Summary
For effektiv kontroll av mygg borne virus smitte, er kunnskap om vektor potensialet i respektive mygg av spesiell interesse. Vi beskriver tvunget spyttsekresjon som metode for å analysere vektor kompetanse Aedes albopictus og tre forskjellige Culex taxa for overføring av Zika virus.
Abstract
Vector kompetanse er definert som potensialet i en mygg Art å overføre mygg-borne virus (mobovirus) til en virveldyr vert. Levedyktig viruspartikler overføres under en blod måltid via spytt av en infisert mygg. Tvunget spyttsekresjon analyser tillater fastsetting vektor potensial på grunnlag av enkelt mygg, unngå bruk av dyreforsøk. Metoden er egnet til å analysere mange mygg i ett eksperiment innen en kort tidsperiode. Tvunget spyttsekresjon analyser ble brukt til å analysere 856 personlige mygg fanget i Tyskland, inkludert to ulike Culex pipiens pipiens biotypes, Culex torrentium samt Aedes albopictus, som var eksperimentelt infisert med Zika virus (ZIKV) og inkubert 18 ° C eller 27 ° C i to og tre uker. Resultatene indikerte mangel på vektor kompetansen til de forskjellige Culex taxa for ZIKV. Kontrast ble Aedes albopictus utsatt for ZIKV, men bare ved 27 ° C, med overføringshastigheter som ligner en Aedes aegypti laboratorium koloni testet parallelt.
Introduction
I 2015, Zika virus (ZIKV), en mygg-borne virus (mobovirus) tilhører familien Flaviviridae, dukket opp i Columbia og Brasil og spres raskt over Amerika og Karibien, forårsaker en epidemi med kjente antall forbundet kliniske tilfeller av microcephaly og Guillain-Barrés syndrom1. Mygg av arten Aedes aegypti og Aedes albopictus regnes primære og sekundære vektorer av ZIKV2, men andre arter av slekten Aedes har også vist seg for å ha eksperimentelle vektor kompetanse3 . I motsetning til Aedes arter kan de fleste Culex arter testet så langt ikke overføre virus4. Bare, gitt data for Culex quinquefasciatus svar3. Foreløpig informasjon mangler på mygg vektor kompetanse for ZIKV under moderate temperaturer (< 20 ° C). Denne informasjonen er imidlertid betydelig for risikovurderinger av mulig sprer regioner med temperert klima som Sentral-Europa.
En kompetent vektor ZIKV er kjøpedyktig skaffe, vedlikeholde, forsterke og til slutt overføre viruset. Derfor er testing mygg organer eller deler av organer, inkludert beina, midttarmen, hodet eller spyttkjertler, for ZIKV ikke tilstrekkelig til å fastslå vektor kompetanse. Det er obligatorisk å teste infeksiøse viruspartikler innen utgitt spytt. For å vurdere vektor kompetanse, både infeksjon rate (IR, antall ZIKV-positive mygg organer per antall engorged mygg) og overføringshastighet (TR, antall mygg med ZIKV-positive spytt per antall ZIKV-positive mygg organer), må bestemt. IRs med mygg lett kan analyseres av bare homogenisere mygg etterfulgt av en revers transkriptase sanntids polymerasekjedereaksjons (RT-qPCR) rettet mot ZIKV. Videre kan smitte være ytterligere preget av bestemme viral kopi tallene per mygg. Derimot er analyse av overføringshastigheten avhengig av gjenkjenning av levedyktig viruspartikler i spytt av personlige mygg. Dette kan oppnås ved fôring av infiserte mygg på utsatt vert dyr, etterfulgt av analyse av viremia i vert5. Men denne metoden avhengig passende modell organismer, og og begrenset av dyr-velferd regler. Unngå bruk av forsøksdyr for å analysere overføringshastigheter og redusere kostnadene, kunstig fôring re systemer bruker blod dråper er beskrevet6. Imidlertid er testing i individuelle skala kombinert med et høyt antall personer vanskelig og tidkrevende. Den første beskrivelsen av en spyttsekresjon analysen på individuelle skala ble utgitt i 19667 og de siste årene, tvunget spyttsekresjon eksperimenter har blitt metoden for valg å evaluere vektor kompetanse mygg3,8 .
