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Valutazione di salute basati su autopsia pesce selvatico

Published: September 11, 2018 doi: 10.3791/57946
Automatic Translation
1, 2, 1, 2
1National Fish Health Research Laboratory, Leetown Science Center, U.S. Geological Survey, 2School of Natural Resources, West Virginia University

Summary

La salute dei pesci selvatici può essere utilizzata come indicatore di salute dell'ecosistema acquatico. Le valutazioni basate su autopsia pesce salute forniscono documentazione di lesioni visibili o anomalie, i dati utilizzati per calcolare indici di condizione, nonché la possibilità di raccogliere i tessuti per la valutazione microscopica, espressione genica e altri più in profondità analisi.

Abstract

Influenze antropiche da maggiore di nutrienti e contaminanti chimici, a habitat alterazioni e cambiamenti climatici, possono avere effetti significativi sulle popolazioni ittiche. Monitoraggio, gli effetti negativi che utilizzano biomarcatori dal organismal a livello molecolare, possono essere utilizzati per valutare gli effetti cumulativi per pesci e altri organismi. Salute dei pesci è stato utilizzato in tutto il mondo come un indicatore della salute dell'ecosistema acquatico. La valutazione di salute basati su autopsia pesce fornisce dati su visibili anomalie e lesioni, parassiti, condizione e organosomatic indici. Questi può essere paragonati per sito, stagione e sesso, come pure temporaneamente, al cambiamento di documento nel corso del tempo. Livelli di gravità possono essere assegnati a varie osservazioni per calcolare un indice di salute di pesce più valutazione quantitativa. Uno svantaggio della valutazione basata su autopsia è che si basa su osservazioni visive e fattori di condizione, che non sono così sensibili come tessuto e subcellulare biomarcatori per la determinazione degli effetti subletali. Inoltre, è raramente possibile identificare cause o fattori di rischio connessi con anomalie osservate. Così, per esempio una lesione alzata o un "tumore" sulle pinne, labbra o superficie del corpo può essere un neoplasma. Tuttavia, potrebbe anche essere una risposta a un parassita, l'infiammazione cronica o iperplasia delle cellule normali in risposta ad un irritante. Al contrario, neoplasie, alcuni parassiti, altri agenti infettivi e molti cambiamenti del tessuto non sono visibili e quindi possono essere sottovalutati. Tuttavia, durante l'autopsia-ha basato la valutazione, sangue (plasma), tessuti per l'istopatologia (patologia microscopica), genomica e altre analisi molecolari e otoliti per invecchiamento possono essere raccolti. Queste analisi a valle, insieme analisi geospaziale, valutazioni di habitat, analisi di qualità e contaminanti dell'acqua possono essere importanti nella valutazione di ecosistema globale.

Introduction

Attività umane hanno numerosi effetti contrari su ambienti acquatici. Pesci abitano vari corpi di acqua che la popolazione umana ricrea e spesso utilizza come una fonte di acqua potabile e quindi sono importanti indicatori della salute dell'ambiente acquatico. Pesci selvatici che vivono e si riproducono in un habitat particolare sono esposti per tutta la vita a vari fattori di stress tra cui gli agenti patogeni, parassiti, cattiva qualità dell'acqua e contaminanti chimici. Migliaia di sostanze chimiche entrano nostri corsi d'acqua attraverso acque reflue industriali e umana, urbano/suburbano delle acque piovane e scolo agricolo. Queste complesse miscele di sostanze chimiche possono avere additivi, sinergici o effetti antagonistici su esposti organismi1,2,3. Inoltre, altri fattori di stress ambientali elevate come nutrienti, temperatura elevata, basso ossigeno disciolto o fluttuante pH può esacerbare gli effetti di contaminanti chimici4,5. Fattori di stress ambientale può anche influenzare i risultati malattia infettiva direttamente dall'aumento del numero di agenti infettivi6, aumentando la virulenza dei patogeni opportunisti7 o sopprimere la risposta immunitaria e la malattia resistenza dell'ospite8,9,10. Per questi motivi, c'è un crescente interesse in effetti biologici o avversi monitoraggio11,12,13,14, utilizzando pesci ed altri organismi acquatici per identificare popolazioni e degli ecosistemi a rischio.

