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Necropsy स्थित वाइल्ड फिश हेल्थ असेसमेंट

Published: September 11, 2018 doi: 10.3791/57946
Automatic Translation
1, 2, 1, 2
1National Fish Health Research Laboratory, Leetown Science Center, U.S. Geological Survey, 2School of Natural Resources, West Virginia University

Summary

जंगली मछलियों के स्वास्थ्य का उपयोग जलीय पारिस्थितिकी तंत्र के स्वास्थ्य के संकेतक के रूप में किया जा सकता है । Necropsy आधारित मछली स्वास्थ्य आकलन दृश्य घावों या असामान्यताओं के प्रलेखन प्रदान करते हैं, के रूप में अच्छी तरह से सूक्ष्म मूल्यांकन के लिए ऊतकों को इकट्ठा करने के लिए अवसर के रूप में उपयोग किया गया डेटा स्थिति सूचकांक की गणना, जीन अभिव्यक्ति और अन्य अधिक गहराई में विश्लेषण.

Abstract

वृद्धि पोषक तत्वों और रासायनिक संदूषण से Anthropogenic प्रभाव, आवास परिवर्तन और जलवायु परिवर्तन के लिए, मछली आबादी पर महत्वपूर्ण प्रभाव हो सकता है । प्रतिकूल प्रभाव निगरानी, जीव से आणविक स्तर तक का उपयोग, मछलियों और अन्य जीवों पर संचयी प्रभाव का आकलन करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है । मछली स्वास्थ्य जलीय पारिस्थितिकी तंत्र स्वास्थ्य का एक संकेतक के रूप में दुनिया भर में इस्तेमाल किया गया है । necropsy आधारित मछली स्वास्थ्य आकलन दिखाई विषमताओं और घावों, परजीवी, हालत और organosomatic सूचकांक पर डेटा प्रदान करता है । ये साइट, मौसम और सेक्स, साथ ही साथ लौकिक, समय के साथ दस्तावेज़ परिवर्तन की तुलना में किया जा सकता है । अधिक मात्रात्मक मूल्यांकन के लिए एक मछली स्वास्थ्य सूचकांक की गणना करने के लिए गंभीरता रेटिंग विभिंन टिप्पणियों को सौंपा जा सकता है । necropsy आधारित आकलन की एक खामी यह है कि यह दृश्य टिप्पणियों और शर्त कारकों पर आधारित है, जो घातक प्रभाव के लिए ऊतक और उपसेलुलर के रूप में संवेदनशील नहीं हैं । इसके अतिरिक्त, यह बहुत कम कारण या जोखिम कारक स्वीकार्य असामान्यताओं के साथ जुड़े की पहचान करने के लिए संभव है । तो, उदाहरण के लिए एक उठाया घाव या पंख, होंठ या शरीर की सतह पर "ट्यूमर" एक ट्यूमर हो सकता है । हालांकि, यह भी एक परजीवी, जीर्ण सूजन या एक अड़चन के जवाब में सामांय कोशिकाओं के हाइपरप्लासिया के लिए एक प्रतिक्रिया हो सकती है । इसके विपरीत, ट्यूमर, कुछ परजीवी, अंय संक्रामक एजेंटों और कई ऊतक परिवर्तन दिखाई नहीं दे रहे है और इसलिए कम करके आंका जा सकता है । हालांकि, necropsy-आधारित आकलन के दौरान रक्त (प्लाज्मा), histopathology के लिए ऊतकों (सूक्ष्म विकृति), जीनोमिक्स और अन्य आणविक विश्लेषण, और otoliths उम्र बढ़ने के लिए एकत्र किया जा सकता है । इन अनुप्रवाह विश्लेषण, geospatial विश्लेषण के साथ एक साथ, आवास आकलन, पानी की गुणवत्ता और contaminant विश्लेषण सभी व्यापक पारिस्थितिकी तंत्र मूल्यांकन में महत्वपूर्ण हो सकता है ।

Introduction

मानव गतिविधियों जलीय वातावरण पर कई प्रतिकूल प्रभाव पड़ता है । मछली विभिंन जल निकायों कि मानव आबादी में recreatees और अक्सर एक पीने के पानी के स्रोत के रूप में उपयोग करता है और इसलिए जलीय पर्यावरण के स्वास्थ्य के महत्वपूर्ण संकेतक है निवास । जंगली मछली है कि रहते है और एक विशेष निवास स्थान में पुन: पेश रोगजनकों, परजीवी, गरीब पानी की गुणवत्ता और रासायनिक दूषित पदार्थों सहित विभिंन तनाव को अपने जीवन भर में उजागर कर रहे हैं । हजारों रसायन औद्योगिक और मानव अपशिष्ट जल, उपनगरीय/शहरी stormwater और कृषि अपवाह के माध्यम से हमारे जलमार्ग में प्रवेश करते हैं । रसायनों के इन जटिल मिश्रण additive, synergistic या विरोधी पर प्रभाव कर सकते है उजागर जीवों1,2,3। इसके अलावा, अंय पर्यावरण तनाव जैसे ऊंचा पोषक तत्वों, ऊंचा तापमान, कम भंग ऑक्सीजन या अस्थिर पीएच रासायनिक दूषित पदार्थों के प्रभाव को बढ़ा सकते हैं4,5. पर्यावरण तनाव भी संक्रामक रोग के परिणामों को प्रभावित कर सकते है सीधे संक्रामक एजेंटों6की संख्या में वृद्धि, अवसरवादी रोगजनकों के डाह बढ़ती7 या प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया और रोग को दबा मेजबान8,9,10का प्रतिरोध । इन कारणों के लिए, जैविक या प्रतिकूल प्रभाव की निगरानी में रुचि बढ़ रही है11,12,13,14, मछली और अन्य जलीय जीवों की पहचान करने के लिए उपयोग आबादी और जोखिम में पारिस्थितिकी प्रणालियों ।