Basert på våre vektor kompetanse studie av sentraleuropeiske mygg publisert sist9, beskriver vi tvunget spyttsekresjon som rapportert av Anderson et al. 8 med noen modifikasjoner. Denne metoden tillater høy gjennomstrømning standardisert eksperimenter under høy biosikkerhet nivå forhold (BSL-3) og omfatter identifikasjon av aktiv virus ved celle kultur basert analyser. Eksperimenter beskrevet her inkluderer 856 mygg. De var infisert med ZIKV av kunstig blod måltid og deretter analysert for tilstedeværelsen av infeksiøse viruspartikler i spytt. Myggen introdusert i eksperimenter består to veletablert laboratorium befolkningen i Ae. aegypti og Culex pipiens pipiens biotype molestus (p. molestus Cx.), i tillegg til feltet fanget Culex Pipiens pipiens biotype pipiens (Cx. p. pipiens), Culex torrentium (Cx. torrentium) og to Ae. albopictus bestander. Med unntak av en av de to Ae. albopictus populasjonene, som var samlet i Italia, ble alle mygg samlet i Tyskland.
Protocol
1. klargjør kvinnelige mygg
- Samle mygg fra en stor bur ved hjelp av en aspirator (ca 400 mygg per stor bur).
- Bedøve myggen med karbondioksid (CO2) for 7 s.
- Sortere 20 kvinner per plast medisinglass (Ø 50 mm × 100 mm).
Merk: Hvis myggen våkner, bruke en annen 3 s CO2. - Sulte myggen over natten.
2. kunstig blod måltid
Merk: Alle trinnene utføres under BSL-3 forhold.
-
Forberede det smittsomme blod måltidet.
- Fortynne virus sluttvederlag til konsentrasjonen av 1 x 108 plakk danner enheter (PFU) / mL.
Merk: Lager konsentrasjonen ble bestemt ved å utføre vev kultur infeksjon dose 50 metoden (TCID50) og beregnet av Spearman & Kärber algoritmen10,11. - Mix utløpt menneskeblod (blod bevaring) fra blod bank (ikke egnet for menneskelig lenger, men nyttig for mygg) med fruktose (8% løsning), filtrert bovin serum (FBS) og fungerende løsning på virus lager (utløpt menneskelig blod: fruktose: FBS: fungerende løsning = 5:3:1:1).
Merk: Vi valgte menneskelig blod, fordi dette er kjente naturlige pattedyr vert for ZIKV.
- Fortynne virus sluttvederlag til konsentrasjonen av 1 x 108 plakk danner enheter (PFU) / mL.
- Fryse 140 µL av blod måltid for videre analyse via TCID50.
-
Utføre kunstig fôring ved hjelp av ulike fôring metoder, avhengig av arten:
- Aedes aegypti: Bruk en membran fôring system i 30 min (1 mL per mater).
- Culex spp.: gi smittsomme blodet via en bomull pinne over natten og ikke varm opp blod (300 µL per medisinglass).
-
Aedes albopictus: to dråper (50 µL hver) av blod måltid blandingen inn plast ampullen og la myggen mate for 2T. Ikke varm opp blod.
Merk: Mygg vil strømmen i den første 15 min. Langvarig inkubasjon tiden er nødvendig av sikkerhetsmessige årsaker. Blod dråper er tappet etter 2 h, dermed forurensning risikoen reduseres under sorteringen av matet mygg.
- Bedøve myggen med CO2 for 7 s.
Merk: Hvis myggen våkner, bruke en annen 3 s av CO2. - Sorter og antall fullt engorged mygg til en ny medisinglass.
- Legge til en bomull pute, mettet med fruktose (8% løsning) mellom ampullen og en plugg.
- Hold mygg på angitte temperaturen på 18 ° C eller 27 ° C i fuktighet av 80% 14 eller 21 dager.
- Feed mygg med fruktose-mettet bomull pads. Fylle hver 72 h med 1,5 mL fruktose (8% løsning) per medisinglass (opp til 20 mygg, avhengig av fôring rate, se trinn 2.5).
3. tvunget spyttsekresjon analysen på dag 14 eller 21
Merk: Alle trinnene utføres under BSL-3 forhold.