Gli effetti negativi di monitoraggio utilizza biomarcatori a vari livelli dell'organizzazione, dalla organismal al subcellulare o molecolare, per identificare effetti subletali, che potrebbero influenzare le popolazioni ed essere indicativa di esposizione ai vari fattori di sforzo. Indicatori a livello di organismo includono condizioni e anomalie visibili. Indici di condizione basati su peso e lunghezza sono calcolati per valutare il benessere o idoneità delle popolazioni di pesci. Il più comune è fattori di condizione di Fulton (K) = (peso/lunghezza3) 15. Un altro indicatore è la presenza di anomalie visibili. Una varietà di metodi sono stati utilizzati in studi individuali e programmi di monitoraggio per valutare, documento e valutare le anomalie visibili. Valutazione basata solo sulle anomalie esterne, vale a dire, la percentuale di individui con malattia, danni pinna, i tumori e le anomalie scheletriche, è uno dei parametri per l'indice di integrità biotica (IBI) che valuta la comunità salute16. Una valutazione analoga definita deltoidi (deformità, erosioni, lesioni, tumori) è stata utilizzata anche per valutare la salute del pesce comunità17. Tuttavia, questi metodi solo valutano anomalie visive esterne e interne non lesioni o indicatori precoci subletali.

Valutazioni basate su autopsia includono osservazioni interne ed esterne e consentono la misurazione degli indici di condizione aggiuntiva. Indice di Hepatosomatic (peso corporeo totale/peso del fegato) è stato utilizzato anche come indicatore di forma fisica o riserve di energia15 per il quale un valore di indice più alto indica il pesce più sano. Tuttavia, una serie di studi hanno dimostrato che l'ipertrofia o un aumento delle dimensioni del fegato si verifica a causa di esposizione a contaminanti vari metabolizzato dal fegato18,19,20. In questo caso un indice più alto sarebbe indicativo di esposizione a determinate classi chimiche. L'indice di gonadosomatic (gonade peso/totale del peso corporeo) è un altro indice di condizione diretto verso salute riproduttiva21. Osservazioni fatte durante la valutazione basata su autopsia possono essere utilizzate per confrontare la prevalenza di tipi di ogni singola lesione o la percentuale di individui normali. Tuttavia, essi utilizzabile anche in un più quantitativa salute valutazione22,23.

La valutazione standardizzata basata su autopsia qui descritta può essere utilizzata per aumentare la valutazione grossolanamente visibile in diversi modi a seconda delle domande a cui rispondere, competenze e altre risorse disponibili. Il nostro approccio sistematico è quello di raccogliere dati biometrici (lunghezza, peso, peso del fegato, peso gonade), di sangue per analisi di plasma/siero, le anomalie interne ed esterne visibili documento, conservano pezzi di organi per analisi microscopiche e raccolgono otoliti per analisi di età. La valutazione basata su autopsia plus analisi di età e l'istopatologia di vari organi, permette per il calcolo e confronto di vari indici di condizione, la prevalenza di anomalie visibili, come pure i cambiamenti microscopici del tessuto, dal sesso, età, sito e periodo di campionamento. Collezioni di tessuto supplementare possono essere fatto per molte altre analisi tra cui la microscopia elettronica, batteriologia, virologia, parassitologia e concentrazioni chimiche. Questi metodi possono anche essere parte di analisi più approfondite, utilizzato per diagnosticare la causa del pesce uccide24 o mortalità del prigioniero pesci25. Metodi per la raccolta del tessuto per due ulteriori analisi, espressione genica e le analisi funzionali immuni sono illustrati.

Protocol

Metodi descritti qui sono stati approvati dal comitato di uso e istituzionali Animal Care la Leetown Science Center.

1. pesce Collection

  1. Raccogliere pesci vivi con un minimo di stress. Utilizzare electrofishing barca o nello zaino, gancio e linea o reti.
  2. Tenere i pesci in streaming in pozzi o contenitori aerati fino al campionamento.
    Nota: L'American Fisheries Society ha pubblicato una serie di guide per pesci raccolta, trattamento e anestesia/eutanasia26,27,28. Indossare guanti durante la manipolazione di pesce.

