Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

Imaging FITC-dekstran som en Reporter regulert Exocytosis

Published: June 20, 2018 doi: 10.3791/57936
Automatic Translation
1, 1, 2, 3, 4, 1
1Department of Cell and Developmental Biology, Sackler Faculty of Medicine, Tel Aviv University, 2Department of Pathology, Sackler Faculty of Medicine, Tel Aviv University, 3Laboratory of Membrane Trafficking Mechanisms, Department of Developmental Biology and Neurosciences, Graduate School of Life Sciences, Tohoku University, 4Departments of Pathology and of Microbiology and Immunology and Sean N. Parker Center for Allergy and Asthma Research, School of Medicine, Stanford University

Summary

Her detalj vi en metode for levende celle avbilding av regulert exocytosis. Denne metoden bruker FITC-dekstran, som akkumuleres i lysosome-relaterte organeller, som reporter. Denne enkle metoden kan også skille mellom ulike regulert exocytosis i celler som er vanskelige å manipulere genetisk.

Abstract

Regulert exocytosis er en prosess som slippes Last, som er lagret i sekretoriske granulater (SGs), som svar på en sekretoriske utløser. Regulert exocytosis er grunnleggende for intercellulære kommunikasjon og en viktig mekanisme for utskillelsen av nevrotransmittere, hormoner, inflammatoriske mediatorer og andre forbindelser, av en rekke celler. Minst tre forskjellige mekanismer er kjent for regulert exocytosis: full exocytosis, der en enkelt SG fullt sikringer med plasma membran, kyss-and-run exocytosis, der en enkelt SG transiently sikringer med plasma membranen, og sammensatte exocytosis, der flere SGs sikring med hverandre, før eller etter SG sammensmelting med plasma membranen. Typen regulert exocytosis foretas av en celle er ofte diktert av sekretoriske utløser. I mange celler, kan en enkelt sekretoriske utløse derimot aktivere flere driftsmoduser regulert exocytosis samtidig. Til tross for sine overflod og betydning over celletyper og arter er mekanismer som bestemmer forskjellige moduser sekresjon i stor grad uløst. En av de største utfordringene i undersøke forskjellige moduser regulert exocytosis, er vanskeligheten i skille mellom dem, i tillegg til å utforske dem separat. Her beskriver vi bruk av fluorescein isothiocyanate (FITC)-dekstran som exocytosis reporter, og levende celle imaging for å skille mellom forskjellige veier av regulert exocytosis, med fokus på sammensatte exocytosis, basert på robusthet og varighet for exocytic hendelser.

Introduction

Regulert exocytosis er den primære mekanismen som lett gjort Last frigis fra en sekretoriske celle som svar på en bestemt utløser. Lasten er før dannet og sequestered i sekretoriske blemmer, som det er lagret til en utløser videresender signalet for utgivelsen av SGs' innhold. Forskjellige typer signaler kan resultere i forskjellige moduser av regulert exocytosis eller forskjellige moduser av regulert exocytosis oppstå samtidig. Tre viktigste formene for regulert exocytosis er kjent: full exocytosis, som innebærer full blanding av en enkelt sekretoriske granule med plasma membran; kyss-and-run exocytosis, som innebærer forbigående fusjon av det sekretoriske granulen med plasma membranen etterfulgt av sin gjenvinning; og sammensatte exocytosis, som er preget av homotypic blanding av flere SGs før (dvs., multigranular exocytosis) eller sekvensielle (dvs., sekvensielle exocytosis) til fusjon med plasma membranen1. Sammensatte exocytosis regnes som den mest omfattende modusen av Last release2, som gjør det mulig for rask utskillelsen av Last, inkludert fra SGs som ligger distale fra plasma membranen. Sammensatte exocytosis er dokumentert i begge exocrine og endokrine celler3,4,5,6,7,8,9, samt immunceller. I immunceller, som eosinofile10,11,12 og nøytrofile13, tillater sammensatte exocytosis rask og robust utgivelsen av meglere som kreves for å drepe invaderende patogener som bakterier eller parasitter. Mast celler (MCs) distribuere sammensatte exocytosis for effektiv utgivelsen av forhåndslagrede inflammatoriske mediatorer under medfødte immunreaksjoner, anafylaksi og andre allergiske reaksjoner14,15,16 , 17. siden forskjellige moduser exocytosis oppstår samtidig18,19, har det blitt en utfordring å skille mellom dem i sanntid eller til å identifisere deres respektive fusion machineries, derav Klargjørende deres underliggende mekanismene.

Her presenterer vi en metode basert på levende celle imaging cellen lastet FITC-dekstran, som gjør at sanntid sporing av exocytic hendelser og skille mellom deres forskjellige moduser. Spesielt tillater våre metoden eksklusive overvåking av sammensatte exocytosis.

FITC-dekstran er en komplekskonjugerte til pH-sensitive fluorophore FITC med Glukan polysakkarid dekstran. Fluorescently merket dextrans har vist inn i cellen av micropinocytosis20,21 og macropinocytosis22,23. Som endocytic rom eldre i lysosomer, har det vært vist at FITC-dekstran akkumuleres i lysosome uten tilsynelatende degradering. Men siden FITC er en svært pH-sensitive fluorophore24, og lysosome-lumen er surt, slukker FITC-dekstran fluorescens på å nå lysosome24. Dermed etablere dextrans som lysosome målrettet Last, tatt med pH følsomheten til FITC, har lagt grunnlaget for bruk av FITC-dekstran i studier av lysosome exocytosis25,26,27 , 28 , 29.

Flere celletyper, inkludert MCs, nøytrofile, eosinofile, cytotoxic T-celler, melanosomes og andre, SGs lysosomale funksjoner og er klassifisert som lysosome-relaterte organeller (LROs) eller sekretoriske lysosomer30,31 . Siden LROs har et surt luminal pH, kan FITC-dekstran brukes til å visualisere deres exocytosis, som følge av høyere pH knyttet til exteriorization av LROs. Faktisk, FITC-dekstran har blitt brukt til å overvåke exocytosis MCs18,32,33. I denne metoden, er FITC-dekstran lagt til i cellekultur, tatt opp av cellene av pinocytosis og sortert i SGs. Som i lysosomer, er FITC fluorescens slukket i SGs når de er inne i cellen. Men på SG fusion med plasma membranen og påfølgende eksponering for eksterne miljøet gjenvinner FITC-dekstran sin fluorescens som SG pH stiger, tillater enkel sporing av exocytic hendelser av levende celle mikroskopi. Her justert vi denne metoden å aktivere unike sporing av sammensatte exocytosis.