- Frø 2 x 104 Vero celler / per brønn i en 96 vel plate med 200 µL av vekst medium (Dulbecco´s endret eagle medium (DMEM) med 3% FBS, 100 U/mL penicillin, 100 mg/mL streptomycin, 5 µg/mL amfotericin B, 2 mM L-glutamin 1% ikke-essensielle aminosyrer (NEAA), 1% natrium pyruvate).
-
Klargjør spyttsekresjon enheten:
- Plass en kvadrerte glassplate (20 × 20 cm) på benken i en vinkel på 30°.
Merk: Dette er nødvendig på grunn av Undertrykk sikkerhet laboratoriet. Hvis platen er vannrett eller loddrett, vil væsken lekke. - Plass dobbeltsidig selvklebende tape på glassplaten.
- Rolle modell leire til den når 0,5 cm diameter og fest den vannrett 1 cm fra den dobbeltsidig teip.
- Klipp av den første 0,3 cm av tuppen på et 10 µL filter tips.
Merk: Det anbefales å forberede dette før du starter eksperimentet utenfor biosikkerhet laboratoriet. - Fyll den filter tips med 10 µL fosfat bufret saltoppløsning (PBS, pH 7.4).
- Plass filteret tips på modellering leire spissen mot den selvklebende tapen.
- Sikre filter tips med lett press.
- Plass en kvadrerte glassplate (20 × 20 cm) på benken i en vinkel på 30°.
-
Forbered myggen:
- Bedøve myggen med CO2.
- Fjern ben og vinger å nakkens myggen.
- Fastsette levende mosquito organer på den selvklebende tapen over et filter tips.
- Plass snabel forsiktig i filter tips.
- Kjør spyttsekresjon analysen i 30 min.
- Fjerne filter tips og kast leire og tape.
4. prosessering av spytt
Merk: Trinnene 4.1-4.6.2 utføres under BSL-3 forhold.
- Fjerne innholdet i reaksjon rør som inneholder 10 µL av PBS.
- Bland forsiktig og overføre innholdet i brønnene av forberedt 96 godt platen med en brønn per prøve.
- Inkuber platen i 7 dager på 37 ° C med 5% CO2.
- Bruk kikkerter for å sjekke celler for tilstedeværelse av cytopathic virkning (CPE).
- Hvis brønnen er positivt for CPE, høste nedbryting av pipettering 140 µL i en reaksjon rør for RNA utvinning.
-
Rense RNA ved hjelp av et RNA utvinning kit.
- Mix 140 µL nedbryting av med 560 µL av AVL buffer (viral lyseringsbuffer) og ruge i 10 min ved romtemperatur.
- Legge til 560 µL av etanol (96%) og vortex prøven.
Merk: Prøvene er inaktivert etter dette trinnet og kan slippes ut av BSL-3 laboratoriet. - Pipetter 630 µL av utvalget på en kolonne og sentrifuge med 6000 x g for 1 min.
- Forkaste filtratet, Pipetter den gjenværende 630 µL på kolonnen, og gjenta sentrifugering.
- Vask RNA, bundet til membranen av kolonnen, ved å legge 500 µL vaske bufferen 1 kolonne og sentrifuger 6000 x g for 1 min.
- Forkaste samling rør og plasser kolonnen i en ny samling rør. Legg til 500 µL vaske bufferen 2 og sentrifuger 12 500 x g i 3 minutter.
- Forkaste samling rør og plasser kolonnen i en 1,5 mL reaksjon rør.
- Legg til 50 µL av elueringsbufferen og ruge i 1 min i romtemperatur.
- Sentrifuge 6000 x g for 1 min, og deretter kaste kolonnen.
- Analysere prøvene for ZIKV RNA via RT-qPCR.
5. behandling av mygg organer
Merk: Trinnene 5.1-5.5 utføres under BSL-3 forhold.
- Fjerne likene av mosquito og plasser hver kroppen i en reaksjon rør.
Merk: Det er mulig å stoppe eksperimentet på dette punktet og lagre prøver på-80 ° C. - Legg til 500 µL av homogenisering media (DMEM uten alle supplementals) inn i reaksjon røret.
- Homogenize kroppen bruker hånd motor blandebatteri og bruke støvvei nye for hvert utvalg.
- Legge til 200 µL av homogenate i en 96-brønnen-plate for rensing.