2. pesce autopsia

  1. Eutanasia di un pesce.
    1. Mettere il pesce nell'anestetico fino a opercular movimento cessa e il pesce perde equilibrio. Dopo un altro 2 – 10 min il pesce sarà essere euthanized; Tuttavia, questo può anche variare da specie.
      Nota: Il pesce può essere euthanized con un numero di anestetici (Vedi Tabella materiali per più comunemente usato). Il metodo dell'eutanasia dipenderà le misurazioni di laboratorio saranno condotte su tessuti raccolti29.
  2. Caratteristiche biometriche di misura.
    1. Pesare il pesce al grammo più vicino.
    2. Misurare la lunghezza del pesce al millimetro più vicino.
      1. Misurare la lunghezza totale dalla punta del muso con la bocca chiusa fino alla fine della coda quando pizzicato insieme.
      2. Misurare la lunghezza della forcella dalla forcella nella coda fino alla punta del muso e la lunghezza standard dalla punta del muso all'estremità del corpo (inizio della coda).
    3. Calcolare il fattore di condizione utilizzando la seguente formula:
      Fattore di condizione = (peso corporeo totale - peso gonade) / totale lunghezza3.
      Nota: Peso gonade viene sottratto dal peso totale del corpo poiché gonadi possono contribuire significativamente al peso totale del corpo, specialmente nel prespawn pesce femmina.
  3. Ottenere un campione di sangue.
    Nota: Sangue è più comunemente adottate dalla vena caudale, ma può anche essere ritirato dall'aorta dorsale o di cardiaco puntura30.
    1. Prelevare un campione di sangue periferico dalla vena caudale con un ago da 22 o 23 G su una siringa da 1 a 5 mL, a seconda delle dimensioni del pesce. Inserire l'ago anteriore della zona caudale sotto la linea laterale (Figura 1A e 1B). Angolo di verso l'alto fino a colpire la colonna vertebrale e poi ritirare leggermente. La vena è ventrale al rachide sovrastante.
      Nota: Se vengono effettuati strisci di sangue o siero è necessario, non viene utilizzato anticoagulante. Nella maggior parte dei casi, al plasma sarà raccolti e, quindi, un anticoagulante come il litio, EDTA o eparina di sodio è usato per rivestire l'ago e la siringa ed è anche nel tubo di raccolta di sangue (ad es., vacutainer).
    2. Rimuovere l'ago e collocare in un apposito contenitore di smaltimento prima di mettere il sangue nella provetta di raccolta.
      Nota: Sangue possono svolgersi sul ghiaccio, ma dipende da analisi successive devono essere centrifugati appena possibile30.
    3. Se saranno valutati anomalie nucleari o differenziali conteggi di anima, immediatamente mettere una goccia di sangue su vetrini da microscopio duplicati vetro pulito. Nuovamente una diapositiva seconda un'angolazione di 45° dentro la goccia, che viene quindi disegnata su tutta la superficie per capillarità. Lasciare asciugare all'aria31.
    4. Centrifugare il sangue a 1.500-2.500 x g per 15 min di sedimentare le cellule. Plasma/siero con una pipetta da trasferimento sterile, aliquota nei flaconi di criogenici, di rimuovere e conservare a-80 ° C.

Figure 1
Figura 1 : Come ottenere un campione di sangue da un pesce. (A), A recentemente eutanasizzato pesce è disposto su un fianco e la linea laterale si trova. (B), un ago è inserito ventrali laterali linea (freccia), angolato verso l'alto fino a quando l'ago tocca la spina dorsale. Quindi è leggermente ritirato ed aspirazione iniziato a prelevare il sangue. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

  1. Effettuare una valutazione di salute basato su autopsia su ogni pesce.
    Nota: Un numero di pubblicazioni che illustrano e descrivono le lesioni e le anomalie è disponibili32,33,34,35.
    1. Documento esterne anomalie compreso le lesioni sulla superficie del corpo e pinne (Figura 2), gli occhi e branchie (Figura 3), parassiti esterni come sanguisughe (Figura 2D), larve o cisti del trematode metacercarial (Figura 2D, 3B) e parassiti (Figura 3D) della branchia. Documento tipo, posizione e dimensione delle anomalie osservate sui fogli di dati, anche come fotograficamente, se possibile.
    2. Aprire la cavità addominale (Figura 4A) utilizzando un paio di forbici da taglio dal zona anale per opercolo e quindi rimuovendo il lembo del muscolo per esporre gli organi interni.
      Nota: Se Rene anteriore verrà raccolti per immunitario funzione (vedi passaggio 5 qui sotto) o campioni raccolti per batteriologia o virologia, la superficie del corpo esterno deve essere disinfettata con alcol al 70% e quei campioni dovrebbero essere ottenuti prima di eseguita l'autopsia. Se i tessuti vengono utilizzati solo per le osservazioni visive, analisi del plasma e una tecnica sterile l'istopatologia non è necessaria.
    3. Documento interne anomalie (Figura 4) compreso gli sbiadimenti generali o focali dei vari organi (Figura 4B-4D), presenza di sollevato zone (Figura 4E), cisti, parassiti e dimensioni (anomalie allargata, atrofizzati).