To andre metoder har blitt brukt tidligere spore sammensatte exocytosis. Elektronmikroskop var den første metoden å karakterisere exocytic strukturer som foreslo forekomsten av forskjellige moduser av exocytosis. Spesielt ga observasjoner av "sekretoriske tunneler" i bukspyttkjertelen acinar celler34 og MCs35,36,37 opphav til hypotesen om sammensatte exocytosis. Men mens den høye oppløsningen av elektronmikroskop har makt til å avsløre smeltet blemmer, det kan ikke spore dynamikken i sin fusion og dermed kan ikke definere om de stemmer med SG fusion under sammensatte exocytosis eller blanding av inndekning av noe granulater etter deres endocytose. Denne hindringen er overvunnet i andre metoder som kan måle exocytosis i levende celler, som oppdateringen klemme målene av plasma membranen kapasitans11,13,38,39 eller amperometry 40 av media. Imidlertid oppdateringen clamping krever en spesiell oppsett og kan ikke være egnet for alle celletyper. Amperometry mål er kunne spore exocytosis bare hvis lasten er utgitt i umiddelbar nærhet til elektroden. Derfor tilbyr med levende celle imaging fordeler over disse metodene, som det ikke bare tillater for sanntid sporing av exocytosis, men det tillater rask og enkel henting av data fra hele cellen.

Sporing av FITC-dekstran av levende celle mikroskopi tilbyr også noen fordeler til andre levende celle imaging-baserte metoder. For eksempel er en brukte metoden totalt interne refleksjon fluorescens mikroskopi (TIRFM) av celler lastet med en fluorescerende SG sonde eller uttrykke en fluorescerende protein-merket SG Last eller membran protein26,41, 42 , 43. styrken i denne metoden ligger i dens evne til å overvåke utelukkende hendelser som oppstår nær plasma membranen (heretter referert til som fotavtrykk), derav exocytic hendelser. Men er dette også ulempen med denne metoden fordi bare cellen brøkdel er coverglass og nær mikroskop linsen kan være fotografert44. Om slike fotavtrykk faktisk representerer hele cellemembranen overflaten er fortsatt diskuteres45,46,47. I denne forbindelse, lar med en pH-sensitive fargestoff som FITC-dekstran og standard fluorescens mikroskop eller AC confocal mikroskop med en åpen pinhole avbilding av hele cellen, dermed tar totale exocytic hendelser som skjer i denne cellen.

Ekstra pH-sensitive journalister som brukes til å studere regulert exocytosis av hele cellen avbildning eller TIRFM inkluderer SG Last eller SG membran protein del phlourin, en pH-sensitive GFP variant. NPY - phlourin-, β-hexoseaminidase-phlourin og synapto-phluorin,48,,49,,50,,51,,52eksempler. Mens uttrykket av disse sonder kan representere nærmere endogene sammensetningen av SGs, det medfører transfection cellene, og kan derfor være mindre egnet til celler som er vanskelig å transfect. Derfor, når studere celler som er vanskelig å transfect eller under eksperimentelle forhold som krever flere genomisk manipulasjoner, bruk av et stoff som du kan bare legge til celle kultur medium, for eksempel FITC-dekstran, er en fordel . FITC-dekstran tilbyr også en fordel over Akridin oransje (AO), en annen pH-sensitive fargestoff som har blitt brukt for sporing av exocytosis av levende celle mikroskopi53,54,55,56 , 57 , 58. AO har vist seg å indusere photolysis av blemmer som resulterer i USANN blinker, som ikke samsvarer med faktiske sekresjon behandler27. I kontrast, gjenspeiler FITC-dekstran bedre sekresjon hendelser, sannsynligvis på grunn av sin lave Foto-indusert produksjon av reaktive oksygen27.

Spesielt, er en alternativ tilnærming for å studere exocytosis ved å spore tilstrømningen av en farge, fra eksterne mediet i SG gjennom fusion pore som åpnes under denne prosessen. I dette tilfellet legges fargestoff til eksterne medium sammen med sekretoriske utløseren. Deretter, når fusion pore åpner, fargestoff diffunderer i SG59,60. En klar fordel med denne metoden er at det også tilbyr muligheten til å beregne fusion porestørrelse, ved bruk av fargestoffer av variabel størrelse. For eksempel kan dextrans av ulike molekylvekt (MW), konjugert til ulike fluorophores, brukes som ekstracellulære fargestoffer der den maksimale størrelsen på dekstran som kan trenge SG skulle tilsvare størrelsen på fusion pore59, 61 , 62 , 63 , 64. I tillegg denne tilnærmingen ikke krever bruk av en pH-sensitive sonde. Men er ulempe at signalet til støyforhold er svært lav, siden en stor mengde fargestoff er til stede i mediene under oppkjøpet av bildene i høye.

Bruk av FITC-dekstran som en markør for exocytosis overvinner samlet flere ulemper i tidligere rapportert metoder, som signal til støy forhold, toksisitet, dynamisk sporing og kompleksitet.

Her beskriver vi bruk av FITC-dekstran å overvåke sammensatte exocytosis i RBL - 2H 3 mast celle linje (heretter referert til som RBL, først og fremst etablert av Eccleston et al. 65 og ytterligere klonet av Barsumian et al. 66), svar på immunglobulin E (IgE) / antigen (Ag) aktivisering.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. forberedelser

  1. Utarbeidelse av RBL kultur medier
    1. Mix 500 mL av lav glukose Dulbecco endret Eagle's medium (DMEM) med 56 mL av fetal bovin serum (FBS), 5,5 mL av penicillin streptomycin nystatin løsning, 5,5 mL av L-glutamin 200 mM løsning. Dette resulterer i lav glukose DMEM supplert med 10% FBS, 100 µg/mL streptomycin, 100 enheter/mL penicillin, 12 enheter/mL nystatin og 2 mM L-glutamin.
    2. Filtrere media ved å bruke filtere topp-vakuum 0.22 µm porestørrelse og butikk på 4 ° C.
  2. Vedlikehold av RBL cellene.
    1. Vokse RBL cellene til en maksimal confluency på 90% i 10 cm parabol. Hvis cellekultur er sunt, ha cellene en spindel figur med sporadiske utstikkende deler.
    2. For celle deling, koble cellene fra retten ved aspirating media og erstatte med 2 mL trypsine/EDTA B. Incubate i 5-10 minutter i et fuktet 5% CO2 på 37 ° C.
    3. Når cellene har enebolig, nøytralisere trypsin ved å legge til 2 mL kultur medier, bruker en pipette, og dele cellene i et 1:2-1:10 forholdet.
  3. Utarbeidelse av 20 x Tyrode's buffer
    1. Forberede en aksje 20 x løsning av 54 mM KCl, 20 mM MgCl2, 2.74 M NaCl og 8 mM NaH2PO4 i dobbel destillert vann (DDW). Bland godt og lagre på 4 ° C.

