Summary
Helsen til vill fisk kan brukes som en indikator på akvatisk økosystem helse. Obduksjon-baserte fisk helse vurderinger gi dokumentasjon av synlig lesjoner eller unormalt, brukes til å beregne tilstand indekser samt muligheten til å samle vev for mikroskopiske evaluering, genuttrykk og andre mer detaljert analyser.
Abstract
Menneskeskapte påvirkninger fra økt næringsstoffer og kjemisk forurensning, habitat endringer og klimaendringer, kan ha viktige effekter på fiskebestander. Bivirkninger overvåking, kan utnytte biomarkers fra den organismebiologi til molekylært nivå, brukes til å vurdere den kumulative effekten på fisk og andre organismer. Fiskehelse er blitt anvendt worldwide som indikator for akvatisk økosystem helse. Obduksjon-baserte fisk helse vurderingen gir data om synlig unormalt og lesjoner, parasitter, tilstand og organosomatic indekser. Dette kan sammenlignes ved nettstedet, sesongen og sex, samt timelig, dokumentet endres over tid. Alvorlighetsgrader kan tilordnes til ulike observasjoner til å beregne en fisk helse indeks for mer kvantitativ vurdering. En ulempe ved obduksjon-basert vurdering er at den er basert på visuelle observasjoner og tilstand faktorer, som ikke er så sensitivt som vev og subcellular biomarkers for sublethal effekter. I tillegg er det sjelden mulig å identifisere årsaker eller risikofaktorer forbundet med observerte avvik. Så, for eksempel en hevet lesjonen eller "tumor" på finnene, lepper eller kroppsdeler kan være en neoplasm. Men kan det også være et svar på en parasitt, kronisk betennelse eller hyperplasi på normale celler som svar på en irriterende. Derimot neoplasms, visse parasitter, and smittsomme stoffer og mange vev endringer vises ikke og så kan undervurderes. Men under obduksjon-basert vurdering, blod (plasma), vev for histopatologi (mikroskopisk patologi), kan genomics og andre molekylære analyser, og otoliths for aldring samles. Disse nedstrøms analyser, sammen med geografiske analyser, habitat vurderinger, vann kvalitet og miljøgifter analyser kan alle være viktig i omfattende økosystem evalueringer.
Introduction
Menneskelige aktiviteter har mange bivirkninger på akvatiske miljøer. Fisk bor ulike vann organer som befolkningen gjenskaper i og ofte bruker som drikkevann, og dermed er viktige indikatorer for helse vannmiljøet. Vill fisk som lever og reprodusere spesielle livsmiljøet utsatt hele livet på ulike stressorer inkludert patogener, parasitter, dårlig vannkvalitet og kjemisk forurensning. Tusenvis av kjemikalier angi våre vassdrag gjennom industri og menneskelig avløpsvann, suburban/urban stormwater og landbruket avrenning. Disse komplekse blandinger av kjemikalier kan ha additiv, synergistic eller antagonistiske effekter på utsatt organismer1,2,3. I tillegg andre miljømessige stressfaktorer som forhøyet næringsstoffer, høy temperatur, oppløst oksygen eller varierende pH kan forverre virkningene av kjemisk forurens-Ning4,5. Miljømessige stressfaktorer kan også påvirke infeksjonssykdommer resultater direkte ved å øke antall smittestoffer6, øke virulens opportunistiske patogener7 eller undertrykke immunrespons og sykdom motstand av verten8,9,10. For disse grunner, er det økende interesse i biologiske eller negative effekter overvåking11,12,13,14, fisk og andre vannlevende organismer å identifisere befolkning og økosystem risiko.
Bivirkninger overvåking benytter biomarkers på ulike nivåer i organisasjonen, fra organismebiologi til subcellular eller molekylær, identifisere sublethal effekter som kan påvirke bestander og være indikativ av eksponering for ulike stressfaktorer. Indikatorer på organismen nivå inkluderer synlig unormalt og betingelser. Tilstand indekser basert på lengde og vekt beregnes for å evaluere velvære eller egnethet av fiskebestander. Den vanligste er Fultons tilstand faktorer (K) = (vekt/lengde3) 15. En annen indikator er synlig unormalt. En rekke metoder har blitt brukt individuelle studier og overvåkingsprogrammer til å vurdere, dokument og evaluere synlig unormalt. Vurdering basert på eksterne unormalt, dvs. andelen personer med sykdom, finneskader, svulster og skjelettlidelser anomali, er en av beregningene for indeksen biotiske integritet (IBI) som evaluerer samfunnet helse16. En lignende vurdering kalt DELTs (misdannelser, erosjoner, lesjoner, svulster) har også blitt brukt til å evaluere helsen til fisk samfunn17. Men vurdere metodene bare eksterne visuelle unormalt og ikke interne lesjonene eller tidlig sublethal indikatorer.
Obduksjon-baserte vurderinger inkluderer ekstern og intern observasjoner og tillate måling av tilleggsbetingelse indekser. Hepatosomatic indeks (lever vekt/total kroppsvekt) har også blitt brukt som en indikator på fitness eller energi reserver15 som høyere indeksverdien angir sunnere fisk. Men har en rekke studier vist at hypertrofi eller en økning i leveren størrelse skyldes eksponering for ulike forurensninger metaboliseres i leveren18,19,20. I dette tilfellet ville en høyere indeks være indikativ av eksponering for visse kjemiske. Gonadosomatic indeksen (gonad vekt/total kroppsvekt) er en annen tilstand indeks rettet mot reproduktiv helse21. Observasjoner gjort under obduksjon-baserte vurderingen kan brukes til å sammenligne utbredelsen av personlige lesjon typer eller prosentandel av normale individer. Men kan de også brukes i en mer kvantitativ helse vurdering22,23.