Figure 2
Figura 2 : Esempi di lesioni visibili osservati sulla superficie del corpo e pinne dei pesci. (A), A piccola, leggermente erosa lesione (freccia) sulla superficie del corpo laterale. (B), una grande area arrossata (freccia) che coinvolge la superficie caudale del corpo. (C) alzato, nere lesioni (frecce) sulla superficie del corpo e pinne. (D) sanguisughe (freccia bianca) e piccole macchie nere (frecce nere) sulla pinna. Barra della scala = 3 mm. (E) A sollevato, lesione multilobed, pallida (freccia) sulla superficie del corpo. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 3
Figura 3 : Esempi di lesioni visibili delle branchie e occhi di pesce. (A) A pale zona (freccia) all'interno della lente dell'occhio. Barra della scala = 5 mm (B) bianco cisti (frecce bianche) e piccole macchie nere (frecce nere) causate da parassiti del trematode sull'opercolo che coprono le branchie (a). Barra della scala = 1 cm. (C) una pallida, erosa zona (freccia) il branchia (a). Barra della scala = 5 mm (D) una branchia che è stato rimosso da parassiti (frecce) attaccata i filamenti di gill. Barra della scala = 2 mm. per favore clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 4
Figura 4: Esempi di un'autopsia e le anomalie interne dei pesci. (A) durante un'autopsia il pesce viene tagliato aperto (lungo la freccia bianca) e una falda del muscolo (freccia nera) rimosso per esporre la gonade (a) e della milza, tenuti da pinze e forbici. (B) chiazzato del fegato (a), testicoli (b), intestino circondato da adiposo grasso (c) e stomaco (d). Barra della scala = 5 mm (C) del fegato (a) con una zona rossa scura (freccia), ovaio (b) e dell'intestino (c). Barra della scala = 5 mm (D) del fegato con zone scolorite verdastri (frecce). Barra della scala = 1 cm. (E) esempio di un normale (a) e anormale (b) testicoli con noduli hanno sollevato. Barra della scala = 1 cm. per favore clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

  1. Ottenere l'indice di hepatosomatic (HSI).
    1. Rimuovere fegato da recidere l'arteria epatica e il tessuto connettivo della parte anteriore. Sollevare delicatamente fuori mentre le adesioni di rifilatura e altre connessioni a intestino e di grasso sottocutaneo. Fare attenzione a non forare la cistifellea. Pesare il fegato.
      Nota: Alcuni pesci, come i ciprinidi, non avere un fegato discreto ma piuttosto epatico tessuto avvolto intorno intestini e altri organi. Per queste specie, potrebbe non essere possibile ottenere pesi del fegato.
    2. Calcolare l'indice di hepatosomatic (HSI) utilizzando la formula:
      HSI = peso corporeo totale/peso del fegato
  2. Calcolare l'indice di gonadosomatic.
    1. Rimuovere le gonadi e pesarlo.
    2. Calcolare l'indice di gonadosomatic (GSI) utilizzando la formula:
      GSI = gonade peso/totale peso corporeo

3. conservare i tessuti per patologia microscopica

Nota: Un numero di fissativi compreso 10% formalina neutra tamponata e Z-fix, un fissativo a base di formalina con zinco, può essere utilizzato per la conservazione del tessuto nel campo. Quest'ultimo è preferibile se possono essere utilizzati metodi quali ibridazione in situ o macchiatura dell'anticorpo fluorescente.