2. kultur RBL celler for levende celle mikroskopi

  1. Utarbeidelse av FITC-dekstran løsning.
    1. Bland 1 mg av FITC-dekstran pulver (150 K) per 1 mL av kultur medier (se trinn 1.1.1). For en full kamret coverglass, forberede 3 mL.
    2. Bruker en celluloseacetat sprøyte filter enhet med 0.22 µm porestørrelse, filtrere oppløst FITC-dekstran.
    3. Legge til musen IgE en konsentrasjon av 1 µg/mL.
  2. Såing RBL celler for bildebehandling
    1. Dagen før bildebehandling, Sug opp media fra kultur parabol og erstatte med 2 mL trypsine/EDTA B. Incubate for 5-10 minutter i et fuktet 5% CO2 på 37 ° C. Når cellene har enebolig, nøytralisere trypsin ved å legge til 2 mL kultur medier.
    2. Antall RBL celler ved hjelp av en hemocytometer og justere volumet tilsvarende med kultur medier å få en celle konsentrasjon av 7.5 x 105/mL.
    3. Legge 10 µL av cellen suspensjon å en kamret coverglass forhåndsutfylt med fersk FITC-dekstran suppleres kultur medier (Dette resulterer i såing av 7.5 x 103 celler i et kammer).
    4. Vokse RBL celler over natten i et humified 5% CO2 på 37 ° C. Cellene bør forbli i et sub-confluent nivå for å sikre at cellene blir separert og at det er lett å identifisere hver celle individuelt under mikroskopet.
  3. Hva med RBL celler - valgfritt.
    1. Imaging exocytic events i kombinasjon med andre fluorescently merket proteiner, se hva protokoll for RBL celler i Azouz et al. 67

3. levende celle mikroskopi av Exocytosis

  1. Utarbeidelse av løsninger:
    1. Forberede en endelig Tyrode buffer løsning fortynne lager løsningen i DDW i en 1:20 fortynning og supplement med 20 mM Hepes pH 7 1,8 mM CaCl2og 1 mg/mL BSA 5,6 mM glukose.
    2. Fersk forberede en 20 x secretagogue reagens i Tyrode's buffer [1 µg/mL dinitrophenyl konjugert til menneskelig serum albumin (DNP-har (Ag)) i vårt tilfelle, for en 50 ng/mL 1 x konsentrasjon].
    3. Forberede en 400 mM salmiakk løsning ved å løse opp pulveret i Tyrode's buffer.
  2. Utarbeidelse av cellene.
    1. Vask kamret coverglass 3 ganger av aspirating media fra kammeret og fylle det med 300 µL Tyrodes bufferen, prewarmed til 37 ° C. Til slutt, fylle til kammeret 300 µL Tyrodes bufferen, prewarmed til 37 ° C.
    2. Plass den kamret coverglass i visningskroppen inkubator kammer. Kontroller at kammeret er stabil.
  3. Definere mikroskopet
    1. Velg et område av interesse å spore, slå på fluorescerende lyskilden (tradisjonelt en kvikksølv-lampe) og velg riktig fluorescens filteret (Velg filteret for grønn fluorophores for å vise FITC-dekstran). Når regionen rundt er i fokus og midt i synsfelt, slå av lyskilden for å unngå Foto-bleking og toksisitet.
      Merk: Noen av FITC-dekstran i cellene kan beholde fluorescens. Dette er fordi FITC-dekstran kan også sorteres til ikke-lysosomale avdelinger som endosomes.
    2. Slå på det passende lighter for FITC eksitasjon. Hvis bruker laser-basert mikroskop, aktivere 488 nm laser. Utslipp skal samles rundt 500-550 nm (FITC utslipp topper på 510-520 nm).
    3. Når du bruker en AC confocal mikroskop, åpne hullet til maksimalt. Dette vil tillate bruker lavere laser makt å unngå bleking og toksisitet sikrer erobringen av exocytosis hendelser fra alle fly av cellen.
    4. Kalibrere tidsintervallet mellom bilde oppkjøp.
      1. Forskjellige celler kan variere i sin kinetics av regulert exocytosis68. Bestemt avbildning av sammensatte exocytosis anbefaler vi et tidsintervall på minst 5 sekunder. Men som en tommelfingerregel, slik at rask bildebehandling, kontroller at oppkjøpet tid et enkeltbilde er rask.
      2. Når du bruker en laser-skanning AC confocal mikroskop, angi skanning retningen til toveis, ikke tillate snitt, og sette oppløsningen på 512 x 512 (anbefales, sistnevnte to bestemmelsene vil også hjelpe for å minimere bleking og toksisitet).
  4. Avbildning av exocytosis.
    1. Bildet celler for ønsket varighet, avhengig av cellen eller secretagogue. I RBL celler avtrekker med IgE/Ag, oppstår de fleste exocytic hendelser innen 15-20 min etter aktivering.
    2. For aktivisering av celler, legger du til 16 µL fra 20 x secretagogue løsning til kammeret.
  5. Bekrefter FITC-dekstran tilstedeværelse i cellene.
    1. For å bekrefte tilstedeværelse og lokalisering av FITC-dekstran til SGs, legge til 16 µL salmiakk løsning (være forsiktig med å flytte kammeret for ikke å miste fokus) kammeret forsiktig (dette vil gjøre en siste konsentrasjon av 20 mM). Dette vil føre til alkalization av SGs og dequenching av FITC fluorescens, som skjer innen sekunder.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Figur 1a representerer skjematisk hvordan FITC-dekstran kan fungere som en reporter for regulert exocytosis og recapitulate forskjellige moduser exocytic hendelser. Først er celler ruges med FITC-dekstran, som er internalisert pinocytosis og til SGs. Siden SGs MCs LROs, deres lav pH demper fluorescens av FITC, vises her som svarte granulater (-vekselstrøm, jeg). Når cellene er utløst av et secretagogue og SGs sikringen med plasma membranen, dannes en fusion-pore, slik at middelklasseinnbyggere av protoner og alkalization av SGs. Som en konsekvens, gjenvinner FITC sin fluorescens (A, II). Full exocytosis vil manifestere seg i en kort (mindre enn 5 s) fluorescerende hendelse som den exteriorized SG membran fullt kollapser i plasma membranen og FITC-dekstran diffunderer bort i kultur medium (A, III). Under et kyss-and-run exocytic hendelse, den SG membran bare transiently sikringer med plasma membran, som fører til en kortvarig fusion pore og derfor bare en kort utbrudd av fluorescens som SG raskt løsner og dens lumen raskt re Forsurer (B, III - IV). Til slutt, under sammensatte exocytosis, en rekke SGs sekvensielt sikring med hverandre (følgende SG fusion) og plasma membranen, med opprettholdelse av en åpen fusion pore. Som et resultat, er en mye større masse FITC-dekstran dequenched, noe som resulterer i en stor og lang levetid fluorescens burst (C, III-IV) som henfaller når proben diffunderer til eksterne medium (C, V).