Standardisert obduksjon-baserte vurderingen beskrevet her kan brukes til å utvide grovt synlig vurdering på flere måter avhengig av på spørsmålene besvares, kompetanse og andre ressurser. Vår rutine tilnærming er å samle biometriske data (lengde, vekt, levervekt, gonad vekt), blod plasma/serum analyser, dokumentet eksterne og interne synlig unormalt, bevare biter av organer for mikroskopiske analyser og samle otoliths for alder analyser. Obduksjon-basert vurdering pluss alder analyse og histopatologi av ulike organer, kan den og sammenligning av ulike tilstand indeksene, utbredelsen av synlig unormalt, i tillegg til mikroskopiske vev endringer av kjønn, alder, område og samplingsperiode. Flere vev samlinger kan gjøres for mange andre analyser inkludert elektronmikroskop, bakteriell, virologi, parasittologi og kjemiske konsentrasjoner. Disse metodene kan også være en del av mer dyptgående analyser brukes til å diagnostisere årsaken til fisk dreper24 eller dødelighet av fange fisker25. Metoder for innsamling av vev for to ekstra analyser, genuttrykk og funksjonelle immun analyser er illustrert.
Protocol
Metodene som er beskrevet her er godkjent av Leetown Science Center institusjonelle Animal Care og bruk komiteen.
1. fisk samling
- Samle levende fisk med et minimum av stress. Bruke båt eller ryggsekk electrofishing, krok og linje eller garn.
- Hold fisk i live brønner eller karbonisert beholdere til prøvetaking.
Merk: American fiskeri Society har publisert en rekke guider for fisk innsamling, behandling og anestesi/euthanasia26,27,28. Bruk hansker når du håndterer fisk.
2. fisk obduksjon
-
Euthanize en fisk.
- Sett fisken i anesthetic til opercular bevegelse opphører og fisken mister likevekt. Etter en 2-10 minutter blir fisken euthanized; Dette kan imidlertid også variere av arter.
Merk: Fisk kan være euthanized med en rekke anestesi (se Tabell for materiale for mest brukte). Metoden for euthanasia avhengig av laboratoriet målene som vil bli gjennomført på vev samlet29.
- Sett fisken i anesthetic til opercular bevegelse opphører og fisken mister likevekt. Etter en 2-10 minutter blir fisken euthanized; Dette kan imidlertid også variere av arter.
-
Måle biometriske egenskaper.
- Veie fisken i nærmeste gram.
- Måle fisk lengden til den nærmeste millimeter.
- Mål den totale lengden fra spissen av snuten med munnen lukket til slutten av halen når klemt sammen.
- Måle gaffel lengden fra gaffelen i halen til spissen av snuten og standard lengde fra spissen av snuten til slutten av kroppen (begynnelsen av halen).
- Beregne tilstand faktoren ved hjelp av følgende formel:
Tilstand faktor = (totalt kroppsvekt - gonad vekt) / totalt lengden3.
Merk: Gonad vekt er trukket fra den totale kroppsvekten siden gonader kan bidra vesentlig til den totale kroppsvekten, særlig i prespawn hunnfisk.
-
Få en blodprøve.
Merk: Blod er oftest Hentet fra caudal venen men kan også bli trukket fra dorsalis eller av cardiac punktering30.- Pakk ut en perifert blodprøve fra caudal venen med en 22 eller 23 G nål på 1 til 5 mL sprøyter, avhengig av størrelsen på fisken. Sett inn nålen anterior caudal området under sidelinjen (figur 1A og 1B). Vinkel den oppover til treffer ryggraden og deretter trekke litt. Venen er ventrale til overliggende ryggraden.
Merk: Hvis blod flekker gjøres eller serum kreves, brukes ingen antikoagulerende. I de fleste tilfeller plasma samles og derfor en antikoagulerende som natrium heparin, EDTA eller litium brukes til coat sprøytespiss- og sprøytebytteprogrammer og er også i blod samling tube (f.eks, vacutainer). - Fjerne nålen og plasser i en disposisjon beholder før putting blod inn i samling røret.
Merk: Blod kan holdes på is, men avhengig av påfølgende analyser bør være sentrifugeres snarest mulig30. - Hvis kjernefysiske unormalt eller differensiell blod teller evalueres, umiddelbart sette en dråpe blod på like ren glass objektglass. Tilbake enda ett lysbilde i 45° vinkel i det miste, som er deretter trukket over overflaten av kapillær handling. La air-dry31.
- Sentrifuge blod på 1500-2500 x g i 15 min til sediment cellene. Fjerne plasma/serum med et sterilt overføring Pipetter, aliquot i Kryogenisk ampuller, og lagre på-80 ° C.
- Pakk ut en perifert blodprøve fra caudal venen med en 22 eller 23 G nål på 1 til 5 mL sprøyter, avhengig av størrelsen på fisken. Sett inn nålen anterior caudal området under sidelinjen (figur 1A og 1B). Vinkel den oppover til treffer ryggraden og deretter trekke litt. Venen er ventrale til overliggende ryggraden.
Figur 1 : Få en blodprøve fra en fisk. (A) A nylig euthanized fisk er lagt på sin side og sidelinjen ligger. (B) en nål er innsatte ventrale til lateral linje (pil) peker oppover til p berører ryggraden. Det trekkes deretter litt, og sug startet for å trekke blod. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
-
Utføre en obduksjon-baserte helsevurdering på hver fisk.