प्रतिकूल प्रभाव निगरानी संगठन के विभिंन स्तरों पर, उपसेलुलर या आणविक करने के लिए, उपघातक प्रभाव है जो आबादी को प्रभावित कर सकते है और विभिंन तनाव के संपर्क का संकेत हो सकता है की पहचान करने के लिए उपयोग करता है । जीव स्तर पर संकेतक दिखाई विषमताओं और शर्तों में शामिल हैं । लंबाई और वजन के आधार पर शर्त सूचकांक अच्छी तरह से किया जा रहा है या मछली आबादी के रखरखाव का मूल्यांकन करने के लिए गणना कर रहे हैं । सबसे आम है Fulton की हालत कारकों (K) = (वजन/ एक अंय संकेतक दिखाई विषमताओं की उपस्थिति है । तरीकों की एक किस्म का मूल्यांकन करने के लिए व्यक्तिगत अध्ययन और निगरानी कार्यक्रमों में इस्तेमाल किया गया है, दस्तावेज़, और दिखाई विषमताओं का मूल्यांकन. केवल बाहरी विषमताओं पर आधारित मूल्यांकन, यानी, रोग, पंख नुकसान, ट्यूमर और कंकाल विसंगतियों के साथ व्यक्तियों के अनुपात, बायोटिक अखंडता (IBI) है कि16सामुदायिक स्वास्थ्य का मूल्यांकन करता है के सूचकांक के लिए मैट्रिक्स में से एक है । एक समान मूल्यांकन DELTs (विकृति, कटाव, घावों, ट्यूमर) भी मछली समुदायों के स्वास्थ्य के मूल्यांकन के लिए इस्तेमाल किया गया है17। हालांकि, इन पद्धतियों केवल बाहरी दृश्य विषमताओं और आंतरिक घावों या जल्दी घातक संकेतकों का आकलन नहीं है ।

Necropsy-आधारित मूल्यांकन बाहरी और आंतरिक प्रेक्षणों में शामिल हैं और अतिरिक्त शर्त सूचकांकों की माप के लिए अनुमति देते हैं । Hepatosomatic सूचकांक (जिगर वजन/कुल शारीरिक वजन) भी फिटनेस या ऊर्जा भंडार15 के एक संकेतक के रूप में इस्तेमाल किया गया है जिसके लिए एक उच्च सूचकांक मूल्य स्वस्थ मछली को इंगित करता है । हालांकि, अध्ययन के एक नंबर से पता चला है कि अतिवृद्धि या जिगर के आकार में वृद्धि जिगर18,19,20द्वारा metabolized विभिन्न दूषित पदार्थों के लिए जोखिम के कारण होता है. इस मामले में एक उच्च सूचकांक कुछ रासायनिक वर्गों के लिए जोखिम का संकेत होगा । gonadosomatic सूचकांक (gonad वजन/कुल शारीरिक वजन) एक और शर्त है प्रजनन स्वास्थ्य21की ओर निर्देशित सूचकांक है । necropsy-आधारित मूल्यांकन के दौरान की गई टिप्पणियों को व्यक्तिगत घावों के प्रकारों या सामान्य व्यक्तियों के प्रतिशत की व्यापकता की तुलना करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है । हालांकि, वे भी एक अधिक मात्रात्मक स्वास्थ्य आकलन22,23में इस्तेमाल किया जा सकता है ।

यहाँ वर्णित मानकीकृत necropsy-आधारित आकलन का उत्तर, विशेषज्ञता और अन्य उपलब्ध संसाधनों के प्रश्न (ओं) के आधार पर कई मायनों में निहायत दिखाई देने वाले आकलन को बढ़ाने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. हमारे नियमित दृष्टिकोण बॉयोमीट्रिक डेटा (लंबाई, वजन, जिगर वजन, gonad वजन), प्लाज्मा/सीरम विश्लेषण, दस्तावेज़ बाहरी और आंतरिक दिखाई विषमता के लिए रक्त एकत्र करने के लिए है, सूक्ष्म विश्लेषण के लिए अंगों के टुकड़ों को संरक्षित और otoliths के लिए इकट्ठा उम्र िरा. necropsy आधारित मूल्यांकन प्लस उम्र विश्लेषण और विभिन्न अंगों की histopathology, लिंग, उम्र, साइट और द्वारा विभिन्न शर्त सूचकांक, दिखाई विषमताओं की व्यापकता, साथ ही सूक्ष्म ऊतक परिवर्तन की गणना और तुलना के लिए अनुमति देता है नमूना अवधि । अतिरिक्त ऊतक संग्रह इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी, वैक्टीरिया, वायरोलॉजी, parasitology और रासायनिक सांद्रता सहित कई अन्य विश्लेषणों के लिए बनाया जा सकता है । इन विधियों का भी हिस्सा हो सकता है में गहराई से विश्लेषण मछली के कारण का निदान करने के लिए इस्तेमाल किया24 या बंदी मछलियों की मौत25। दो अतिरिक्त विश्लेषण के लिए ऊतक के संग्रह के लिए तरीके, जीन अभिव्यक्ति और कार्यात्मक प्रतिरक्षा विश्लेषण सचित्र हैं ।

Protocol

यहां वर्णित विधियों Leetown विज्ञान केंद्र के संस्थागत पशु देखभाल और उपयोग समिति द्वारा अनुमोदित किया गया है ।

1. मछली संग्रह

  1. तनाव की एक न्यूनतम के साथ लाइव मछली ले लीजिए । नाव या बैग electrofishing, हुक और लाइन या जाल का प्रयोग करें ।
  2. रहते कुओं या वातित कंटेनरों में नमूना तक मछली पकड़ो ।
    नोट: अमेरिकी मत्स्य पालन सोसायटी मछली संग्रह के लिए गाइड के एक नंबर प्रकाशित किया है, हैंडलिंग और संज्ञाहरण/ मछली हैंडलिंग जब दस्ताने पहनते हैं ।