Merk: Det er mulig å stoppe eksperimentet på dette punktet og lagre prøver på-80 ° C. - Deaktiver platen av inkubasjonstiden for 60 min på 60 ° C.
- Rense RNA den ved automatisert nukleinsyre rensing.
Merk: Det er mulig å stoppe eksperimentet på dette punktet og lagre prøver på-80 ° C.
6. analyse
- Kvantifisere Viral RNA kopiene bruker RT-qPCR.
Merk: RNA kopiene var gjennomsnitt over alle ZIKV-positive mygg organer og uten inkludert ZIKV-negativ myggen. - Beregne IR, definert som antallet ZIKV-positive mygg organer per antall matet kvinner.
- Beregne TR, definert som antallet mygg med ZIKV-positive spytt per antall ZIKV-positive mygg organer. Kan ikke beregne overføringshastigheten for arter temperatur kombinasjoner med ingen ZIKV-positive organer.
Representative Results
Aedes aegypti er kjent som en kompetent vektor for ZIKV minst under tropiske klimatiske forhold12. Derfor brukte vi Ae. aegypti som en positiv å etablere analysen, og analysere IRs samt TRs på en inkubasjon temperatur på 27 ° C og en fuktighet på 80%. IR og TR ble definert som tidligere beskrevet av Fortuna et al. 13. utfordret Ae. aegypti viste IR på 50% og 72% og TR 42% og 31% 14 og 21 dager stolpe infeksjon (PPT), henholdsvis (figur 1A og 1B). Deretter ble europeiske mygg testet for ZIKV infeksjon og overføring ved hjelp av tropiske samt temperert klima.
Ved 27 ° C inkubasjon temperatur viste alle mygg arter ZIKV infeksjon på 14 PPT samt 21 dpi, unntatt Cx. p. pipiens og Cx. torrentium individer, som var positive på 14 PPT bare. Alle Aedes arter viste høyere IRs (mellom 50% og 72%) og høyere viral RNA konsentrasjon (106 til 109 RNA Kopier/mygg eksemplarer) i forhold til de ulike Culex taxa, avslørt som IRs varierer mellom 0 % og 32% og viral masse 103 til 104 RNA Kopier/mygg prøver. Alle Aedes arter vises ZIKV-positive spytt (TR 13 – 42%), mens ingen av spytt prøver fra Culex taxa inneholdt ZIKV (figur 1A og 1B). Interessant, overføringshastigheter på 21 PPT var like i Ae. aegypti og Ae. albopictus fra Tyskland (30%), men var betydelig lavere i Ae. albopictus fra Italia (13%).
Inkubasjon av utfordret mygg ved en moderat temperatur på 18 ° C avslørte generelt lavere virus laster Aedes arter (104– 106 RNA Kopier/myggen) og de ulike Culex taxa (102-104 RNA Kopier/mygg). Men på 18 ° C inkubasjon temperatur, ble overføring av ZIKV ikke observert av mygg arten undersøkt.
Figur 1: overføringshastigheten av mygg eksperimentelt infisert med ZIKV. Resultatene av vektor kompetanse studier med ZIKV i annen mygg arter. Seks forskjellige mygg taxa var infisert med ZIKV og ruges 27 ° C, 18 ° C i 14 (A) eller 21 (B) dager. TR er definert som antall mygg med ZIKV-positive spytt per antall ZIKV-positive mygg organer. Totalt antall mygg undersøkt var 856 med et minimum av 30 individer for hver gang poeng/temperatur/mygg taxa. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Discussion
Det har tidligere vært vist at resultatene med tvungen spyttsekresjon er i tråd med klassisk re fôring eksperimenter6. Imidlertid er både nytt fôring eksperimenter og i våre presentert metoden for tvungen spyttsekresjon, det umulig å direkte bevis spyttsekresjon aktivitet eller overvåke utgivelsen av spytt. For å bevise spyttsekresjon aktivitet, prøver kunne bli testet for andre komponenter presentere i spytt (f.eks., proteiner, karbohydrater, etc.). Videre ville ytterligere qPCRs tillate oppdaging av viral RNA kopier. Dette krever imidlertid deling av spytt prøver for ulike analyser, noe som kan begrense følsomhet i celle kultur analysen ved svært lav partikkel tall. I sin tur kan dette føre til en undervurdering av de bestemt overføringshastigheter.