Vi har brukt denne modellen og bekreftet sine spådommer av tenkelig kontroll celler og celler som er tømt for Rab5, som vi har vist seg for å være avgjørende for homotypic SG-SG fusion69 og sammensatte exocytosis33. Ved å angi anskaffet et bilde hver 15 s, vi forventet å oppdage det meste kontinuerlig hendelsene i sekresjon, dvs. sammensatte exocytosis. Faktisk, som vist i figur 1B, våre data viser at mens kontroll celler mange store og langvarig exocytic hendelser kan bli registrert, bare noen hendelser ble innspilt i Rab5 knockdown celler (shRab5). Videre ble hendelsene som ble spilt inn i shRab5 celler betydelig mindre i størrelse i forhold til hendelser i kontroll cellene. Av notatet forblir sekretoriske kapasiteten av shRab5 celler uendret under de samme betingelsene69, antyder at mens shRab5 hemmer sammensatte exocytosis, ikke det avskaffe sekret. Derfor kan tenkelig FITC-dekstran fluorescens i lang tidsintervaller for bestemte påvisning av sammensatte exocytosis. Videre kan tenkelig FITC-dekstran release fange av sekvensiell natur sammensatte exocytosis. Som indikert av pilen i figur 1b, etter en glimtet av lyset, begynner en blits som en svak flash som er for det første. Dette kan sluttes som fusjon av en SG med en SG som blir allerede sammensmelting med plasma membranen (dvs., sekvensielle exocytosis). Derfor som det andre granulen sikringer med det første granulen som allerede er koblet til plasma membranen av en fusjon pore, pH i det andre granulen øker også og FITC fluorescens dequenches, gir et andre utbrudd av fluorescens. Et slikt scenario av FITC-dekstran release under sekvensiell blanding av tilstøtende SGs vises i figur 1 c.

Et annet eksempel på sekvensiell blanding av SGs under sammensatte exocytosis er vist i figur 2. RBL celler var co transfekterte med en constitutively aktive (CA) form av Rab5a WT SNAPIN-23, under hvilke sammensatte exocytosis blir mer robust33. Avbildning av CA Rab5a, som er avgjørende for SG-SG fusion og er belegg store SGs33,69, sammen med FITC-dekstran, kan bedre visualisering av fusjon av en mindre granule med en større CA-Rab5a innredet granule.

Siden FITC-dekstran er slukket når lagret i SG, er det nødvendig å gjennomføre en teknikk for å bekrefte at FITC-dekstran er virkelig tilstede i SGs. Dette blir enda mer viktig når preforming et eksperiment under forhold som er forventet å avskaffe sekret. For å løse dette problemet ved ble 20 mM salmiakk lagt til kammeret ved slutten av hvert eksperiment. Denne behandlingen hever pH i SGs, slik at FITC fluorescens. Som vist i Figur 3etter salmiakk med Media, FITC dekstran blir synlige og co er lokalisert med mRFP-merket blindhet, som er en SG reporter i RBL celler70.

Figure 1
Figur 1: bestemt påvisning av sammensatte exocytosis. (a) et diagram som beskriver hvordan endringer i FITC-dekstran fluorescens recapitulate forskjellige moduser regulert exocytosis. (b) Live celle avbildning av FITC-dekstran i RBL celler transfekterte med NPY-mRFP og pSilencer eller shRab5, som angitt. Hva ble utført som beskrevet tidligere67,70. Kort, 1,5 x 107 RBL celler var resuspended hva buffer (DMEM supplert med 20 mM K-rør pH 7 10 µM Ca2 + acetat, 2 mM Mg2 + acetate, 128 mM kalium glutamat) som inneholder 15 µg NPY-mRFP og enten 30 µg av pSilencer eller 15 µg av shRab5A, og 15 µg shRab5B/c. Transfection ble oppnådd ved electroporation på 300 V og en 20 MS puls lengde. Cellene ble umiddelbart replated kultur medium som inneholder 1 mg/mL FITC-dekstran. Etter 24 timer, var celler sensitivisert med 1 µg/mL IgE og ruges i ytterligere 24 h. Cellene ble deretter vasket tre ganger i full Tyrode buffer og aktivert ved 50 ng/mL av DNP-HSA (Ag). Cellene ble visualisert ved time-lapse fluorescens mikroskopi. Den hvite pilen i pSilencer bilder peker til en eksplosjon av FITC fluorescens og den hvite sirkelen markerer en utladet SG. Den hvite pilen i shRab5A/B/C bilder angir minutt fluorescerende hendelser som oppstår i Rab5-knockdown celler, trolig på full exocytosis. Av notatet økt intensiteten av ShRab5 bildet for å tillate oppdaging av signalet. Bildene ble anskaffet av AC confocal mikroskop utstyrt med et oppvarmet kammer (37 ° C) og CO2 -kontroller (4,8%) og et C-Apochromat x63/1.2 W Corr mål, under åpne pinhole innstilling. Full film, se Klein et al. 33 (c) en skjematisk diagram av homotypic SG fusion vises i (b). I detalj, som første SG sikringer med plasma membranen og etablerer en fusion pore, begynner det måtte alkalize når du slipper innholdet FITC-dekstran. Således, når en andre SG sikringer med det første en sekvensiell måte, fluorescens av det første SG tones grunn til utgivelsen av FITC-dekstran. Men alkalizes andre SG, som resulterer i en FITC flash som vises ved siden av den første SG. Dette tallet ble tilpasset fra Klein et al. 33 Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 2
Figur 2: Dual imaging mStr-CA-Rab5 og FITC-dekstran. RBL celler var co transfekterte med 20 µg av HA-wt-SNAP23 og 10 µg av mStr-CA Rab5A. Celler var pre inkubert med FITC-dekstran og IgE og avtrekker med Ag som beskrevet i figur 1. (a) en rekke bilder fange en fusion hendelse mellom en Let SG (hvit pil) og en SG som har allerede smeltet sammen med plasma membranen og er derfor fluorescerende. 15.8 minutter, har Let SG smeltet sammen med den nærliggende SG og begynt å få fluorescens. Av boksområdene blir forstørret nederst til venstre i hvert punkt. (b) presentasjon av både mSTR-CA Rab5A (i rødt) og FITC-dekstran (i grønt) fra de tilsvarende tidspunkt vises i (a), demonstrere fusjonen mellom de to SGs. bilder ble kjøpt opp av AC confocal mikroskopi (åpne pinhole) bruker en Plan-apochromat x63-NA 1.4 mål. Dette tallet ble tilpasset fra Klein et al. 33 for hele filmen, se Klein et al. 33 Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 3
Figur 3: Dual imaging NPY-mRFP og FITC-dekstran under alkalization av SG av NH4klasse RBL celler var transfekterte med shRab5, pre inkubert med FITC-dekstran og IgE og avtrekker med Ag, som beskrevet i figur 1. (a) celler var visualisert ved time-lapse fluorescens mikroskopi. Utpekt ganger i bildene er minutter etter utløser med Ag. Bildene ble anskaffet av AC confocal mikroskopi bruker en Plan-apochromat x63-NA 1.4 mål. (b) kvantitativ analyse av eksperimentet vises i (a). Hver linje i grafer er den gjennomsnittlige fluorescensen av FITC på et område av interesse (ROI) over en enkeltcelle. Pilen peker på tidspunktet for NH4Cl (20 mM) tillegg. Barer = 5 µm. Dette tallet ble tilpasset fra Klein et al. 33 Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Her beskriver vi hvordan sporing fluorescens av FITC-dekstran lastet inn SGs kan brukes til å fange spesielt sammensatt exocytosis hendelser. Dette ble oppnådd ved å sette mikroskop for å skaffe et bilde hvert 15 sekunder, slik at bare langvarig hendelser blir registrert over tid og dermed unntatt kort hendelser som skulle tilsvare full exocytosis eller kyss-and-run exocytosis. For å etablere metoden, viste vi at knockdown av Rab5 isoformene som uttrykkes i RBL celler, og er avgjørende for sammensatte exocytosis, eliminerer muligheten til å fange hendelsene i FITC-dekstran utgivelse, mens totale utskillelsen av cellen ikke er berørt.

