v5.1L, for 16s rRNA Gene sequencing | BEI Resources | HM782D | |
Adhesive 8 well-strips for plates | VWR | 89134-434 | |
Stainless steel beads, 3.2 mm dia | Next Advance | SSB32 | |
1 ml Assay block (DNA extraction plate for the Qiagen/MoBio Dneasy PowerPlant HTP Kit) | CoStar | 3959 | |
antistatic PP weighing funnel, size small for soil/rhizosphere | TWD Tradewinds, INC | ASWF1SPK | |
antistatic PP weighing funnel, size x-small for root/leaf | TWD Tradewinds, INC | ASWFXSCS | |
Genie 2 Digital Vortex | Scientific Industries | SI-0236 | |
Vortex adapter for 50 mL tubes | Scientific Industries | SI-H506 | |
Mortar (100 mL) and pestle | Any | NA | |
Metal micro-spatula | VWR | 80071-672 | |
Disposable antistatic microspatulas | VWR | 231-0106 | |
Brown Paper bag 2# (10.95 cm x 6.19 cm x 20 cm) | Duro | 18402 | |
5424 Centrifuge for 2 mL tube | Eppendorf | 22620461 | |
Centrifuge for 96-well plate | Sigma4-16S | 81510 | |
Centrifuge rotor for 50 mL tubes | Sigma4-16S | 12269 – Biosafe | |
KAPA HiFi DNA polymerase | Kapa Biosystems |