Reproduserbar resultatene er det nødvendig å sikre at alle mygg overleve til slutten av eksperimentet. Dette styres av visuelt overvåking kroppen bevegelse aktiviteten til myggen. Videre har prinsippet bruk av spyttsekresjon analysen for en gitt mygg Art å bli testet av fôring kontroll virus, som er kjent av denne bestemte mygg arter. Omvendt, må enhver virus introdusert i et eksperiment testes i en utsatt mygg.
Tvunget spyttsekresjon analyser har mange fordeler. Høyt antall mygg kan testes samtidig på en enkelt prøve base under kontrollerte standardisert forhold uten konflikt med dyrevelferd forskrifter9.
Metoden som brukes av flere laboratorier. Men kan nøyaktig oppsett variere, som kan føre til forskjellene i resultater mellom laboratorier. En kritisk komponent er av kapillær samle spytt, som kan være laget av glass14 eller plast15. Samsvar med høy sikkerhet forskrift av en biosafety nivå 3 insectary, brukte vi plast filter tips i stedet for glass kapillærene, dermed redusere risikoen for skader. Videre har filter tips fordelen at de samlet væsken kan enkelt overføres via en pipette.
Oppsettet av tvungen spyttsekresjon analysen presenteres her er basert på to etterforskere samarbeide og dele oppgaver. Demobilisering av av mosquito utføres av én person, mens den andre forbereder samtidig tvunget spyttsekresjon oppsettet. Dette betydelig reduserer håndtering tid og reduserer risikoen for eksempel bytte som endrer mellom demobilisering-arbeidsplassen og spyttsekresjon-platen er ikke nødvendig. Videre kan plassere myggen på tvunget spyttsekresjon enheten umiddelbart etter demobilisering. Ganske kort mygg behandlingstiden er avgjørende for vellykket tvunget spyttsekresjon. Til slutt, myggen kan være direkte kontrollert for motilitet gjennom hele eksperimentet.
Spyttsekresjon analysen presenteres her brukes til å få innsikt i vektor potensialet av mygg. Men andre spesifikke problemstillinger (f.eks., antall myggstikk som trengs for å infisere virveldyr), dyr eksperimenter kan fortsatt være nødvendig.
Disclosures
Forfatterne ikke avsløre.
Acknowledgments
Vi takker Ella Weinert, Michelle Helms og Marlis Badusche for utmerket kundestøtte, Jessica Börstler for analyser av Culex mygg, Norbert Becker og Björn Pluskota for å gi Aedes albopictus egg og Olli Vapalahti for gi virus aksjen. ML ble støttet av Leibniz Association; gi tall så-2014-SGN-3.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Inject+matic Sleeper | Inject+matic | ||
| Bugdorm-1 Insect Rearing Cage | BugDorm Store | ||
| Drosophila cultivation tubes | carl roth | PK11.2 | plastic vial for mosquitoes |
| Plug for drosophila cultivation tubes | carl roth | PK15.1 | |
| Constant climate chamber | Binder | KBF-240 | |
| Blood | banked human blood, expired, not usable for medical application | ||
| Dumont-Pincette Electronic SS | Dumont | B40c | |
| Vero cells | BNITM | ||
| Flash light aspirator | Bioquip | 2809 | |
| double-sided adhesive tape | no specific provider | ||
| Gammex Powder-free gloves with AMT | Ansell | for safety reasons necessary during work with pricks in the BSL3 laboratory | |
| RealStar Zika Virus RT-PCR-Kit | altona diagnostics | 591013 | |
| MagMax Pathogen RNA/DNA Kit | Thermo fisher scientific | 4462359 | RNA isolation of mosquito bodies |
| Qiamp viral RNA Mini Kit | Qiagen | 52906 | RNA-Isolation of supernatant |
| filter tips (20 µL) | Sarstedt | 701,116,210 | Cut the first 3 mm of the tip |
| hand motor mixer | carl roth | sold out | |
| micro pestles for hand motor mixer | carl roth | CXH8.1 | |
| DMEM | P0403550 | ||
| L Glutamine Penicilin/Streptomycin | PAN | P0819100 | |
| Amphotericin B | PAN | P06-0110 | |
| Fructose | carl roth | 4981.5 | |
| Phosphate buffered saline | PAN | P04-36500 | |
| FBS | PAN | ||
| Sodium Pyruvat | PAN | P0443100 | |
| MEM NAA | PAN | P0832100 | |
| Hemotek Feeder | Hemotek | PS6 | |
| Light Cycler | Roche | 480 II | |
| Light Cycler Software | Roche | 480 SW 1.5.1 | |
| Modeling clay | no specific provider | ||
| King Fisher Flex Purification System | ThermoFisher scientific | ||
| Aedes albopictus | eggs were collected in Freiburg, Germany | ||
| Binocular | MOTIC | SMZ-168 | |
| Binocular light | MOTIC | MLC-150C | |
| CO2-Incubator | Thermo scientific | MIDI 40 |
References
- Musso, D., Gubler, D. J.
- World Health Organization Regional Office for Europpe (WHO/Europe). No Title. , Available from: http://www.euro.who.int/en/health-topics/emergencies/zika-virus/technical-reports-and-guidelines-on-zika-virus/zika-virus-technical-report.-interim-risk-assessment-for-who-european-region (2016).
- Epelboin, Y., Talaga, S., Epelboin, L., Dusfour, I. Zika virus: An updated review of competent or naturally infected mosquitoes. PLOS Neglected Tropical Diseases. 11 (11), e0005933 (2017).
- Aliota, M. T., Peinado, S. A., Osorio, J. E., Bartholomay, L. C. Culex pipiens and Aedes triseriatus Mosquito Susceptibility to Zika Virus. Emerging Infectious Diseases. (10), 1857-1859 (2016).
- Turell, M. J., Linthicum, K. J., Patrican, L. A., Davies, F. G., Kairo, A., Bailey, C. L. Vector competence of selected African mosquito (Diptera: Culicidae) species for Rift Valley fever virus. Journal of Medical Entomology. 45 (1), 102-108 (2008).
- Cornel, A. J., Jupp, P. G. Comparison of three methods for determining transmission rates in vector competence studies with Culex univittatus and West Nile and Sindbis viruses. Journal of the American Mosquito Control Association. 5 (1), 70-72 (1989).
- Hurlbut, H. S. Mosquito salivation and virus transmission. The American Journal of Tropical Medicine and Hygiene. 15 (6), 989-993 (1966).
- Anderson, S. L., Richards, S. L., Smartt, C. T. A simple method for determining arbovirus transmission in mosquitoes. Journal of the American Mosquito Control Association. 26 (1), 108-111 (2010).
- Heitmann, A., Jansen, S., Lühken, R., Leggewie, M., Badusche, M., Pluskota, B., et al. Experimental transmission of Zika virus by mosquitoes from central Europe. Eurovsurveillance. 22 (2), (2017).
- Hierholzer, J. C., Killington, R. A. Virus Isolation and Quantitation - Virology methods manual. , (1996).
- Horzinek, R. W., Marian, C. Kompendium der allgemeinen Virologie. Zentralblatt für Veterinärmedizin R A. 32 (1-10), 480 (2010).
- Richard, V., Paoaafaite, T., Cao-Lormeau, V. -M. Vector Competence of French Polynesian Aedes aegypti and Aedes polynesiensis for Zika Virus. PLOS Neglected Tropical Diseases. 10 (9), (2016).
- Fortuna, C., Remoli, M. E., Di Luca, M., Severini, F., Toma, L., Benedetti, E., et al. Experimental studies on comparison of the vector competence of four Italian Culex pipiens populations for West Nile virus. Parasites & Vectors. 8, 463 (2015).
- Weger-Lucarelli, J., Rückert, C., Chotiwan, N., Nguyen, C., Garcia Luna, S. M., et al. Vector Competence of American Mosquitoes for Three Strains of Zika Virus. PLOS Neglected Tropical Diseases. Turell, M. J. 10 (10), (2016).
- Dubrulle, M., Mousson, L., Moutailler, S., Vazeille, M., Failloux, A. -B. Chikungunya virus and Aedes mosquitoes: saliva is infectious as soon as two days after oral infection. PLOS ONE. 4 (6), e5895 (2009).