Merk: En rekke publikasjoner illustrerer og beskriver lesjoner og unormalt er tilgjengelige32,33,34,35.- Dokumentere eksterne unormalt inkludert lesjoner på kroppsdeler og finnene (figur 2), øyne og gjellene (Figur 3), ekstern parasitter som lut (figur 2D), grubs eller trematode metacercarial cyster (figur 2D, 3B) og gill parasitter (figur 3D). Dokumentere type, plassering og størrelse på observerte avvik på datablader, så vel som photographically, hvis mulig.
- Åpne bukhulen (figur 4A) med en saks ved å kutte fra anal området til bløtdyr og deretter fjerne klaffen av muskel for å avsløre de indre organene.
Merk: Hvis fremre nyre samles for immun funksjon (se trinn 5 nedenfor) eller prøver innsamlet for bakteriell eller virologi, eksternt organ overflaten bør desinfiseres med 70% alkohol og eksemplene skal hentes før obduksjon utført. Hvis vev brukes bare for visuelle observasjoner, plasma analyser og histopatologi steril er teknikk ikke nødvendig. - Dokumentet interne unormalt (Figur 4) inkludert generelle eller fokal misfarging av ulike organer (figur 4B-4D), tilstedeværelse av reist områder (figur 4E), cyster, parasitter, og størrelse unormalt ( forstørret, atrophied).
Figur 2 : Eksempler på synlig lesjoner observert på kroppsdeler og svømmeføtter fisk. (A) A liten, litt erodert lesjon (pil) på den laterale kroppsdeler. (B) en stor rød område (pil) involverer caudal kroppen overflaten. (C) hevet, svart lesjoner (piler) på kroppsdeler og finnene. (D) lut (hvit pil) og små svarte flekker (svart piler) på fin. Skala bar = 3 mm. (E) en hevet, borgtårn, blek lesjon (pil) på kroppen overflaten. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 3 : Eksempler på synlig lesjoner av gjellene og øynene til fisk. (A) A blek område (pil) i linsen av øye. Skala bar = 5 mm. (B) hvit cyster (hvite piler) og små svarte flekker (svart piler) skyldes trematode parasitter på bløtdyr dekker gjellene (a). Skala bar = 1 cm. (C) A blek, svekket-området (pil) på gill (a). Skala bar = 5 mm. (D) en gill som er fjernet viser parasitter (piler) knyttet til gill filamenter. Skala bar = 2 mm. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 4: Eksempler på en obduksjon og interne unormalt fisk. (A) under en obduksjon fisk er kuttet åpne (langs den hvite pil) og en klaff muskler (svart pil) fjernet for å utsette gonad (a) og milten, holdt av tang og saks. (B) marmorert leveren (a), testiklene (b), tarmen omgitt av adipose fett (c) og magen (d). Skala bar = 5 mm. (C) lever (a) med en mørk rød område (pil), eggstokk (b) og tarmen (c). Skala bar = 5 mm. (D) lever med grønnaktig misfargede områder (piler). Skala bar = 1 cm. (E) eksempel på en normal (a) og unormale (b) testiklene med hevet knuter. Skala bar = 1 cm. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
-
Få hepatosomatic indeks (HSI).
- Fjerne leveren ved severing hepatic arterien og bindevevet i den fremre delen. Løft ut mens trimming adhesjon og andre tilkoblinger til tarmen og adipose fett. Pass på å ikke punktere gallbladder. Veie leveren.
Merk: Noen fisk, for eksempel Karpefisker, har ikke en diskret leveren men heller hepatic vev pakket rundt tarmen og andre organer. Etter disse artene, kan det ikke være mulig å få leveren vekter. - Beregne hepatosomatic indeksen (HSI) bruke formelen:
HSI = leveren vekt/total kroppsvekt
- Fjerne leveren ved severing hepatic arterien og bindevevet i den fremre delen. Løft ut mens trimming adhesjon og andre tilkoblinger til tarmen og adipose fett. Pass på å ikke punktere gallbladder. Veie leveren.
-
Beregne gonadosomatic indeksen.
- Fjern gonader og veie den.
- Beregne gonadosomatic indeksen (GSI) bruke formelen:
GSI = gonad vekt/total kroppsvekt
3. bevare vev for mikroskopiske patologi
Merk: En rekke fiksativene inkludert 10% nøytral bufrede formalin og Z-fix, et formalin-baserte bindemiddel med sink, kan brukes for bevaring av vev i feltet. Sistnevnte er foretrukket hvis metoder som i situ hybridisering eller fluorescerende antistoff flekker kan brukes.
- Nøye klippe, men ikke trekk ut vevsprøver. Hold personlige vev stykker < 2 cm i størrelse og < 5 mm tykk for riktig fiksering. Som en tommelfingerregel, bruker du ca 10 x mer bindemiddel av volum enn vev for forsvarlig bevaring. Sett alle vevsprøver fra en fisk i samme lekkasjefri container riktig papirstørrelse, avhengig av fisk blir samplet.
- Sett biter av noe eksterne unormalt i beholderen etappe, den stabiliserende. Inkluder også et tilstøtende stykke normalt vev.
Merk: Feilaktig håndtering som komprimering eller andre mekaniske lang eksponering til luft eller sollys, og frysing kan forårsake gjenstander. - Klippe minst fem 3-4 mm tykk stykker av leveren fra ulike regioner og plasser i beholderen etappe, den stabiliserende. Ta normale og unormale områder, hvis observert.