2. फिश Necropsy

  1. एक मछली Euthanize ।
    1. संवेदनाहारी में प्लेस मछली जब तक opercular आंदोलन रहता है और मछली संतुलन खो देता है । एक और 2 के बाद-10 मिनट मछली euthanized हो जाएगा; हालांकि, यह भी प्रजातियों के आधार पर भिंन हो सकते हैं ।
      नोट: मछली निश्चेतक के एक नंबर के साथ euthanized जा सकता है (सबसे अधिक इस्तेमाल के लिए सामग्री की तालिका देखें) । इच्छामृत्यु की विधि उस प्रयोगशाला मापन पर निर्भर करेगी जो29एकत्र किए गए ऊतकों पर आयोजित की जाएगी ।
  2. बॉयोमीट्रिक विशेषताओं को मापने ।
    1. मछली को नजदीकी चने का तौल कर करें ।
    2. निकटतम मिलीमीटर के लिए मछली की लंबाई को मापने ।
      1. थूथन की नोक से कुल लंबाई उपाय पूंछ के अंत करने के लिए बंद कर दिया जब एक साथ चुटकी ली ।
      2. थूथन की नोक के लिए पूंछ में कांटा से कांटा लंबाई को मापने, और थूथन की नोक से मानक लंबाई शरीर के अंत तक (पूंछ की शुरुआत).
    3. निम्न सूत्र का उपयोग करके शर्त फ़ैक्टर की गणना करें:
      शर्त फैक्टर = (कुल शरीर वजन-gonad वजन)/total लंबाई3.
      नोट: Gonad वजन कुल शरीर के वजन से घटाया है के बाद से gonads काफी कुल शरीर के वजन के लिए योगदान कर सकते हैं, विशेष रूप से मादा मछली अंडे में ।
  3. एक रक्त का नमूना प्राप्त करें ।
    नोट: रक्त सबसे अधिक caudal नस से लिया जाता है, लेकिन यह भी पृष्ठीय महाधमनी से या कार्डियक पंचर30से वापस लिया जा सकता है ।
    1. एक 1 से 5 मिलीलीटर सिरिंज, मछली के आकार पर निर्भर करता है पर एक 22 या 23 जी सुई के साथ caudal नस से एक परिधीय रक्त का नमूना निकालें । पार्श्व रेखा के नीचे caudal क्षेत्र में सुई पूर्वकाल डालें (आंकड़ा 1a और 1b) । कोण यह ऊपर की ओर जब तक रीढ़ मार और फिर थोड़ा वापस ले लो । नस को ventral है ।
      नोट: यदि रक्त धब्बों बनाया जाएगा या सीरम की आवश्यकता है, कोई थक्कारोधी का उपयोग किया जाता है । ज्यादातर मामलों में, प्लाज्मा और एकत्र किया जाएगा, इसलिए, सोडियम हेपरिन, EDTA या लिथियम जैसे एक थक्कारोधी सुई और सिरिंज कोट करने के लिए प्रयोग किया जाता है और रक्त संग्रह ट्यूब (जैसे, vacutainer) में भी है ।
    2. एक sharps निपटान कंटेनर में सुई और जगह निकालें संग्रह ट्यूब में रक्त डालने से पहले ।
      नोट: रक्त बर्फ पर आयोजित किया जा सकता है लेकिन बाद में विश्लेषण पर निर्भर करता है के रूप में संभव के रूप में जितनी जल्दी हो जाना चाहिए30.
    3. यदि परमाणु विषमता या अंतर रक्त गणना मूल्यांकन किया जाएगा, तुरंत डुप्लिकेट साफ गिलास माइक्रोस्कोप स्लाइड पर खून की एक बूंद जगह है । वापस एक दूसरी स्लाइड में एक ४५ ° कोण ड्रॉप, जो तो केशिका कार्रवाई से सतह भर में तैयार की है । एयर शुष्क31करने के लिए अनुमति दें ।
    4. 1500 से कम रक्त केंद्रापसारक-15 तलछट कोशिकाओं को मिनट के लिए 2500 x जी । एक बाँझ हस्तांतरण प्लास्टिक के साथ प्लाज्मा/सीरम निकालें, क्रायोजेनिक शीशियों में aliquot, और दुकान पर-८० ° c.

Figure 1
चित्रा 1 : एक मछली से एक रक्त का नमूना प्राप्त करना । (क) हाल ही में एक euthanized मछली अपनी ओर रखी है और पार्श्व रेखा स्थित है. (ख) एक सुई पार्श्व लाइन (तीर) ventral डाला जाता है, ऊपर के कोण तक सुई छू रीढ़ की ओर । यह तो थोड़ा वापस ले लिया है, और चूषण रक्त वापस लेने के लिए शुरू की । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

  1. प्रत्येक मछली पर एक necropsy आधारित स्वास्थ्य मूल्यांकन का संचालन ।
    नोट: वर्णन और घावों और विषमताओं का वर्णन प्रकाशनों की संख्या३२,३३,३४,३५उपलब्ध हैं ।
    1. दस्तावेज़ शरीर की सतह और पंख (चित्रा 2), आंखें और गिल (चित्रा3) पर घावों सहित बाहरी असामान्यताओं, जोंक के रूप में बाहरी परजीवी (चित्रा2d), भोजन या trematode metacercarial अल्सर (चित्रा 2d, 3 बी) और गिल परजीवी (चित्रा 3d) । दस्तावेज़ प्रकार, डेटा पत्रक पर स्वीकार्य विषमताओं का स्थान और आकार, साथ ही photographically, यदि संभव हो तो ।
    2. उदर गुहा (फिगर 4a) operculum के लिए गुदा क्षेत्र से काटने और फिर आंतरिक अंगों को बेनकाब करने के लिए मांसपेशियों के प्रालंब को हटाने के द्वारा एक कैंची का उपयोग कर खोलें ।
      नोट: यदि पूर्वकाल गुर्दे प्रतिरक्षा समारोह के लिए एकत्र किया जाएगा (नीचे कदम 5 देखें) या वैक्टीरिया या वायरोलॉजी के लिए एकत्र नमूने, बाहरी शरीर की सतह ७०% शराब से संक्रमित किया जाना चाहिए और उन नमूनों necropsy प्रदर्शन से पहले प्राप्त किया जाना चाहिए । यदि ऊतकों केवल दृश्य टिप्पणियों के लिए इस्तेमाल किया जा रहा है, प्लाज्मा विश्लेषण और histopathology बाँझ तकनीक आवश्यक नहीं है.
    3. दस्तावेज़ आंतरिक विषमता (चित्रा 4) सहित विभिन्न अंगों के सामान्य या फोकल disease (चित्रा 4B-4d), उठाया क्षेत्रों की उपस्थिति (चित्रा 4E), अल्सर, परजीवी, और आकार विषमता ( बढ़े, atrophied).

Figure 2
चित्रा 2 : शरीर की सतह पर मनाया और मछली के पंख दिखाई घावों के उदाहरण । (क) पार्श्व शरीर की सतह पर एक छोटा, थोड़ा घिस हुआ घाव (तीर). (ख) एक बड़ा reddened क्षेत्र (तीर) caudal शरीर की सतह को शामिल । (ग) उठाया, काले घावों (तीर) शरीर की सतह और पंख पर । (घ) लीच (सफेद तीर) और फिन पर छोटे काले धब्बे (काले तीर). स्केल बार = 3 mm. (E) शरीर की सतह पर एक उठाया, multilobed, पीला घाव (तीर) । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 3
चित्रा 3 : गिल और मछली की आंखों के दिखाई घावों के उदाहरण । (एक) एक आंख के लेंस के भीतर एक पीला क्षेत्र (तीर) । स्केल बार = 5 मिमी. (ख) सफेद अल्सर (सफेद तीर) और छोटे काले धब्बे (काले तीर) गिल (ए) को कवर operculum पर trematode परजीवी की वजह से । स्केल बार = 1 cm. (C) गिल (a) पर पीला, घिस हुआ क्षेत्र (तीर) । स्केल बार = 5 मिमी. (घ) गिल रेशा से जुड़ी हुई परजीवी (तीर) दिखा निकाल दिया गया है कि एक गिल । स्केल बार = 2 मिमी. कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 4
चित्रा 4: एक necropsy और मछली की आंतरिक विषमता के उदाहरण । (एक) के दौरान एक necropsy मछली खुला है (सफेद तीर के साथ) और मांसपेशियों की एक प्रालंब (काला तीर) को gonad (एक) और तिल्ली, संदंश और कैंची द्वारा आयोजित किया जा रहा बेनकाब हटा दिया । (ख) विचित्र यकृत (क), testes (ख), आंत वसा वसा से घिरा (ग) और पेट (घ). स्केल बार = 5 मिमी. (c) यकृत (a) गहरा लाल क्षेत्र (तीर), अंडाशय (b) और आंतों (c) के साथ । स्केल बार = 5 मिमी. (घ) हरे रंग का फीका पड़ा हुआ क्षेत्रों (तीर) के साथ जिगर । स्केल बार = 1 cm. (E) एक सामांय का उदाहरण (a) और असामांय (ख) उठाया पिंड के साथ परीक्षण । स्केल बार = 1 सेमी. कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए ।

  1. hepatosomatic अनुक्रमणिका (HSI) प्राप्त करें ।
    1. यकृत धमनी और पूर्वकाल अंत के संयोजी ऊतक विच्छेद द्वारा जिगर को हटा दें । धीरे आसंजन और आंत और वसा वसा के लिए अंय कनेक्शन trimming जबकि बाहर उठा । पित्ताशय की थैली पंचर नहीं करने के लिए ध्यान रखना । जिगर वजन ।
      नोट: ऐसी cyprinids के रूप में कुछ मछली, एक असतत जिगर नहीं है बल्कि यकृत ऊतक आंतों और अंय अंगों के आसपास लिपटे । इन प्रजातियों के लिए, यह यकृत भार प्राप्त करने के लिए संभव नहीं हो सकता है ।
    2. सूत्र का उपयोग करके hepatosomatic अनुक्रमणिका (HSI) परिकलित करें:
      HSI = यकृत भार/कुल शारीरिक वजन
  2. gonadosomatic अनुक्रमणिका की गणना करें ।
    1. gonads को निकालकर उसका वजन करें ।
    2. सूत्र का उपयोग करके gonadosomatic index (जीएसआई) का परिकलन करें:
      जीएसआई = gonad वजन/कुल शारीरिक वजन

3. सूक्ष्म विकृति के लिए ऊतकों को बचाना

नोट: fixatives के एक नंबर सहित 10% तटस्थ बफर formalin और Z-फिक्स, जस्ता के साथ एक formalin आधारित निर्धारण, क्षेत्र में ऊतक के संरक्षण के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है । बाद अगर ऐसी सीटू संकरण या फ्लोरोसेंट एंटीबॉडी धुंधला में इस्तेमाल किया जा सकता है के रूप में पसंद किया जाता है ।

  1. ध्यान से कटौती लेकिन ऊतक के नमूनों को बाहर खींच नहीं है । व्यक्तिगत ऊतक के टुकड़ों को आकार में < 2 cm और उचित निर्धारण के लिए < 5 mm मोटा रखें । अंगूठे का एक नियम के रूप में, उचित संरक्षण के लिए ऊतक से अधिक मात्रा द्वारा लगभग 10x अधिक निर्धारण का उपयोग करें । उपयुक्त आकार के एक ही रिसाव प्रूफ कंटेनर में एक मछली से सभी ऊतक नमूने प्लेस, मछली के आकार के आधार पर नमूना लिया जा रहा है ।
  2. निर्धारण कंटेनर में किसी भी बाहरी विषमता के टुकड़ों को रखें । इसके अलावा, सामांय ऊतक के एक आसंन टुकड़ा शामिल हैं ।
    नोट: संपीड़न या अन्य यांत्रिक क्षति के रूप में अनुचित हैंडलिंग, हवा या सूरज की रोशनी के लिए लंबे समय तक जोखिम, और ठंड कलाकृतियों पैदा कर सकता है.
  3. विभिन्न क्षेत्रों और निर्धारण कंटेनर में जगह से जिगर की 4 मिमी मोटी टुकड़ों में कटौती । सामान्य और असामान्य क्षेत्रों में शामिल हैं, अगर मनाया.
  4. आकार के आधार पर, एक पूरी gonad या एकाधिक टुकड़ों को एक gonad के साथ निर्धारण कंटेनर में रखें ।
  5. या तो पूरे अंगों प्लेस, यदि छोटे, या अंय सभी अंगों के टुकड़े (तिल्ली, पूर्वकाल और पीछे गुर्दे, गिल, दिल, आंत और पेट) निर्धारण कंटेनर में । यदि असामान्य ऊतक मनाया जाता है, सामान्य ऊतक के एक आसंन टुकड़ा के रूप में अच्छी तरह से संरक्षित ।

4. उम्र के विश्लेषण के लिए Otoliths निकालें

नोट: आयु मछली के रोग में एक महत्वपूर्ण चर हो सकता है/ जबकि संरचनाओं की एक संख्या, तराजू और स्पिन सहित, उंर निर्धारण के लिए इस्तेमाल किया गया है, सबसे संरचनाओं की तुलना अध्ययन otoliths सबसे अच्छा परिणाम३६,३७देने के लिए मिल गया है । Teleost मछलियों में otoliths-lapillus, sagitta और asteriscus के तीन जोड़े हैं. आम तौर पर, sagittal या lapillus otoliths कि प्रजातियों के द्वारा भिंन हो सकते है हालांकि उंर बढ़ने के लिए एकत्र कर रहे हैं । हटाने और बुढ़ापे की तकनीक पहले३८वर्णित किया गया है ।

  1. गिल स्थलडमरूमध्य के माध्यम से कट, और सिर वापस मोड़ । दूर संयोजी और मांसपेशियों ऊतक neurocranium के अवर भागों के आसपास पट्टी prootic bullae, एक उठाया बोनी क्षेत्र का पता लगाने के लिए ।
  2. स्कोर या हड्डी कटर के साथ कटौती और otoliths बेनकाब करने के लिए दरार । इन्हें नंगी आंखों से देखा जा सकता है ।
  3. एक लेबल की शीशी या एक सिक्का लिफाफा में otoliths प्लेस और कमरे के तापमान पर स्टोर के छल्ले या३८वेतन वृद्धि गिनती से उंर के लिए विश्लेषण तक । यदि एक शीशी में रखने, खुली टोपी एक बार प्रयोगशाला में लौटे और अच्छी तरह से सूखी भंडारण से पहले की अनुमति ।

Figure 5
चित्रा 5 : otoliths का निष्कासन । (क) स्थलडमरूमध्य कट और संयोजी ऊतक और मांसपेशी दूर खींचा रीढ़ और neurospinal क्षेत्र के आधार को बेनकाब । (ख) otoliths को बेनकाब करने के लिए अस्थियों को फटा जाता है. (ग) Lapillar otoliths हैं । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

5. प्रतिरक्षा समारोह परख के लिए ऊतक प्राप्त

नोट: पूर्वकाल गुर्दे प्रमुख टेम अंग है, लिम्फोसाइटों और कार्यात्मक परख के लिए मैक्रोफेज के स्रोत है, और हटा दिया जाना चाहिए aseptically अगर कोशिकाओं कार्यात्मक परख के लिए, जैसे mitogenesis, phagocytic और की हत्या की क्षमता के लिए प्रसंस्कृत किया जाएगा मैक्रोफेज३९,४०.

  1. ७०% इथेनॉल के साथ मछली की बाहरी सतह स्प्रे । का प्रयोग करें बाँझ कैंची, एक स्केलपेल और संदंश उदर गुहा खोलने के लिए और पूर्वकाल गुर्दे के ऊतकों, जो एक गहरे लाल अंग है दूर करने के लिए पूर्वकाल स्थित है तैरना मूत्राशय ।
  2. मीडिया में पूर्वकाल गुर्दे का नमूना प्लेस (उदाहरण के लिए, Leibovitz एल-15) कोशिकाओं को जीवित रखने के लिए । एक बाँझ हाथ से आयोजित ऊतक चक्की (जैसे, Tenbroeck ऊतक चक्की) के साथ Homogenize गुर्दे के नमूनों में एक सेल सस्पेंशन. गीला बर्फ पर पकड़ जब तक प्रयोगशाला में लौटे ।

6. न्यूक्लिक अम्ल विश्लेषण के लिए ऊतक की रक्षा

नोट: यदि बहाव आणविक विश्लेषण इस तरह के जीन की प्रतिलिपि का उपयोग कर अभिव्यक्ति के रूप में आयोजित किया जाएगा बहुतायत४१ या मात्रात्मक पीसीआर४२ (पोलीमरेज़ श्रृंखला प्रतिक्रिया), ऊतक के टुकड़े जगह के लिए एक उपयुक्त परिरक्षक में मूल्यांकन किया जाएगा ( जैसे, RNAlater स्थिरीकरण समाधान) जितनी जल्दी हो सके ।

  1. शाही सेना के संरक्षण के लिए, दो से तीन छोटे (2-3 मिमी) टुकड़े ऊतक के लिए परिरक्षक मात्रा के एक 10:1 अनुपात में उपयुक्त संरक्षक में जगह है ।
    नोट: नमूनों को धूप या अत्यधिक गर्मी से ढाल कर और गीली बर्फ पर पहुँचाया जाना चाहिए.
  2. डीएनए संरक्षण के लिए, ऊतक के दो से तीन छोटे टुकड़े को ९५% इथेनॉल (मात्रा से ऊतक को 10:1 इथेनॉल) में जगह है । फिर गीले बर्फ पर नमूने पकड़ और फिर-20 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर.

Representative Results

चिंता के महान झीलों क्षेत्रों (एओसी) भौगोलिक क्षेत्रों है कि विभिंन लाभकारी उपयोग की हानि के कारण नामित किया गया है । कई एओसी में लाभकारी उपयोग विकलांगता (बुइस) में से एक मछली ट्यूमर या अन्य विकृति है. लाखों डॉलर remediation और इन क्षेत्रों में से प्रत्येक की बहाली के लिए खर्च किया गया है ताकि विभिंन बुइस और अंततः एओसी४३सूची में । मछली ट्यूमर बुि सूची के लिए मानदंड राज्य से राज्य के लिए अलग है (epa.ohio.gov/portals/35/lakeerie/ohio_AOC_delisting_guidance.pdf और dnr.wi.gov/topic/GreatLakes/documents/SheboyganRiverFinalReport2008.pdf देखें); हालांकि, के रूप में सूचीबद्ध दस्तावेजों में उल्लेख किया है, जिगर ट्यूमर की व्यापकता और कुछ मामलों में त्वचा ट्यूमर का निर्धारण करने के लिए एक आवश्यकता है । कई मामलों में, व्यापकता एक गैर एओसी संदर्भ साइट की तुलना में है ।

मछली ट्यूमर बुि तीन AOCs पर मूल्यांकन किया गया था (सेंट लुइस नदी, मिलवॉकी नदी और Sheboygan नदी) और एक गैर एओसी संदर्भ स्थल (झीलों सुपीरियर और मिशिगन पर Kewaunee नदी), सफेद चूसने वाला एक necropsy आधारित मूल्यांकन का उपयोग (Catostomus commersonii ), त्वचा और जिगर ऊतक के सूक्ष्म विकृति के बाद । मछली २०१२ और २०१३४४ में मिलवॉकी, Sheboygan और Kewaunee नदियों और २०१५ (अप्रकाशित डेटा) में सेंट लुइस नदी से एकत्र किए गए । २०० सफेद suckers मिलवॉकी से मूल्यांकन किया गया, Kewaunee और सेंट लुइस, और १९३ से Sheboygan.

परिभाषा के अनुसार, एक ट्यूमर किसी भी सूजन या उठाया क्षेत्र हो सकता है, हालांकि यह आम तौर पर माना जाता है कि एक असामान्य कोशिकाओं के साथ ऊतक के असामान्य वृद्धि की वजह से सूजन या तो एक सौम्य या घातक ट्यूमर है । सफेद चूसने वाला सभी साइटों से एकत्र छोटे, असतत सफेद धब्बे, बड़े सफेद क्षेत्रों, थोड़ा उठाया mucoid घावों और multilobed शरीर की सतह और होंठ (चित्रा 6) पर उठाया क्षेत्रों सहित बाहरी घावों की एक किस्म का प्रदर्शन किया । मछली तौला और एक शर्त कारक प्राप्त करने के लिए मापा गया, बाह्य और आंतरिक विषमताओं प्रलेखित थे, और त्वचा और जिगर के ऊतकों histopathology के लिए एकत्र किया गया था.

Figure 6
चित्रा 6 : उठाया त्वचा के घावों महान झीलों से सफेद चूसने वाला पर मनाया । (क) शरीर की सतह पर एक असतत सफेद स्थान । स्केल बार = 5 मिमी. (ख) पीछे शरीर की सतह पर एक थोड़ा उठाया mucoid (तीर) और multilobed घावों (एक) । स्केल बार = 1 cm. (C) शरीर की सतह पर एक बड़ा, multilobed घाव । स्केल बार = 1 cm. (D) होठों पर कई बहु-पालिया घाव । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

बाहरी ट्यूमर के साथ मछली का प्रतिशत या फीका पड़ा है १५.५% से सेंट लुइस एओसी में ५८.०% से लेकर मिलवॉकी एओसी पर । multilobed होंठ और शरीर की सतह घावों सबसे आम थे, जबकि सामांय में, असतत सफेद धब्बे कम आम दृश्य घाव थे । चौकस जिगर पिंड के साथ मछली की संख्या कम था, Kewaunee और सेंट लुइस में १.५% से मिलवॉकी में २.५% (तालिका 1) से लेकर ।

नदियों और साल का नमूना
दृश्यमान घावों Kewaunee २०१३ सेंट लुइस २०१५ Sheboygan २०१२ मिलवॉकी २०१३
असतत सफेद धब्बे 16 3 ३.१ 5
Mucoid 20 ९.५ ९.८ ३०.५
Multilobed २२.५ 3 २९.५ ४०
कुल उठाया त्वचा विषमताएक ४६ १५.५ ३८.३ ५८
दृश्यमान जिगर पिंड १.५ १.५ १.६ २.५
ए उठाया घावों के साथ मछली की कुल संख्या । कुछ मछली विषमताओं के कई प्रकार था ।

तालिका 1: Necropsy-आधारित टिप्पणियों की सफेद suckers चिंता और एक संदर्भ स्थल (Kewaunee नदी), एक प्रतिशत के रूप में प्रस्तुत की महान झीलों क्षेत्रों में एकत्र की ।
दृश्य परीक्षा विभिंन विषमताओं के साथ मछली का प्रतिशत दस्तावेज़ के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है । हालांकि, निश्चित उपस्थिति और neoplasia के प्रकार का निदान करने के लिए, ऊतकों microscopically (histopathology) की जांच की जानी चाहिए । सूक्ष्म परीक्षा पर, यह पाया गया कि नहीं उठाया घावों के सभी नवोत्पादित थे । असतत सफेद धब्बे और mucoid घावों, विशेष रूप से Kewaunee में से कई, neoplasia (तालिका 2) के बजाय hyperplastic घावों थे । इसके अतिरिक्त, Kewaunee और सेंट लुइस में, त्वचा ट्यूमर मनाया के सभी सौंय papillomas थे । Sheboygan और मिलवॉकी दोनों papillomas और स्क्वैमस सेल कार्सिनोमा, घातक त्वचा ट्यूमर, (तालिका 2) मनाया गया ।

नदियों का नमूना
ट्यूमर प्रकार Kewaunee २०१३ सेंट लुइस २०१५ Sheboygan २०१२ मिलवॉकी २०१३
Papilloma 21 ५.२ ३०.५ ३७.५
स्क्वैमस सेल कार्सिनोमा 0 0 २.१ १०.५
कुल त्वचा ट्यूमर 21 ५.२ ३२.६ ४८
पित्त वाहिनी ट्यूमरएक २.५ 4 ६.२ ९.५
यकृत कोशिका ट्यूमरबी 1 0 २.१ 8
कुल लिवर ट्यूमर ३.५ 4 ८.३ १५.०ग
ए cholangioma और cholangiocarcinoma शामिल है
ब यकृत कोशिका ग्रंथ्यर्बुद और यकृत सेल कार्सिनोमा शामिल
सी कुछ मछली दोनों पित्त वाहिनी और यकृत ट्यूमर था

तालिका 2: Microscopically की सत्यापित नवोत्पादित घावों की चिंता और एक संदर्भ स्थल (Kewaunee नदी), एक प्रतिशत के रूप में प्रस्तुत की महान झीलों क्षेत्रों में एकत्र सफेद चूसने वाला ।
histopathological विश्लेषण भी जिगर ट्यूमर है कि दृश्य अवलोकन द्वारा पहचान नहीं थे की पहचान की । जबकि Kewaunee और सेंट लुइस से एकत्र मछली का केवल १.५% दिखाई जिगर पिंड (तालिका 1) था, ३.५% और ४.०%, क्रमशः, microscopically की पहचान की थी ट्यूमर (तालिका 2) । एक बड़ा अंतर Sheboygan पर देखा गया था (१.६% दिखाई बनाम ८.३% सूक्ष्म) और मिलवॉकी (२.५% दिखाई बनाम १५.०% माइक्रोस्कोपिक) । सूक्ष्म परीक्षा भी पित्त नलिका बनाम यकृत कोशिका मूल (तालिका 2) और सौम्य बनाम घातक ट्यूमर के ट्यूमर के एक भेदभाव प्रदान करता है ।

Discussion

necropsy-मछली के स्वास्थ्य के आकलन के आधार पर किसी भी मछली प्रजातियों के लिए जो जांचकर्ता दोनों बाहरी और आंतरिक संरचनाओं के सामांय उपस्थिति की समझ है पर उपयोग किया जा सकता है । एक मानकीकृत दृष्टिकोण का उपयोग साइटों और प्रजातियों के साथ ही मौसमी और एक जनसंख्या में लौकिक परिवर्तन के बीच तुलना के लिए अनुमति देता है । निष्कर्षों और संदूषण के बिंदु और सूत्रीय स्रोतों के साथ जुड़े प्रभाव की पहचान करने के लिए और प्रबंधन कार्यों को सूचित करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है । यह भी प्रबंधन कार्रवाई शुरू कर रहे है एक बार सुधार ट्रैक करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है । पद्धति को कई तरह से दृश्य बाह्य विषमताओं के प्रलेखन बढ़ाने के लिए संशोधित किया जा सकता है. मूल्यांकन, केवल दृश्य टिप्पणियों पर आधारित, गैर घातक हो सकता है, अपेक्षाकृत सस्ती और डेटा जल्दी से व्यक्तियों की एक बड़ी संख्या के लिए उत्पंन किया जा सकता है । नतीजतन, वे खोजपूर्ण या प्रारंभिक आकलन के लिए उपयोगी हो सकता है, समय पर परिवर्तन की निगरानी या अंय संकेतकों के साथ संयोजन में । यदि लंबाई और मछली की वजन दृश्य टिप्पणियों के दौरान मापा जाता है, शर्त कारक भी गणना की जा सकती है । हालांकि आकलन केवल दृश्य अवलोकन पर आधारित कारण या जुड़े जोखिम कारकों पर जानकारी प्रदान नहीं करते हैं, कुछ त्वचा विषमताओं के दीर्घकालिक रुझान४५ और बॉयोमीट्रिक मापदंडों४६ कुछ क्षेत्रों में सुधार का संकेत दिया है पानी की गुणवत्ता में सुधार के साथ जुड़े ।

necropsy-आधारित आकलन आंतरिक अंगों की भी जांच की जाती है और hepatosomatic इंडेक्स और gonadosomatic इंडेक्स जैसे अन्य शर्त कारकों की गणना की जा सकती है के रूप में अधिक जानकारी प्रदान करता है । Goede और बार्टन22 एक क्षेत्र necropsy विधि है कि रक्त मापदंडों, बॉयोमीट्रिक कारकों, विषमताओं का प्रतिशत शामिल है, और विशिष्ट विषमताओं के लिए सूचकांक मूल्यों का विकास किया । विधि का शोधन कुछ चर के लिए एक गंभीरता दर्ज़ा कि एक स्वास्थ्य आकलन सूचकांक है कि सांख्यिकीय23की तुलना में किया जा सकता है की गणना के लिए अनुमति शामिल थे । यह स्वास्थ्य आकलन सूचकांक क्षेत्रीय साइट तुलना में23,४७,४८ और अमेरिका भूवैज्ञानिक में प्लाज्मा और histopathological विश्लेषण सहित अन्य जैविक संकेतकों के साथ संयोजन में इस्तेमाल किया गया है सर्वेक्षण के पर्यावरण की स्थिति और प्रवृत्तियों बड़ी नदियों में contaminant जोखिम के संभावित प्रभावों का मूल्यांकन कार्यक्रम के लिए राष्ट्रव्यापी४९,५०,५१का निरीक्षण । बाहरी रूप से दिखाई बीमारियों और परजीवी, दिखाई जिगर ट्यूमर और अंय histopathologically पता चला जिगर घावों पर आधारित एक मछली रोग सूचकांक विकसित किया गया है और बड़े पैमाने पर उत्तर सागर, बाल्टिक सागर, और आइसलैंड से में इस्तेमाल किया । इस सूचकांक के लिए एक पारिस्थितिकी तंत्र स्वास्थ्य संकेतक५२के रूप में एक महत्वपूर्ण उपकरण पाया गया था ।

वहां मछली पर necropsy आधारित मूल्यांकन आयोजित करने में कुछ महत्वपूर्ण कारक हैं । सबसे पहले, मूल्यांकन मछली पर तुरंत मौत के बाद आयोजित किया जाना चाहिए । अंग रंग और स्थिरता में परिवर्तन काफी तेजी से मौत के बाद हो सकता है । इसके अतिरिक्त, कुछ परजीवी मौत के बाद जल्द ही मेजबान छोड़ सकते हैं । दूसरा, यह जानना महत्वपूर्ण है कि ब्याज की प्रजातियों के लिए क्या सामांय है । उदाहरण के लिए, कुछ मछली सामांय फैटी और फलस्वरूप है, पीला जिगर, जबकि ज्यादातर प्रजातियों के लिए एक पीला जिगर असामांय होगा । स्वाभाविक रूप से होने वाले मौसमी परिवर्तनों को पहचानना भी महत्वपूर्ण है । कुछ मछली रंग परिवर्तन होगा या प्रजनन के मौसम के दौरान tubercles ब्रीडिंग विकसित करना ।

necropsy-आधारित मूल्यांकन की सीमाएं मछली स्वास्थ्य आकलन के लिए एक विधि के रूप में शामिल 1 करने के लिए अक्षमता) लगातार विशिष्ट घावों के "कारण" की पहचान और 2) प्रभाव है कि नग्न आंखों को दिखाई नहीं हो सकता है की पहचान । इन कमियों रोगजनकों और परजीवी की histopathology, आणविक या सांस्कृतिक पहचान के अलावा के साथ दूर किया जा सकता है, और जीन अभिव्यक्ति । उदाहरण के लिए, एक "ट्यूमर" या उठाया घाव (सूजन) वास्तविक neoplasia हो सकता है या यह एक परजीवी हो सकता है, सूजन, शोफ या हाइपरप्लासिया (सामान्य कोशिकाओं की संख्या में वृद्धि), रासायनिक जोखिम, संक्रामक एजेंटों या अन्य अड़चन की वजह से. प्रतिनिधि परिणामों में दिखाया गया है, निश्चित ट्यूमर या neoplasia निदान के लिए घाव प्रकार और गंभीरता (यानी, सौम्य या घातक) की पहचान करने के लिए सूक्ष्म विकृति की आवश्यकता है । दृश्य अवलोकन द्वारा सफेद चूसने वाला बाहरी "ट्यूमर" का आकलन विशेष रूप से संदर्भ स्थल पर व्यापकता, अनुमान लगाया । उठाए गए घावों में से कई ट्यूमर नहीं बल्कि hyperplastic घावों थे । फिलहाल यह ज्ञात नहीं है कि ये hyperplastic घाव प्री-नवोत्पादित हैं या नहीं. इसके विपरीत, जिगर में उठाया पिंड के अवलोकन काफी जिगर ट्यूमर की व्यापकता को कम करके आंका । इसलिए, सूक्ष्म विकृति के लिए ऊतक के संग्रह पर्याप्त रूप से सूचीबद्ध करने के लिए क्षमता का पता करने के लिए आवश्यक था ।

Disclosures

लेखकों का खुलासा करने के लिए कुछ नहीं है ।

Acknowledgments

यह काम अमेरिकी भूवैज्ञानिक सर्वेक्षण के पारिस्थितिकी प्रणालियों (Chesapeake खाड़ी वातावरण और मत्स्य पालन) और पर्यावरण स्वास्थ्य (संदूषण जीव विज्ञान) कार्यक्रमों और पश्चिम वर्जीनिया प्राकृतिक संसाधनों के विभाग द्वारा वित्त पोषित किया गया । व्यापार के नाम का उपयोग पहचान प्रयोजनों के लिए ही है और अमेरिकी सरकार द्वारा समर्थन मतलब नहीं है ।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Folding tables Any
Folding chairs Any
Dissecting boards Any
Measuring board (mm) Any
Battery powered scale (g) for fish weight Any
Battery powered scale (mg) for organ weights Any
Dissecting forceps Any
Bone cutters Any
Scalpel and blades Any
Disposable gloves Any
Buckets Any
Leak-proof Nalgene bottles (250 mL) ThermoFischer Scientific 02-924-5C
Vacutainer tubes with sodium heparin ThermoFischer Scientific 02-689-6 For blood collection
Disposable  3 mL syringes with 23 G needle ThermoFischer Scientific 14-826-11
1 – 2 mL cryovials Any Used for plasma and RNAlater samples
Invitrogen RNAlater Stabilization solution ThermoFischer Scientific AM7021
Z-Fix Formaldehyde Zinc fixative Anatech LTD SKU-174
Tricaine-S (MS-222) Syndel USA fish anesthetic
Coin Envelopes Any for otoliths
Pencils and pens Any
70% alcohol Any
Data sheets Any

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Blazer, V. S., Walsh, H. L., Braham, R. P., Smith, C. Necropsy-based Wild Fish Health Assessment. J. Vis. Exp. (139), e57946, doi:10.3791/57946 (2018).

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