Den mest fremtredende ulempen metoden er at det bare gjelder for celler som inneholder surt SGs. Den fremste fordelen med metoden er imidlertid at det er basert på enkel inkubasjonstiden for cellene med FITC-dekstran, uten transfection. Andre pH-sensitive journalister som brukes til å studere regulert exocytosis og involverer SG Last eller SG membran protein-smeltet phlourin, en pH-sensitive GFP variant (for eksempel NPY - phlourin-, β-hexoseaminidase-phlourin og synapto-phluorin48, 49,50,51,52), kan mer tett representere endogene sammensetningen av SGs. Bruken innebærer imidlertid transfection av celler som kan være mindre egnet til celler som er vanskelig å transfect. Derfor, når studere celler som er vanskelig å transfect eller under eksperimentelle forhold som krever flere genomisk manipulasjoner, bruk av et stoff som kan suppleres bare i celle kultur medium, for eksempel FITC-dekstran, er en fordel. Våre protokollen kan kreve celle bestemt justeringer til forskjeller i the kinetics av exocytosis på ulike celle typer68. Derfor skal valgte tidsintervallet for bildeopptak optimaliseres. For RBL celler har vi satt opp mikroskop for å ta et nytt bilde hver 15 sekunder, som i IgE/Ag utløste RBL celler tillatt oss å visualisere bare langvarig hendelser, og dermed tillater eksklusive sporing av sammensatte exocytosis hendelser.

En annen faktor som må vurderes er typen dekstran som skal brukes. Det finnes en rekke dextrans som varierer i deres molekylvekt. Derfor er det viktig å velge de aktuelle dekstran som reporter, tar hensyn til potensielle effektene som ulike dextrans kan ha på celler. For eksempel vist lav molekylvekt dextrans seg å aktivere MCs og indusere sekresjon71,72,73,74. Derfor være lav molekylvekt dextrans ikke riktige journalister for MC sekret. Forskjeller i cellen reaktivitet mot dextrans var også bemerket i forskjellige rotte stammer75, eller under ulike co-stimulatory forhold71,76,77,78. Her har vi valgt å bruke en 150 K FITC-dekstran som tidligere har vært studert i RBL celle linjen og vist seg å være ineffektive i inducing sekresjon18,79.

Lyskilden velges er også avgjørende for protokollen. Når du bruker en AC confocal mikroskop, er lyskilden tradisjonelt laser-basert. Derfor, for å unngå toksisitet, er det viktig å velge en lav laser makt. Ønsket laser makt skiller mellom mikroskoper, avhengig av type og alder av laser. Videre er ønsket laser makt også avhengig av typen detektor brukes. For eksempel når du bruker en vanlig detektor som en photomultiplier tube-baserte detektor, ville en høyere makt laser behøves enn når du bruker en moderne hybrid detektor (som et photomultiplier rør og en skred Foto-dioder hybrid detektor). Vi anbefaler å bruke den laveste laser makten mulig og ikke overstiger 10% av laser makt.

Oppsummert lastet overvåking dequenching av SG FITC-dekstran av tid forfalle-mikroskopi under nøye utvalgte innstillinger tillatt oss å utelukkende fange sammensatte exocytosis i RBL MCs, sterkt går lettere identifikasjon av molekylære enhetene som regulere denne prosessen. Denne metoden kan bli ytterligere justert for å skille hele fra kiss-and-run exocytosis ved å redusere og nøye kalibrere tidsintervallet mellom bilde oppkjøp tillate æren av kortvarige blinker forbundet med kyss-and-run exocytosis fra enda kortere blinker som følge full exocytosis. Slike forhold ville fange både sammensatte og kyss-and-run exocytosis som kan deretter skilles basert på varigheten av signalet.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne erklære noen konkurrerende økonomisk interesse