- Avhengig av størrelse, kan du plassere en hel gonad eller flere stykker på en gonad i beholderen etappe, den stabiliserende.
- Plass enten hele organer, om små eller biter av alle andre organer (milt, fremre og bakre nyre, gjellene, hjertet, intestine og mage) i beholderen etappe, den stabiliserende. Hvis unormale vevet er observert, beholde en tilstøtende stykke normalt vev også.
4. Fjern Otoliths for alder analyser
Merk: Alder kan være en viktig variabel i fisk sykdom/fisk helsefag. Mens en rekke konstruksjoner, herunder skalaer og spines, har blitt brukt for alder besluttsomhet, har de fleste studier som sammenligner strukturer funnet otoliths å gi de beste resultater36,37. Beinfisker har tre par otoliths - laplillus, sagitta og asteriscus. Generelt, sagittal eller laplillus otoliths er samlet for aldring selv om som kan variere fra arter. Fjerning og aldring teknikker har vært beskrevet tidligere38.
- Skjære gjennom landbroen gill, og bøye hodet tilbake. Stripe bort connective og muskel vev rundt den underlegne delen av neurocranium å finne prootic bullae, et hevet benete område.
- Score eller klippe med bein kniver og sprekk for å utsette otoliths. De kan ses med det blotte øye.
- Plasser otoliths på merket ampuller eller en mynt konvolutt og butikken ved romtemperatur før analysert for alder ved å telle det ringer eller intervaller38. Hvis plassere i ampuller, åpne cap en gang tilbake til laboratoriet og la grundig tørr før lagring.
Figur 5 : Fjerning av otoliths. (A) landbroen er kuttet og bindevev og muskler trakk unna å avsløre bunnen av ryggraden og neurospinal området. (B) benet er sprukket for å avsløre otoliths. (C) Lapillar otoliths fjernes. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
5. få vev for immunforsvar analyser
Merk: Fremre nyre er store blodkreft orgel, kilden til lymfocytter og makrofager for funksjonell analyser, og må fjernes tas aseptisk hvis cellene vil bli kultivert for funksjonell analyser, som mitogenesis, phagocytic og drepe evnen til makrofager39,40.
- Spray det ytre overflaten av fisken med 70% etanol. Bruk sterilt saks, skalpell og tang åpne bukhulen og fjerne den fremre nyre vev, som er en mørk rød organ ligger anterior svømmeblæren.
- Plass fremre nyre prøven i media (f.eks Leibovitz's L-15) å holde cellene i live. Homogenize nyre prøver med et sterilt håndholdt vev jeksel (f.eks Tenbroeck vev jeksel) i én celle suspensjoner. Hold på våt is til tilbake til laboratoriet.
6. Behold vev for nukleinsyre analyser
Merk: Hvis nedstrøms molekylær analysen vil bli gjennomført, som genuttrykk transkripsjon overflod41 eller kvantitativ PCR42 (polymerasekjedereaksjons), plassere biter av vev skal vurderes i en passende konserveringsmiddel ( f.eks, RNAlater stabilisering løsning) så snart som mulig.
- For RNA bevaring, plassere to til tre små (2-3 mm) stykker i det aktuelle Konserveringsmiddelet i 10:1 forholdet konserveringsmiddel volumet til vev.
Merk: Prøver bør være skjermet fra sollys eller sterk varme og transportert på våt is. - For DNA bevaring, plasserer du to til tre små biter av vev til 95% etanol (10:1 etanol til vev av volumet). Hold prøvene på våt is og deretter lagre på-20 ° C.
Representative Results
Great Lakes områder av bekymring (AOC) er geografiske områder som ble utpekt skyldes nedsatt ulike fordelaktig bruker. En av gunstig bruk nedskrivningen (BUIs) på mange SUT er fisk tumorer eller andre misdannelser. Millioner av dollar har blitt brukt for opprydding og restaurering av hvert av disse områdene for å delist ulike BUIs og til slutt SUT43. Kriteriene for delisting fisk svulsten BUI varierer fra stat til stat (se epa.ohio.gov/portals/35/lakeerie/ohio_AOC_delisting_guidance.pdf og dnr.wi.gov/topic/GreatLakes/documents/SheboyganRiverFinalReport2008.pdf); som nevnt i delisting dokumentene, er det imidlertid et krav å fastslå utbredelsen av leverskader svulster og i noen tilfeller hudkreft. I mange tilfeller sammenlignet utbredelsen med en ikke-AOC referanse nettsted.
Fisk svulsten BUI ble evaluert på tre AOCs (St. Louis elven, Milwaukee elven og Sheboygan elven) og en ikke-AOC referanse nettsted (Kewaunee elv) på innsjøer Superior og Michigan, utnytte en obduksjon-basert vurdering av hvite sucker (Catostomus commersonii ), etterfulgt av mikroskopiske patologi av hud og leveren vev. Fisk ble samlet fra elvene Milwaukee, Sheboygan og Kewaunee i 2012 og 201344 og elven St. Louis i 2015 (upubliserte data). To hundre hvit suckers var vurdert fra Milwaukee, Kewaunee og St. Louis og 193 fra Sheboygan.