  1. Accuratamente tagliato ma non estrarre campioni di tessuto. Tenere pezzi di tessuto individuale < 2 cm nel formato e < 5 mm di spessore per il corretto fissaggio. Come regola generale, utilizzare circa 10 volte più fissativo in volume che il tessuto per una buona conservazione. Posizionare tutti i campioni di tessuto da un pesce nello stesso contenitore di dimensioni adeguate, a seconda delle dimensioni del pesce campionata a perfetta tenuta.
  2. Sistemare eventuali anomalie esterne nel contenitore fissativo. Inoltre, anche un pezzo di tessuto normale adiacente.
    Nota: Impropria manipolazione come compressione o altri danni meccanici, lunga esposizione all'aria o alla luce del sole e congelamento può causare artefatti.
  3. Tagliare almeno cinque pezzi di 3 – 4 mm spessore del fegato da varie regioni e inserire nel contenitore del fissativo. Includere aree normali ed anormali, se osservato.
  4. A seconda delle dimensioni, inserire una gonade intera o più pezzi lungo una gonade nel contenitore del fissativo.
  5. Posto di organi interi, se piccoli, o pezzi di tutti gli altri organi (milza, rene anteriore e posteriore, branchie, cuore, intestino e stomaco) nel contenitore di fissativo. Se si osserva un tessuto anormale, preservare un pezzo adiacente del tessuto normale pure.

4. rimuovere gli otoliti per analisi di età

Nota: L'età può essere una variabile importante in studi di salute malattia/pesce di pesce. Mentre un numero di strutture, comprese le scale e spine, è stato utilizzato per la determinazione dell'età, confronto delle strutture di maggior parte degli studi hanno trovato otoliti per dare i migliori risultati36,37. Pesci teleostei hanno tre paia di otoliti - lapilli, sagitta e asteriscus. In genere, otoliti sagittale o lapilli sono raccolti per invecchiamento anche se che possono variare da specie. Tecniche di rimozione e di invecchiamento sono stati descritti in precedenza38.

  1. Tagliare attraverso l'istmo di gill e piegare la testa indietro. Striscia via muscolare e connettivo tessuto attorno alle porzioni inferiori del neurocranio per individuare i bullae prootic, una zona rialzata ossuta.
  2. Punteggio ottenuto o tagliati con le taglierine di osso e crack per esporre otoliti. Essi possono essere visti ad occhio nudo.
  3. Posizionare gli otoliti in un flaconcino, etichettato o una busta di moneta e conservare a temperatura ambiente fino all'analisi per età contando gli anelli o incrementi di38. Se messa in una fiala, aprire il tappo una volta tornato al laboratorio e permettono di accuratamente asciugare prima dell'archiviazione.

Figure 5
Figura 5 : Rimozione di otoliti. (A) l'istmo è tagliato e il tessuto connettivo e muscolare tirato via per esporre la base della spina dorsale e neurospinal zona. (B), l'osso è rotto per esporre otoliti. (C) Lapillar otoliti vengono rimossi. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

5. ottenere il tessuto per le analisi di funzione Immune

Nota: Il rene anteriore è l'organo principale ematopoietica, la fonte dei linfociti e dei macrofagi per saggi funzionali e dovrà essere rimossi in modo asettico se cellule saranno coltivate per saggi funzionali, ad esempio mitogenesis, fagocitaria e possibilità di uccisione di macrofagi39,40.

  1. Spruzzare la superficie esterna del pesce con etanolo al 70%. Utilizzare forbici sterili, un bisturi e pinze per aprire la cavità addominale e rimuovere il tessuto del rene anteriore, che è un organo rosso scuro situato anteriormente la vescica natatoria.
  2. Posizionare il campione di rene anteriore nei mezzi di comunicazione (diad es., Leibovitz L-15) per mantenere in vita le cellule. Omogeneizzare campioni del rene con una smerigliatrice portatile sterili per tessuti (ad es., Tenbroeck tessuto smerigliatrice) nelle sospensioni di singola cellula. Tenere il ghiaccio bagnato fino al ritorno al laboratorio.

6. preservare il tessuto per l'analisi degli acidi nucleici

Nota: Se sarà condotta l'analisi molecolare a valle, ad esempio di espressione genica mediante trascrizione abbondanza41 o quantitative PCR42 (reazione a catena della polimerasi), mettere i pezzi di tessuto da valutarsi in un conservante appropriato ( ad esempio, soluzione di stabilizzazione RNAlater) appena possibile.

  1. Per la conservazione di RNA, mettere due o tre piccoli (2 – 3 mm) pezzi nel conservante appropriato a un rapporto di 10:1 di conservante volume al tessuto.
    Nota: Campioni dovrebbero essere al riparo da luce solare o calore eccessivo e trasportati su ghiaccio bagnato.
  2. Per la conservazione del DNA, inserire due o tre piccoli pezzi di tessuto in etanolo al 95% (etanolo di 10:1 al tessuto in volume). Quindi tenere i campioni su ghiaccio bagnato e quindi conservare a-20 ° C.