Acknowledgments

Vi takker Dr. U. Ashery for sjenerøs gave cDNA. Vi takker Dr. G. Mass, L. Mittleman, M. Shaharbani og Y.Zilberstein fra Sackler mobilnettet og molekylære Imaging Center for deres uvurderlig hjelp med mikroskopi. Dette arbeidet ble støttet av USA-Israel Binational Science Foundation (grant 2013263 R. Sagi-Eisenberg, I. Hammel og S.J.Galli) og gi 933/15 fra Israel Science Foundation, grunnlagt av Israel akademiet for vitenskap (til R.Sagi-Eisenberg ) og NIH tilskudd U19 AI 104209 og R01 AR067145 (å S.J. Galli).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
DMEM low glucose Biological Inductries 01-050-1A
Fetal bovine serum Gibco 12657
Pen-strep-nystatin solution Biological Inductries 03-032-1B
L-Glutamine 200 mM solution  Biological Inductries 03-020-1A
FITC dextran 150K Sigma-Aldrich 46946-500MG-F
Trypsin/EDTA Solution B Biological Inductries 03-052-1A Warm in 37 °C water bath before use
Top-vacuum filter of 0.22 µm pore size  Sigma-Aldrich CLS430769-1EA
Cellulose acetate syringe filter unit, 0.22 µm pore size Sartorius 16534K
Chambered coverglass  Thermo scientific 155411
Corning tissue-culture treated culture dishes Sigma-Aldrich CLS430167
Bovine serum albumin Sigma-Aldrich A4503
Anti-DNP monoclonal IgE Sigma-Aldrich D8406
DNP-HSA (Ag) Sigma-Aldrich A6661  Avoid direct light exposure
Hepes buffer 1M, pH 7.4 Biological Inductries 03-025-1B
CaCl2 MERK 102382
Glucose BDH Laboratories 284515V
Ammonium chloride MERK 1145
PIPES dipotassium salt Sigma-Aldrich 108321-27-3
Calcium acetate hydrate Sigma-Aldrich 114460-21-8
Magnesium acetate tetrahydrate Sigma-Aldrich M5661
Potassium glutamate (L-Glutamic acid potassium salt monohydrate) Sigma-Aldrich G1501
NaH2PO4 MERK 6346
NaCl MERK 106404
MgCl2 MERK 105833
KCl MERK 104936
Electroporator  BTX ECM830
Confocal microscope, Zeiss Zeiss LSM 5 Pascal, Axiovert 200M Used in Figure 3. Equipped with an electronic temperature-controlled
airstream incubator
Confocal microscope, Zeiss Zeiss LSM 800, Axio Observer.Z1 /7 Used in Figure 2. Equipped with a GaAsP detector an electronic temperature-controlled
airstream incubator
Confocal microscope, Leica Leica SP5 Used in Figure 1. Equipped with a leica HyD detector and an top-stage incubator (okolab)
RBL-2H3 cells RBL-2H3 cells were cloned in the lab of Reuben P. Siraganian. See reference 67