Per definisjon kan en svulst noen hevelse eller hevet området, selv om det er generelt betraktet som hevelse skyldes en unormal vekst av vev med unormale celler som enten en godartet eller ondartet neoplasm. Hvit sucker fra alle områder viste en rekke eksterne hevet lesjoner inkludert små, diskrete hvite flekker, større hvite områder, litt hevet mucoid lesjoner og borgtårn oppvokst områdene på kroppsdeler og lepper (figur 6). Fisk ble veid og målt for å få en tilstand faktor, eksterne og interne unormalt var dokumentert og hud og leveren vev ble samlet inn for histopatologi.
Figur 6 : Hevet hudlesjoner observert på hvit sucker fra Great Lakes. (A) en diskresjonen hvit flekk på kroppen overflaten. Skala bar = 5 mm. (B) en litt hevet mucoid (piler) og borgtårn lesjoner (a) på bakre kropp overflaten. Skala bar = 1 cm. (C) A store, borgtårn lesjon på kroppen overflaten. Skala bar = 1 cm. (D) mange flere lobed lesjoner på leppene. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Prosent av fisk med eksterne svulster eller hevet misfargede områder varierte fra 15.5% ved St. Louis AOC 58.0% med Milwaukee SUT. Generelt, var de diskrete hvite flekkene minst vanlige visuelle lesjonen mens borgtårn leppe og kroppen overflaten lesjonene var vanligste. Antall fisk med observerbare leveren knuter var lav, varierer fra 1,5% på Kewaunee og St. Louis til 2,5% i Milwaukee (tabell 1).
| Elver og år samplet | ||||
| Synlig lesjoner | Kewaunee 2013 | St. Louis 2015 | Sheboygan 2012 | Milwaukee 2013 |
| Diskret hvite flekker | 16 | 3 | 3.1 | 5 |
| Mucoid | 20 | 9.5 | 9.8 | 30,5 |
| Borgtårn | 22,5 | 3 | 29,5 | 40 |
| Totalt hevet huden unormalten | 46 | 15.5 | 38,3 | 58 |
| Synlig leveren knuter | 1.5 | 1.5 | 1.6 | 2.5 |
| en Totalt antall fisk med hevet lesjoner. Noen fisk hadde flere typer avvik. | ||||
Tabell 1: Obduksjon-baserte observasjoner av hvite Sucker samlet på Great Lakes områder av interesse og en referanse nettsted (Kewaunee elv), fremvist i prosent.
Visuell undersøkelse kan brukes til å dokumentere prosent av fisk med ulike anatomiske avvik. Men du definitivt diagnostisere tilstedeværelse og type neoplasi, vev må undersøkes mikroskopisk (histopatologi). Ved mikroskopisk undersøkelse, ble det funnet at ikke alle av hevet lesjonene var neoplastic. Mange av de diskrete hvit flekkene og mucoid lesjoner, spesielt på Kewaunee, var hyperplastic lesjoner i stedet for neoplasi (tabell 2). I tillegg Kewaunee og St. Louis var alle hudkreft observert godartet papillomas. Sheboygan og Milwaukee ble både papillomas og squamous celle kreftsvulster, Ondartet hudkreft, observert (tabell 2).
| Elver samplet | ||||
| Neoplasm Type | Kewaunee 2013 | St. Louis 2015 | Sheboygan 2012 | Milwaukee 2013 |
| Papilloma | 21 | 5.2 | 30,5 | 37,5 |
| Squamous celle carcinoma | 0 | 0 | 2.1 | 10.5 |
| Total huden neoplasms | 21 | 5.2 | 32.6 | 48 |
| Galle duct neoplasmsen | 2.5 | 4 | 6.2 | 9.5 |
| Hepatic celle neoplasmsb | 1 | 0 | 2.1 | 8 |
| Totalt leveren neoplasms | 3.5 | 4 | 8.3 | 15,0c |
| en Inkluderer cholangioma og cholangiocarcinoma | ||||
| b Inkluderer hepatic celle adenom og hepatic celle carcinoma | ||||
| c Noen fisk hadde både galle duct og hepatic neoplasms | ||||
Tabell 2: Bekreftet mikroskopisk Neoplastic lesjoner av hvite Sucker samlet på Great Lakes områder av interesse og en referanse nettsted (Kewaunee elv), fremvist i prosent.
Histopathological analysen også identifisert leverskader svulster som ikke ble identifisert av visuell observasjon. Mens bare 1,5% av fisken fra Kewaunee og St. Louis hadde synlig leveren knuter (tabell 1), 3,5% og 4,0%, henholdsvis hadde mikroskopisk identifisert neoplasms (tabell 2). En større forskjell ble sett på Sheboygan (1,6% synlig mot 8.3% mikroskopiske) og Milwaukee (2,5% synlig mot 15,0% mikroskopiske). Mikroskopisk undersøkelse gir også en differensiering av neoplasms av galle duct versus hepatic celle opprinnelse (tabell 2) og godartet versus ondsinnethet svulst.
Discussion
Obduksjon-basert vurdering av fiskehelse kan benyttes på alle fiskearter som etterforskeren har en forståelse av normal utseende både eksterne og interne strukturer. Med en standardisert tilnærming tillater sammenligninger mellom nettsteder og arter samt sesongmessige og tidsmessige endringer i en populasjon. Resultatene kan brukes å identifisere effekter knyttet punkt og nonpoint kilder til forurensning og ledelse handlinger. Det kan også brukes til å spore forbedringer når ledelsen tiltak er igangsatt. Metodikken kan endres for å utfylle dokumentasjon av visuelle eksterne unormalt i en rekke måter. Vurderinger, basert på visuelle observasjoner, kan være ikke-dødelige, relativt billig og data kan genereres raskt for et stort antall individer. Derfor de kan være nyttig for utforskende eller første vurderinger, overvåke endringer over tid eller i kombinasjon med andre indikatorer. Hvis lengde og vekt av fisk er målt under visuelle observasjoner, beregnes også tilstand faktoren. Selv om vurderinger basert på visuell observasjon gi ikke informasjon om årsak eller tilknyttede risikofaktorer, langsiktige trender av visse huden unormalt45 og biometrisk parametere46 har vist bedring noe arealer knyttet til vann kvalitetsforbedringer.