Representative Results

Grandi laghi aree di preoccupazione (AOC) sono aree geografiche che sono state designate a causa di menomazioni di vari usi benefici. Una delle menomazioni uso benefico (BUIs) in molti AOC è i tumori di pesce o altre deformità. Milioni di dollari sono stati spesi per il recupero e restauro di ognuna di queste aree al fine di rimuovere dalla lista i vari BUIs e, in definitiva, l' AOC43. I criteri di esclusione dalle negoziazioni del tumore di pesce che bui è diversa da stato a stato (Vedi epa.ohio.gov/portals/35/lakeerie/ohio_AOC_delisting_guidance.pdf e dnr.wi.gov/topic/GreatLakes/documents/SheboyganRiverFinalReport2008.pdf); Tuttavia, come indicato nei documenti di delisting, c'è un requisito per determinare la prevalenza di tumori del fegato e in alcuni casi di tumori della pelle. In molti casi, la prevalenza viene confrontata con un sito di riferimento non-AOC.

Il tumore di pesce BUI è stato valutato a tre AOCs (fiume di St. Louis, Milwaukee River e fiume Sheboygan) e un sito di riferimento non-AOC (Kewaunee fiume) su laghi superiore e il Michigan, utilizzando una valutazione basata su autopsia di ventosa bianco (Catostomus commersonii ), seguita dalla patologia microscopica della pelle e del tessuto del fegato. Pesci sono stati raccolti dai fiumi Milwaukee, Sheboygan e Kewaunee nel 2012 e 201344 e dal fiume St. Louis nel 2015 (dati non pubblicati). Duecento bianche ventose sono state valutate da Milwaukee, Kewaunee e St. Louis e 193 di Sheboygan.

Per definizione, un tumore può essere qualsiasi area rialzata o gonfiore, anche se si ritiene generalmente che un gonfiore causato da una crescita anormale del tessuto con le cellule anormali è sia un neoplasma benigno o maligno. Sucker bianco raccolti da tutti i siti hanno esibito una varietà di lesioni alzate esterne tra cui discreti, piccole macchie bianche, grandi aree bianche, lesioni mocosa leggermente rialzate e multilobed aree in rilievo sulla superficie del corpo e labbra (Figura 6). Pesci sono sono pesati e misurati per ottenere un fattore di condizione, le anomalie interne ed esterne sono state documentate e tessuto del fegato e della pelle è stato raccolto per l'istopatologia.

Figure 6
Figura 6 : Pelle sollevata le lesioni osservate sul pollone bianco dai grandi laghi. (A) un discreto punto bianco sulla superficie del corpo. Barra della scala = 5 mm. (B) un leggermente sollevata mucoide (frecce) e multilobed lesioni (a) sulla superficie del corpo posteriore. Barra della scala = 1 cm. (C) A grande multilobed lesione sulla superficie corporea. Barra della scala = 1 cm. (D) multi-lobed numerose lesioni sulle labbra. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

La percentuale di pesce con i tumori esterni o sollevato scolorita zone hanno variati da 15,5% presso il COA di St. Louis a 58,0% presso il COA di Milwaukee. In generale, le macchie bianche discrete erano meno comune lesione visual mentre il labbro multilobed e lesioni superficiali corpo erano più comuni. Il numero di pesci con i noduli del fegato osservabili era basso, che vanno da 1,5% a Kewaunee e St. Louis al 2,5% a Milwaukee (tabella 1).

Fiumi e anno campionati
Lesioni visibili Kewaunee 2013 St. Louis 2015 Sheboygan 2012 Milwaukee 2013
Macchie bianche discreti 16 3 3.1 5
Mucoide 20 9.5 9,8 30,5
Multilobed 22,5 3 29.5 40
Totale generato pelle anomalieun 46 15.5 38,3 58
Noduli del fegato visibili 1.5 1.5 1.6 2.5
un Numero totale di pesce con lesioni alzate. Alcuni pesci avevano più tipi di anomalie.

Tabella 1: Osservazioni basate su autopsia di Sucker bianco raccolti in grandi laghi aree di preoccupazione e un sito di riferimento (Kewaunee River), presentati come una percentuale.
Esame visivo può essere utilizzato per documentare la percentuale di pesce con varie anomalie. Tuttavia, per diagnosticare definitivamente la presenza ed il tipo di neoplasia, tessuti devono essere esaminati microscopicamente (istopatologia). Su esame al microscopio, è emerso che non tutte le lesioni alzate erano neoplastiche. Molti i discrete macchie bianche e le lesioni mocosa, particolarmente a Kewaunee, erano lesioni hyperplastic anziché neoplasia (tabella 2). Inoltre, a Kewaunee e St. Louis, tutti i tumori della pelle osservati erano papillomas benigni. A Sheboygan e Milwaukee sia papillomi e carcinomi a cellule squamose, i tumori maligni della pelle, sono stati osservati (tabella 2).