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Wu, L. -G., Hamid, E., Shin, W., Chiang, H. -C. Exocytosis and endocytosis: Modes, functions, and coupling mechanisms. Annu Rev Physiol. 76, 301-331 (2014).
  2. Pickett, J. A., Edwardson, J. M. Compound exocytosis: Mechanisms and functional significance. Traffic. 7 (2), 109-116 (2006).
  3. Behrendorff, N., Dolai, S., Hong, W., Gaisano, H. Y., Thorn, P. Vesicle-associated membrane protein 8 (VAMP8) is a SNARE (soluble N-ethylmaleimide-sensitive factor attachment protein receptor) selectively required for sequential granule-to-granule fusion. J Biol Chem. 286 (34), 29627-29634 (2011).
  4. Kwan, E. P., Gaisano, H. Y. Glucagon-like peptide 1 regulates sequential and compound exocytosis in pancreatic islet beta-cells. Diabetes. 54 (9), 2734-2743 (2005).
  5. Hoppa, M. B., et al. Multivesicular exocytosis in rat pancreatic beta cells. Diabetologia. 55 (4), 1001-1012 (2012).
  6. Zhu, D., et al. Syntaxin-3 regulates newcomer insulin granule exocytosis and compound fusion in pancreatic beta cells. Diabetologia. 56 (2), 359-369 (2013).
  7. Vardjan, N., Jorgačevski, J., Stenovec, M., Kreft, M., Zorec, R. Compound exocytosis in pituitary cells. Ann N Y Acad Sci. 1152 (1), 63-75 (2009).
  8. Cochilla, A. J., Angleson, J. K., Betz, W. J. Differential regulation of granule-to-granule and granule-to-plasma membrane fusion during secretion from rat pituitary lactotrophs. J Cell Biol. 150 (4), 839-848 (2000).
  9. Mair, N., Haller, T., Dietl, P. Exocytosis in alveolar type II cells revealed by cell capacitance and fluorescence measurements. Am J Physiol. 276, 376-382 (1999).
  10. Carmo, L. A. S., et al. CD63 is tightly associated with intracellular, secretory events chaperoning piecemeal degranulation and compound exocytosis in human eosinophils. J Leukoc Biol. 100 (2), 391-401 (2016).
  11. Hafez, I., Stolpe, A., Lindau, M. Compound exocytosis and cumulative fusion in eosinophils. J Biol Chem. 278 (45), 44921-44928 (2003).
  12. Scepek, S., Lindau, M. Focal exocytosis by eosinophils - compound exocytosis and cumulative fusion. EMBO J. 12 (5), 1811-1817 (1993).
  13. Lollike, K., Lindau, M., Calafat, J., Borregaard, N. Compound exocytosis of granules in human neutrophils. J Leukoc Biol. 71 (6), 973-980 (2002).
  14. Mukai, K., Tsai, M., Starkl, P., Marichal, T., Galli, S. J. IgE and mast cells in host defense against parasites and venoms. Semin Immunopathol. 38 (5), 581-603 (2016).
  15. Galli, S. J., Tsai, M. IgE and mast cells in allergic disease. Nat Med. 18 (5), 693-704 (2012).
  16. Lundequist, A., Pejler, G. Biological implications of preformed mast cell mediators. Cell Mol Life Sci. 68 (6), 965-975 (2011).
  17. Blank, U. The mechanisms of exocytosis in mast cells. Adv Exp Med Biol. , 107-122 (2011).
  18. Cohen, R., Corwith, K., Holowka, D., Baird, B. Spatiotemporal resolution of mast cell granule exocytosis reveals correlation with Ca2+ wave initiation. J Cell Sci. 125 (12), 2986-2994 (2012).
  19. Harata, N. C., Aravanis, A. M., Tsien, R. W. Kiss-and-run and full-collapse fusion as modes of exo-endocytosis in neurosecretion. J Neurochem. 97 (6), 1546-1570 (2006).
  20. Cao, H., Chen, J., Awoniyi, M., Henley, J. R., McNiven, M. A. Dynamin 2 mediates fluid-phase micropinocytosis in epithelial cells. J Cell Sci. 120 (23), 4167-4177 (2007).
  21. Frost, B., Jacks, R. L., Diamond, M. I. Propagation of tau misfolding from the outside to the inside of a cell. J Biol Chem. 284 (19), 12845-12852 (2009).
  22. Saeed, M. F., Kolokoltsov, A. A., Albrecht, T., Davey, R. A. Cellular entry of ebola virus involves uptake by a macropinocytosis-Like mechanism and subsequent trafficking through early and late endosomes. PLoS Pathog. 6 (9), e1001110 (2010).
  23. Wang, J. T. H., Kerr, M. C., Karunaratne, S., Jeanes, A., Yap, A. S., Teasdale, R. D. The SNX-PX-BAR family in macropinocytosis: The regulation of macropinosome formation by SNX-PX-BAR proteins. PLoS One. 5 (10), e13763 (2010).
  24. Ohkuma, S., Poole, B. Fluorescence probe measurement of the intralysosomal pH in living cells and the perturbation of pH by various agents. Proc Natl Acad Sci U S A. 75 (7), 3327-3331 (1978).
  25. Thorn, P., Jang, Y. Visualization of exocytosis in pancreatic acinar cells by fluorescence microscopy. Pancreapedia Exocrine Pancreas Knowl Base. , (2011).
  26. Jaiswal, J. K., Andrews, N. W., Simon, S. M. Membrane proximal lysosomes are the major vesicles responsible for calcium-dependent exocytosis in nonsecretory cells. J Cell Biol. 159 (4), 625-635 (2002).
  27. Jaiswal, J. K., Fix, M., Takano, T., Nedergaard, M., Simon, S. M. Resolving vesicle fusion from lysis to monitor calcium-triggered lysosomal exocytosis in astrocytes. Proc Natl Acad Sci. 104 (35), 14151-14156 (2007).
  28. Lima, W. C., Leuba, F., Soldati, T., Cosson, P. Mucolipin controls lysosome exocytosis in Dictyostelium. J Cell Sci. 125 (9), 2315-2322 (2012).
  29. Ravdin, J. I., Murphy, C. F., Schlesinger, P. H. The cellular regulation of vesicle exocytosis by Entamoeba histolytica. J Protozool. 35 (1), 159-163 (1988).
  30. Blott, E. J., Griffiths, G. M. Secretory lysosomes. Nat Rev Mol Cell Biol. 3 (2), 122-131 (2002).
  31. Raposo, G., Fevrier, B., Stoorvogel, W., Marks, M. S. Lysosome-related organelles: A view from immunity and pigmentation. CELL Struct Funct. 27 (6), 443-456 (2002).
  32. Gaudenzio, N., et al. Different activation signals induce distinct mast cell degranulation strategies. J Clin Invest. 126 (10), 3981-3998 (2016).
  33. Klein, O., et al. Rab5 is critical for SNAP23 regulated granule-granule fusion during compound exocytosis. Sci Rep. 7 (1), 15315 (2017).
  34. Ichikawa, A. Fine structural changes in response to hormonal stimulation of the perfused canine pancreas. J Cell Biol. 24 (3), 369-385 (1965).
  35. Bloom, G. D., Haegermark, Ö A study on morphological changes and histamine release induced by compound 4880 in rat peritoneal mast cells. Exp Cell Res. 40 (3), 637-654 (1965).
  36. Bloom, G. D., Chakravarty, N. Time course of anaphylactic histamine release and morphological changes in rat peritoneal mast cells. Acta Physiol Scand. 78 (3), 410-419 (1970).
  37. Horsfield, G. I. The effect of compound 48/80 on the rat mast cell. J Pathol Bacteriol. 90 (2), 599-605 (1965).
  38. Alvarez de Toledo, G., Fernandez, J. M. Compound versus multigranular exocytosis in peritoneal mast cells. J Gen Physiol. 95 (3), 397-409 (1990).
  39. Fernandez, J. M., Neher, E., Gomperts, B. D. Capacitance measurements reveal stepwise fusion events in degranulating mast cells. Nature. 312 (5993), 453-455 (1984).
  40. Oberhauser, A. F., Robinson, M., Fernandez, J. M. Simultaneous capacitance and amperometric measurements of exocytosis: A comparison. Biophys J. 71 (2), 1131-1139 (1996).
  41. Nagamatsu, S., Ohara-Imaizumi, M. Imaging exocytosis of single insulin secretory granules with TIRF microscopy. Methods Mol Biol. 440, Humana Press. (2008).
  42. Akopova, I., et al. Imaging exocytosis of ATP-containing vesicles with TIRF microscopy in lung epithelial A549 cells. Purinergic Signal. 8 (1), 59-70 (2012).