Obduksjon-basert vurdering inneholder mer informasjon som indre organer også undersøkt og andre tilstanden faktorer som hepatosomatic indeks og gonadosomatic indeks kan beregnes. Goede og Barton22 utviklet en obduksjon metoden som inkludert blood parametere, biometrisk faktorer, prosentandelen av unormalt og indeksverdier for bestemte unormalt. En avgrensning av metoden inkludert alvorlighetsgraden for noen variabler som tillatt for beregning av en helse vurdering indeks som kunne forhold statistisk23. Denne helse vurdering indeksen har blitt brukt i regionale området sammenligninger23,47,48 og i kombinasjon med andre biologiske indikatorer inkludert plasma og histopathological analyser i de amerikanske geologiske Undersøkelsen Biomonitoring av miljømessige Status og trender programmet vurdere potensielle virkninger miljøgifter eksponering i store elver landsomfattende49,50,51. En fisken sykdommen indeks basert på eksternt synlige sykdommer og parasitter, synlig leveren neoplasms og andre oppdaget histopathologically leveren lesjoner og er mye brukt i Nordsjøen, Østersjøen, og Island. Denne indeksen ble funnet for å være et viktig verktøy som et økosystem helse indikator52.
Det er noen viktige faktorer i gjennomføre vurderingen obduksjon-basert på fisk. Først må vurderinger være gjennomført på fisk umiddelbart etter døden. Endringer i orgel farge og konsekvens kan skje ganske raskt etter døden. I tillegg kan noen parasitter la verten kort tid etter. Det andre, er det viktig å vite hva som er normalt for arten av interesse. For eksempel noen fisk har normalt fet og følgelig blek lever, mens de fleste arter en blek lever ville være unormal. Det er også viktig å erkjenne sesongmessige endringer som naturlig oppstår. Noen fisk vil ha fargeendringer eller utvikle oppdrett tubercles under finne.
Begrensningene for obduksjon-basert vurdering som en metode for fisk helsevurdering inkluderer manglende evne å identifisere 1) konsekvent "årsaken" av bestemte lesjoner og 2) identifisere effekter som ikke kanskje er synlig for det blotte øye. Disse ulempene kan overvinnes med tillegg av histopatologi, molekylær eller kulturelle identifikasjon av patogener og parasitter, og genuttrykk. For eksempel, en "svulst" eller hevet lesjon (hevelse) kan være faktiske neoplasi eller det kan være en parasitt, betennelse, ødem eller hyperplasia (økning i antall normale celler), forårsaket av kjemisk eksponering, smittestoffer eller annet irritants. Som vist i representant resultatene, krever definitiv svulst eller neoplasi diagnose mikroskopiske patologi å identifisere lesjon typen og alvorlighetsgraden (dvs. godartet eller ondartet). Vurdering av eksterne hvit sucker "svulster" av visuell observasjon overvurdert utbredelsen, særlig på nettstedet. Mange av hevet lesjonene var ikke neoplasms men heller hyperplastic lesjoner. Det er for øyeblikket ikke kjent om disse hyperplastic lesjoner er pre neoplastic. Derimot undervurdert observasjon av hevet knuter i leveren betydelig utbredelsen av leveren neoplasms. Derfor var samling av vev for mikroskopiske patologi nødvendig for å tilstrekkelig adresse potensialet for delisting.
Disclosures
Forfatterne ikke avsløre.
Acknowledgments
Dette arbeidet ble finansiert av US Geological Surveys økosystemer (Chesapeake Bay miljøer og fiskeri) og miljørettet helsevern (forurensninger biologi) programmer og West Virginia Department of Natural Resources. Bruk av Varenavn er brukes kun til identifikasjon og innebærer ikke godkjenning av den amerikanske regjeringen.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Folding tables | Any | ||
| Folding chairs | Any | ||
| Dissecting boards | Any | ||
| Measuring board (mm) | Any | ||
| Battery powered scale (g) for fish weight | Any | ||
| Battery powered scale (mg) for organ weights | Any | ||
| Dissecting forceps | Any | ||
| Bone cutters | Any | ||
| Scalpel and blades | Any | ||
| Disposable gloves | Any | ||
| Buckets | Any | ||
| Leak-proof Nalgene bottles (250 mL) | ThermoFischer Scientific | 02-924-5C | |
| Vacutainer tubes with sodium heparin | ThermoFischer Scientific | 02-689-6 | For blood collection |
| Disposable 3 mL syringes with 23 G needle | ThermoFischer Scientific | 14-826-11 | |
| 1 – 2 mL cryovials | Any | Used for plasma and RNAlater samples | |
| Invitrogen RNAlater Stabilization solution | ThermoFischer Scientific | AM7021 | |
| Z-Fix Formaldehyde Zinc fixative | Anatech LTD | SKU-174 | |
| Tricaine-S (MS-222) | Syndel USA | fish anesthetic | |
| Coin Envelopes | Any | for otoliths | |
| Pencils and pens | Any | ||
| 70% alcohol | Any | ||
| Data sheets | Any |
References
- Celander, M. C. Cocktail effects on biomarker responses in fish. Aquatic Toxicology. (105 Supplement), 72-77 (2011).
- Liney, K. E., et al. Health effects in fish of long-term exposure to effluents from wastewater treatment works. Environmental Health Perspectives. 114, 81-89 (2006).
- Silva, E., Rajapakse, N., Kortenkamp, A. Something from "nothing" - eight weak estrogenic chemicals combined at concentrations below NOECs produce significant mixture effects. Environmental Science & Technology. 36, 1751-1756 (2002).
- Noyes, P. D., et al. The toxicology of climate change: environmental contaminants ina warming world. Environment International. 35, 971-986 (2009).
- Witeska, M., Jezierska, B. The effect of environmental factors on metal toxicity to fish. Fresenius Environmental Bulletin. 12, 824-829 (2003).
- Wedekind, C., Gessner, M. O., Vazquez, F., Maerki, M., Steiner, D. Elevated resource availability sufficient to turn opportunistic into virulent fish pathogens. Ecology. 91, 1251-1256 (2010).
- Penttinen, R., Kinnula, H., Lipponen, A., Bamford, J. K. H., Sundberg, L. R. High nutrient concentration can induce virulence factor expression and cause higher virulence in an environmentally transmitted pathogen. Microbial Ecology. 72, 955-964 (2016).
- Bols, N. C., Brubacher, J. L., Ganassin, R. C., Lee, L. E. J. Ecotoxicology and innate immunity in fish. Developmental & Comparative Immunology. 25, 853-873 (2001).
- Dunier, M., Siwicki, A. K. Effect of pesticides and other organic pollutants in the aquatic environment on immunity of fish: a review. Fish and Shellfish Immunology. 3, 423-438 (1993).
- Milla, S., Depiereux, S., Kestemont, P. The effects of estrogenic and androgenic endocrine disruptors on the immune system of fish: a review. Ecotoxicology. 20, 305-319 (2011).
- Connon, R. E., Geist, J., Werner, I. Effect-based tools for monitoring and predicting the ecotoxicological effects of chemicals in the aquatic environment. Sensors. 12, 12741-12771 (2012).
- Eckman, D. R., et al. Biological effects-based tools for monitoring impacted surface waters in the Great Lakes: A multiagency program in support of the Great Lakes restoration initiative. Environmental Practice. 15, 409-426 (2013).
- Khan, M. Z., Law, F. C. P. Adverse effects of pesticides and related chemicals on enzyme and hormone systems of fish, amphibians and reptiles: A review. Proceedings of the Pakistan Academy of Sciences. 42, 315-323 (2005).
- Wernersson, A. S., et al. The European technical report on aquatic effect-based monitoring tools under the water framework directive. Environmental Sciences Europe. 27, (2015).
- Bolger, T., Connolly, P. L. The selection of suitable indices for the measurement and analysis of fish condition. Journal of Fish Biology. 34, 171-182 (1989).
- Karr, J. R. Biological integrity: A long-neglected aspect of water resource management. Ecological Applications. 1, 66-84 (1991).
- Sanders, R. E., Miltner, R. J., Yoder, C. O., Rankin, E. T. The use of external deformities, erosions, lesions, and tumors (DELT anomalies) in fish assemblages for characterizing aquatic resources: a case study of seven Ohio stream. Assessing the sustainability and biological integrity of water resources using fish communities. Simon, I. nT. P. , CRC Press. Florida. 225-246 (1999).
- Bervoets, L., et al. Bioaccumulation of micropollutants and biomarker responses in caged carp (Cyprinus carpio). Ecotoxicology and Environmental Safety. 72, 720-728 (2009).
- Schulte-Hermann, R. Adaptive liver growth induced by xenobiotic compounds: its nature and mechanism. Archives of Toxicology. Supplement. 2, 113-124 (1979).
- Slooff, W., van Kreijl, C. F., Baars, A. J. Relative liver weights and xenobiotic-metabolizing enzymes of fish from polluted surface waters in the Netherlands. Aquatic Toxicology. 4, 1-14 (1983).
- Brewer, S. K., Rabeni, C. F., Papoulias, D. M. Comparing histology and gonadosomatic index for determining spawning condition of small-bodied riverine fishes. Ecology of Freshwater Fish. 17, 54-58 (2003).
- Goede, R. W., Barton, B. A. Organismic indices and an autopsy-based assessment as health and condition of fish. American Fisheries Society Symposium. 8, 93-108 (1990).
- Adams, S. M., Brown, A. M., Goede, R. W. A quantitative health assessment index for rapid evaluation of fish condition in the field. Transactions of the American Fisheries Society. 122, 63-73 (1993).
- Kane, A. S., et al. Field sampling and necropsy examination of fish. Virginia journal of science. 50, 345-363 (1999).
- Yanong, R. P. E. Necropsy techniques for fish. Seminars in Avian and Exotic Pet Medicine. 12, 89-105 (2003).
- American Fisheries Society (AFS) Use of Fishes in Research Committee, American Institute of Fishery Research Biologists and the Society of Ichthyologists and Herpetologists. Guidelines for the Use of Fishes in Research. , American Fisheries Society. Bethesda, Maryland. (2004).
- Bonar, S. A., Hubert, W. A., Willis, D. W. Standard methods for sampling North American freshwater fishes. , American Fisheries Society. Bethesda, Maryland. (2009).
- Zale, A. V., Parrish, D. L., Sutton, T. M. Fisheries Techniques, third edition. , American Fisheries Society. Bethesda, Maryland. 1009 (2013).
- Neiffer, D. L., Stamper, M. A. Fish sedation, anesthesia, analgesia, and euthanasia: considerations, methods, and types of drugs. Institute for Laboratory Animal Research. , 343-360 (2009).
- Clark, T. D., et al. The efficacy of field techniques for obtaining and storing blood samples from fishes. Journal of Fish Biology. 795, 1322-1333 (2011).
- Adewoyin, A. S., Nwogoh, B. Peripheral blood film - a review. Annals of Ibadan Postgraduate Medicine. 12, 71-79 (2014).
- Smith, S. B., et al. Illustrated field guide for assessing external and internal anomalies in fish. Information and Technology Report USGS/BRD/ITR. 2002-007, 46 (2002).
- Kane, A. S. Descriptive guide to observing fish lesions. , Available at http://aquaticpath.phhp.ufl.edu/Lesionguide/Lesionguide.pdf (2005).
- Rafferty, S. D., Grazio, J. Field manual for assessing internal and external anomalies in brown bullhead (Ameiurus nebulosus). , Pennsylvania Sea Grant. Erie, PA. Available at: https://seagrant.psu.edu/sites/default/files/Bullhead%20field%20manual.pdf (2018).
- European Association of Fish Pathologists. Necropsy manual. , Available at www.necropsymanual.net (2018).
- Buckmeier, D. L., Irwin, E. R., Betsill, R. K., Prentice, J. A. Validity of otoliths and pectoral spines for estimating ages of channel catfish. North American Journal of Fisheries Management. 22, 934-942 (2002).
- Maceina, M. J., Sammons, S. M. An evaluation of different structures to age freshwater fish from a northeastern US river. Fisheries Management and Ecology. 13, 237-242 (2006).
- Secor, D. H., Dean, J. M., Laban, E. H. Otolith removal and preparation for microstructural examination. Otolith Microstructure Examination and Analysis. Stevenson, D. K., Campana, S. E. 117, Canadian Special Publication of Fisheries and Aquatic Sciences. 19-57 (1992).
- Gauthier, D. T., Cartwrwight, D. D., Densmore, C. L., Blazer, V. S., Ottinger, C. A. Measurement of in vitro leucocyte mitogenesis in fish: ELISA based detection of the thymidine analogue 5'-bromo-2'-deoxyuridine. Fish and Shellfish Immunology. 14, 279-288 (2003).
- Zelikoff, J. T., et al. Biomarkers of immunotoxicity in fish:from the lab to the ocean. Toxicology Letters. , 325-331 (2000).
- Hahn, C. M., Iwanowicz, L. R., Corman, R. S., Mazik, P. M., Blazer, V. S. Transcriptome discovery in non-model wild fish species for the development of quantitiative transcript abundance assays. Comparative Biochemistry and Physiology - Part D: Genomics and Proteomics. 20, 27-40 (2016).
- Harms, C. A., et al. Quantitative polymerase chain reaction for transforming growth factor-B applied to a field study of fish health in Chesapeake Bay tributaries. Environmental Health Perspectives. 108, 1-6 (2000).
- Braden, J. B., et al. Economic benefits of remediating the Sheboygan River, Wisconsin Area of Concern. Journal of Great Lakes Research. 34, 649-660 (2008).
- Blazer, V. S., et al. Tumours in white suckers from Lake Michigan tributaries: pathology and prevalence. Journal of Fish Diseases. 40, 377-393 (2017).
- Vethaak, A. D., Jol, J. G., Pieters, J. P. F. Long-term trends in the prevalence of cancer and other major diseases among flatfish in the southeastern North Sea as indicators of changing ecosystem health. Environmental Science & Technology. 43, 2151-2158 (2009).
- Teubner, D., Paulus, M., Veith, M., Klein, R. Biometric parameters of the bream (Abramis brama) as indicators for long-term changes in fish health and environmental quality - data from the German ESB. Environmental Science and Pollution Research. 22, 1620-1627 (2015).
- Schleiger, S. L. Fish health assessment index study of four reservoirs in north-central Georgia. North American Journal of Fisheries Management. 24, 1173-1180 (2004).
- Sutton, R. J., Caldwell, C. A., Blazer, V. S. Health assessment of a tailwater trout fishery associated with a reduced winter flow. North American Journal of Fisheries Management. 20, 267-275 (2000).
- Blazer, V. S. The necropsy-based fish health assessment. Biomonitoring of environmental status and trends (BEST) program: selected methods for monitoring chemical contaminants and their effects in aquatic ecosystems. Schmitt, C. J., Dethloff, G. M. , U.S. Geological Survey Information and Technology Report USGS/BRD-2000-005 18-21 (2000).
- Schmitt, C. J. Biomonitoring of environmental status and trends (BEST) program: Environmental contaminants and their effects on fish in the Mississippi River basin. Biological Science Report USGS/BRD/BSR. 2002-0004, 241 (2002).
- Hinck, J. E., et al. Chemical contaminants, health indicators, and reproductive biomarker responses in fish from rivers in the Southeastern United States. Science of the Total Environment. 390, 538-557 (2008).
- Lang, T., et al. Diseases of dab (Limanda limanda): Analysis and assessment of data on externally visible diseases, macroscopic liver neoplasms and liver histopathology in the North Sea, Baltic Sea and off Iceland. Marine Environmental Research. 124, 61-69 (2017).