Fiumi a campionamento
Tipo di neoplasma Kewaunee 2013 St. Louis 2015 Sheboygan 2012 Milwaukee 2013
Papilloma 21 5.2 30,5 37.5
Carcinoma a cellule squamose 0 0 2.1 10.5
Neoplasie della pelle totale 21 5.2 32,6 48
Dotto biliare neoplasieun 2.5 4 6.2 9.5
Cellula epatica neoplasieb 1 0 2.1 8
Neoplasie del fegato totale 3.5 4 8.3 15.0c
un Include cholangioma e colangiocarcinoma
b Include la cellula epatica adenoma e carcinoma a cellule epatiche
c Alcuni pesci avevano sia dei dotti biliari e neoplasie epatiche

Tabella 2: Verificate microscopicamente lesioni neoplastiche di Sucker bianco raccolti in grandi laghi aree di preoccupazione e un sito di riferimento (Kewaunee River), presentati come una percentuale.
L'analisi istopatologica identificato anche tumori del fegato che non sono stati identificati tramite l'osservazione visiva. Mentre solo l'1,5% dei pesci raccolti da Kewaunee e St. Louis ha avuto noduli del fegato visibili (tabella 1), 3,5% e 4,0%, rispettivamente, erano microscopicamente identificati neoplasie (tabella 2). Una differenza più grande è stato visto a Sheboygan (1,6% visibile contro 8,3% al microscopio) e Milwaukee (2,5% visibile rispetto al 15,0% al microscopio). L'esame al microscopio fornisce anche una differenziazione dei neoplasma del dotto biliare contro l'origine delle cellule epatiche (tabella 2) e benigno contro i tumori maligni.

Discussion

La valutazione basata su autopsia di salute dei pesci può essere utilizzata su qualsiasi specie di pesce per cui il ricercatore ha una comprensione dell'aspetto normale delle strutture esterne ed interne. Utilizzando un approccio standardizzato consente confronti tra siti e specie, nonché cambiamenti stagionali e temporale in una popolazione. I risultati possono essere utilizzati per identificare gli effetti associati con punto e nonpoint fonti di contaminanti e di informare le azioni di gestione. Può anche essere utilizzato per monitorare i miglioramenti una volta avviate azioni di gestione. La metodologia può essere modificata per aumentare la documentazione di anomalie visive esterne in una varietà di modi. Valutazioni, basate solo su osservazioni visive, possono essere non letali, relativamente poco costoso e dati possono essere generati rapidamente per un gran numero di individui. Di conseguenza, possono essere utili per le valutazioni esplorative o iniziale, per monitorare il cambiamento nel tempo o in combinazione con altri indicatori. Se la lunghezza e il peso del pesce sono misurati durante le osservazioni visive, il fattore di condizione può anche essere calcolato. Anche se le valutazioni basate solo su osservazioni visive non forniscono informazioni sulla causa o fattori di rischio associati, tendenze a lungo termine di determinate anomalie di pelle45 e parametri biometrici46 hanno indicato il miglioramento in alcune zone associato con miglioramento della qualità dell'acqua.

La valutazione basata su autopsia fornisce ulteriori informazioni come gli organi interni sono anche esaminati e altri fattori di condizione come indice di hepatosomatic e gonadosomatic possono essere calcolati. Goede e Barton22 sviluppato un metodo di autopsia di campo che comprendeva i parametri del sangue, fattori biometrici, la percentuale di anomalie e valori di indice per le anomalie specifiche. Un perfezionamento del metodo incluso un livello di gravità per alcune variabili che consentiti per il calcolo di un indice di valutazione di salute che poteva essere confrontati statisticamente23. Questo indice di valutazione di salute è stato utilizzato nel sito regionale confronti23,47,48 e in combinazione con altri indicatori biologici tra cui plasma e analisi istopatologiche in US geologico Dell'indagine biomonitoraggio di stato ecologico e tendenze programma valutare potenziali effetti di esposizione a contaminanti in grandi fiumi a livello nazionale49,50,51. Un indice di malattia pesce basato su visibile esternamente malattie e parassiti, neoplasie del fegato visibile e altri histopathologically rilevato lesioni epatiche è stato sviluppato e utilizzato estesamente nel mare del Nord, Mar Baltico e largo dell'Islanda. Questo indice è stato trovato per essere uno strumento importante come un ecosistema salute indicatore52.

Ci sono alcuni fattori critici nel condurre la valutazione basata su autopsia sul pesce. In primo luogo, le valutazioni devono essere effettuate su pesce immediatamente dopo la morte. Cambiamenti nel colore dell'organo e coerenza possono accadere abbastanza rapidamente dopo la morte. Inoltre, alcuni parassiti possono lasciare l'host subito dopo la morte. In secondo luogo, è importante sapere che cosa è normale per le specie di interesse. Per esempio, alcuni pesci hanno normalmente grassi e di conseguenza, pallido fegati, mentre per la maggior parte delle specie un fegato pallido sarebbe anormale. È anche importante riconoscere i cambiamenti stagionali che si presentano naturalmente. Alcuni pesci avranno cambiamenti di colore o tubercoli di allevamento si sviluppano durante la stagione riproduttiva.

Le limitazioni della valutazione basata su autopsia come metodo per la valutazione di salute di pesce comprendono l'incapacità di identificare 1) costantemente la "causa" delle lesioni specifiche e 2) identificare gli effetti che potrebbero non essere visibili ad occhio nudo. Questi inconvenienti possono essere superati con l'aggiunta di istopatologia, identificazione molecolare o culturali di agenti patogeni e parassiti e l'espressione genica. Ad esempio, un "tumore" o lesione alzata (gonfiore) può essere effettivo neoplasia o può essere un parassita, infiammazione, edema o iperplasia (aumento nel numero delle cellule normali), causata da esposizione a sostanze chimiche, agenti infettivi o altri agenti irritanti. Come mostrato nei risultati rappresentativi, definitiva del tumore o neoplasia diagnosi richiede patologia microscopica per identificare il tipo di lesione e la gravità (cioè, benigni o maligni). Valutazione di ventosa bianco esterno "tumori" di osservazione visiva sovrastimato la prevalenza, in particolare presso il sito di riferimento. Molte delle lesioni alzate non erano neoplasma ma lesioni hyperplastic piuttosto. Attualmente non è noto se queste lesioni hyperplastic sono pre-neoplastiche. Al contrario, l'osservazione di rilievo noduli nel fegato significativamente sottovalutato la prevalenza delle neoplasie del fegato. Quindi, raccolta di tessuto per patologia microscopica era necessaria per affrontare adeguatamente il potenziale esclusione dalle negoziazioni.

Disclosures

Gli autori non hanno nulla a rivelare.

Acknowledgments

Questo lavoro è stato finanziato dal ecosistemi di U.S. Geological Survey (ambienti di Chesapeake Bay e pesca) e programmi di salute ambientale (contaminanti biologia) e la West Virginia Department of Natural Resources. Uso dei nomi commerciali è solo a fini di identificazione e non implica l'approvazione dal governo statunitense.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Folding tables Any
Folding chairs Any
Dissecting boards Any
Measuring board (mm) Any
Battery powered scale (g) for fish weight Any
Battery powered scale (mg) for organ weights Any
Dissecting forceps Any
Bone cutters Any
Scalpel and blades Any
Disposable gloves Any
Buckets Any
Leak-proof Nalgene bottles (250 mL) ThermoFischer Scientific 02-924-5C
Vacutainer tubes with sodium heparin ThermoFischer Scientific 02-689-6 For blood collection
Disposable  3 mL syringes with 23 G needle ThermoFischer Scientific 14-826-11
1 – 2 mL cryovials Any Used for plasma and RNAlater samples
Invitrogen RNAlater Stabilization solution ThermoFischer Scientific AM7021
Z-Fix Formaldehyde Zinc fixative Anatech LTD SKU-174
Tricaine-S (MS-222) Syndel USA fish anesthetic
Coin Envelopes Any for otoliths
Pencils and pens Any
70% alcohol Any
Data sheets Any

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Blazer, V. S., Walsh, H. L., Braham, R. P., Smith, C. Necropsy-based Wild Fish Health Assessment. J. Vis. Exp. (139), e57946, doi:10.3791/57946 (2018).

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