  43. Joselevitch, C., Zenisek, D. Imaging exocytosis in retinal bipolar cells with TIRF microscopy. J Vis Exp. (28), e1305 (2009).
  44. Axelrod, D. Cell-substrate contacts illuminated by total internal reflection fluorescence. J Cell Biol. 89 (1), 141-145 (1981).
  45. Plattner, H., Artalejo, A. R., Neher, E. Ultrastructural organization of bovine chromaffin cell cortex-analysis by cryofixation and morphometry of aspects pertinent to exocytosis. J Cell Biol. 139 (7), 1709-1717 (1997).
  46. Eitzen, G. Actin remodeling to facilitate membrane fusion. Biochim Biophys Acta - Mol Cell Res. 1641 (2-3), 175-181 (2003).
  47. Becherer, U., Pasche, M., Nofal, S., Hof, D., Matti, U., Rettig, J. Quantifying exocytosis by combination of membrane capacitance measurements and total internal reflection fluorescence microscopy in chromaffin cells. PLoS One. 2 (6), e505 (2007).
  48. Wilson, J. D., Shelby, S. A., Holowka, D., Baird, B. Rab11 regulates the mast cell exocytic response. Traffic. 17 (9), 1027-1041 (2016).
  49. Makhmutova, M., Liang, T., Gaisano, H., Caicedo, A., Almaça, J. Confocal imaging of neuropeptide Y-pHluorin: A technique to visualize insulin granule exocytosis in intact murine and human islets. J Vis Exp. (127), e56089 (2017).
  50. Almaça, J., Liang, T., Gaisano, H. Y., Nam, H. G., Berggren, P. -O., Caicedo, A. Spatial and temporal coordination of insulin granule exocytosis in intact human pancreatic islets. Diabetologia. 58, 2810-2818 (2015).
  51. Dominguez, N., van Weering, J. R. T., Borges, R., Toonen, R. F. G., Verhage, M. Dense-core vesicle biogenesis and exocytosis in neurons lacking chromogranins A and B. J Neurochem. 144 (3), 241-254 (2017).
  52. Burrone, J., Li, Z., Murthy, V. N. Studying vesicle cycling in presynaptic terminals using the genetically encoded probe synaptopHluorin. Nat Protoc. 1 (6), 2970-2978 (2007).
  53. Steyer, J. A., Horstmann, H., Almers, W. Transport, docking and exocytosis of single secretory granules in live chromaffin cells. Nature. 388 (6641), 474-478 (1997).
  54. Zoccarato, F., Cavallini, L., Alexandre, A. The pH-sensitive dye acridine orange as a tool to monitor exocytosis/endocytosis in synaptosomes. J Neurochem. 72 (2), 625-633 (1999).
  55. Tsuboi, T., Rutter, G. A. Multiple forms of kiss-and-run exocytosis revealed by evanescent wave microscopy. Curr Biol. 13 (7), 563-567 (2003).
  56. Tsuboi, T., Zhao, C., Terakawa, S., Rutter, G. A. Simultaneous evanescent wave imaging of insulin vesicle membrane and cargo during a single exocytotic event. Curr Biol. 10 (20), 1307-1310 (2000).
  57. Tsuboi, T., Kikuta, T., Sakurai, T., Terakawa, S. Water secretion associated with exocytosis in endocrine cells revealed by micro forcemetry and evanescent wave microscopy. Biophys J. 83 (1), 172-183 (2002).
  58. Avery, J., et al. A cell-free system for regulated exocytosis in PC12 cells. J Cell Biol. 148 (2), 317-324 (2000).
  59. Larina, O., et al. Dynamic regulation of the large exocytotic fusion pore in pancreatic acinar cells. Mol Biol Cell. 18 (9), 3502-3511 (2007).
  60. Nemoto, T., et al. Sequential-replenishment mechanism of exocytosis in pancreatic acini. Nat Cell Biol. 3 (3), 253-258 (2001).
  61. Jaiswal, J. K., Chakrabarti, S., Andrews, N. W., Simon, S. M. Synaptotagmin VII restricts fusion pore expansion during lysosomal exocytosis. PLoS Biol. 2 (8), e233 (2004).
  62. Lasič, E., Stenovec, M., Kreft, M., Robinson, P. J., Zorec, R. Dynamin regulates the fusion pore of endo- and exocytotic vesicles as revealed by membrane capacitance measurements. Biochim Biophys Acta - Gen Subj. 1861 (9), 2293-2303 (2017).
  63. Bonnafous, P., Stegmann, T. Membrane perturbation and fusion pore formation in influenza hemagglutinin-mediated membrane fusion. A new model for fusion. J Biol Chem. 275 (9), 6160-6166 (2000).
  64. Balseiro-Gomez, S., Flores, J. A., Acosta, J., Ramirez-Ponce, M. P., Ales, E. Transient fusion ensures granule replenishment to maintain repeated release after IgE-mediated mast cell degranulation. J Cell Sci. 129 (21), 3989-4000 (2016).
  65. Eccleston, E., Leonard, B. J., Lowe, J. S., Welford, H. J. Basophilic leukaemia in the albino rat and a demonstration of the basopoietin. Nat New Biol. 244 (133), 73-76 (1973).
  66. Barsumian, E. L., Isersky, C., Petrino, M. G., Siraganian, R. P. IgE-induced histamine release from rat basophilic leukemia cell lines: isolation of releasing and nonreleasing clones. Eur J Immunol. 11 (4), 317-323 (1981).
  67. Azouz, N. P., Fukuda, M., Rothenberg, M. E., Sagi-Eisenberg, R. Investigating mast cell secretory granules; from biosynthesis to exocytosis. J Vis Exp. (95), e52505 (2015).
  68. Martin, T. F. J. Tuning exocytosis for speed: fast and slow modes. Biochim Biophys Acta - Mol Cell Res. 1641 (2-3), 157-165 (2003).
  69. Azouz, N. P., et al. Rab5 is a novel regulator of mast cell secretory granules: impact on size, cargo, and exocytosis. J Immunol. 192 (9), 4043-4053 (2014).
  70. Azouz, N. P., Matsui, T., Fukuda, M., Sagi-Eisenberg, R. Decoding the regulation of mast cell exocytosis by networks of Rab GTPases. J Immunol. 189 (5), 2169-2180 (2012).
  71. Beraldo, W. T., Silva, W. D., Fernandes, A. D. L. Ihibitory effects of carbohydrates on histamine release and mast cell disruption by dextran. Br J Pharmacol Chemother. 19 (3), 405-413 (1962).
  72. Oda, T., Kodama, N., Arizona, K. K. Ketotifen, a mast cell stabilizer, protects dextran sulfate sodium (DSS)-induced colitis in rats. Gastroenterology. 108 (4), a887 (1995).
  73. Sagi-Eisenberg, R., Geller-Bernstein, C., Ben-Neriah, Z., Pecht, I. Direct measurements of the dextran-dependent calcium uptake by rat peritoneal mast cells. FEBS Lett. 161 (1), 37-40 (1983).
  74. Hanahoe, T. H. Mechanism of histamine release from rat isolated peritoneal mast cells by dextran: the role of immunoglobulin E. Agents Actions. 14 (3-4), 468-474 (1984).
  75. Harris, J. M., West, G. B. Rats resistant to the dextran anaphylactoid reaction. Br J Pharmacol Chemother. 20, 550-562 (1963).
  76. Baxter, J. H., Adamik, R. Temperature dependence of histamine release from rat mast cells by dextran. Proc Soc Exp Biol Med. 146 (1), 71-74 (1974).
  77. Chakravarty, N., Goth, A., Sen, P. Potentiation of dextran-induced histamine release from rat mast cells by phosphatidyl serine. Acta Physiol Scand. 88 (4), 469-480 (1973).
  78. Baxter, J. H. Role of Ca++ in mast cell activation, desensitization, and histamine release by dextran. J Immunol. 111 (5), 1470-1473 (1973).
  79. Chen, H. -Y., et al. Nanoimaging granule dynamics and subcellular structures in activated mast cells using soft X-ray tomography. Sci Rep. 6 (1), 34879 (2016).

Tags

Biologi problemet 136 FITC-dekstran regulert exocytosis sammensatte exocytosis levende celle bildebehandling lysosome-relaterte organeller pinocytosis
Imaging FITC-dekstran som en Reporter regulert Exocytosis
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Klein, O., Roded, A., Hirschberg,… More

Klein, O., Roded, A., Hirschberg, K., Fukuda, M., Galli, S. J., Sagi-Eisenberg, R. Imaging FITC-dextran as a Reporter for Regulated Exocytosis. J. Vis. Exp. (136), e57936, doi:10.3791/57936 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter