Summary
Virüs iletim kaynaklı sivrisinek verimli kontrol ilgili sivrisinekler vektör potansiyelini bilgisine özel ilgi içindir. Biz zorla salya vektör yetkinlik Aedes albopictus ve üç farklı Culex takson Zika virüs iletimi için analiz etmek için bir yöntem olarak tanımlamak.
Abstract
Vektör yetkinlik bir sivrisinek yoluyla bulaşan virüs (mobovirus) omurgalı bir ana bilgisayara iletmek için potansiyel bir sivrisinek türün olarak tanımlanır. Uygun virüs parçacıkları virüslü bir sivrisinek tükürük yoluyla kan yemek sırasında iletilir. Zorla salya deneyleri tek sivrisinekler, hayvan deneyleri kullanımı kaçınarak temelinde vektör potansiyeli belirleme sağlar. Sivrisinekler bir deneyde kısa bir süre içinde çok sayıda analiz etmek uygun bir yöntemdir. Zorla salya deneyleri 856 bireysel sivrisinekler de dahil olmak üzere iki farklı Almanya'da tuzağa çözümlemek için kullanılan Culex pipiens pipiens biotypes, Culex torrentium yanı sıra deneysel olarak enfekte Aedes albopictus, Zika virüsü (ZIKV) ve 18 ° C veya 27 ° C iki ve üç hafta boyunca inkübe. Sonuçlar farklı Culex özellikleri vektör yetkinlik eksikliği için ZIKV belirtti. Buna ek olarak, Aedes albopictus duyarlı ZIKV için ama sadece 27 ° C'de, iletim hızları benzer şekilde paralel olarak test bir Aedes aegypti laboratuvar kolonisi ile.
Introduction
2015 yılında, Zika virüs (ZIKV), Flaviviridae, Columbia ve Brezilya ortaya çıktı ve bir salgın ile dikkate değer sayıda neden Amerika ve Karayipler, arasında hızla yayıldı ailesine ait olan sivrisinek yoluyla bulaşan bir virüs (mobovirus) ilişkili klinik durumlarda microcephaly ve Guillain-Barré sendromu1. Sivrisinekler Aedes aegypti ve Aedes albopictus türlerin birincil ve ikincil vektörel çizimler ZIKV2kabul edilir ama Aedes diğer türü de deneysel vektör yeterlilik3 var kanıtlanmıştır . Aedes tür aksine şimdiye kadar test Culex türlerin çoğu virüs4iletimi mümkün değildir. Sadece, Culex quinquefasciatus için verileri kesin sonuçları3sağlanan. Şu anda, bilgileri sivrisinek vektör yetkinlik üzerinde ZIKV için orta sıcaklık koşullarında bulunmamaktadır (< 20 ° C). Ancak, bu bilgiler Orta Avrupa gibi ılıman iklime sahip bölgelerde mümkün yayılır risk değerlendirmesi için önemli olur.
ZIKV için yetkili bir vektör elde etmek, korumak, yükseltmek ve son olarak virüs iletimi yapabiliyor. Bu nedenle, sivrisinek organları veya ceset parçalarını test, bacaklar, midgut, ya da tükürük bezleri, ZIKV için de dahil olmak üzere vektör yetkinlik belirlemek yeterli değildir. Bulaşıcı virüs parçacıkları yayımlanan tükürük içinde sınamak için zorunludur. Vektör yetki değerlendirmek için enfeksiyon oranını (IR, ZIKV pozitif sivrisinek ceset sayısına göre tıkanmış sivrisinekler sayısı) ve iletim hızı (TR, sivrisinek ZIKV pozitif tükürük sayısına göre ZIKV-pozitif sivrisinek organları ile sayısı), olmak zorunda belirledi. IRS sivrisinek kolayca ters transkriptaz gerçek zamanlı polimeraz zincir reaksiyonu (RT-qPCR) tarafından takip sadece homojenizasyon sivrisinekler tarafından analiz ZIKV hedefleme. Ayrıca, enfeksiyon daha fazla sivrisinek başına viral kopya numaraları belirlenerek karakterize edilebilir. Buna ek olarak, iletim hızları Analizi uygun virüs parçacıkları bireysel sivrisinekler tükürük içinde tespiti kullanır. Bu virüslü sivrisinek viremi5ana bilgisayar analizini ardından duyarlı ana bilgisayar hayvanlar üzerinde besleme tarafından sağlanabilir. Ancak, bu yöntem uygun model organizmalar üzerinde dayanır ve pahalı ve hayvan refahı düzenlemeleri tarafından kısıtlanmış. İletim hızları analiz etmek için Laboratuvar hayvanlarının kullanımını önlemek ve maliyetleri azaltmak için yapay besleme sistemleri yeniden kan damlacıkları olmuştur kullanarak6açıklanır. Ancak, bireysel ölçekte yüksek sayisi ile kombine test zor ve zaman alıcı. Son yıllarda zorla salya deneyler sivrisinekler3,8 vektör yetki değerlendirmek için seçtiğiniz yöntemi haline gelmiştir ve bireysel ölçekte bir salya testin ilk açıklama 19667 ' de yayınlanan .
Temel, Orta Avrupa bizim vektör yetkinlik çalışma sivrisinekler son zamanlarda9yayınladı, Anderson ve arktarafından belirlendiği şekilde zorla salya tarif. 8 bazı değişikliklerle. Bu yöntem, standart yüksek işlem hacmi yüksek Biyogüvenlik düzeyi koşullarda (BSL-3) deneysel ve aktif virüs tanımlaması hücre tabanlı kültürü deneyleri tarafından içerir sağlar. Burada açıklanan deneyler 856 sivrisinekler içerir. Onlar yapay kan yemek tarafından ZIKV ile enfekte olduğunu ve daha sonra tükürük bulaşıcı virüs parçacıkları varlığı için analiz. Culex oluşan deneyler iki köklü laboratuvar nüfus alanının yanı sıra Ae. aegypti ve Culex pipiens pipiens biotype molestus (Cx. s. molestus) tanıttı sivrisinekler yakaladı pipiens pipiens biotype pipiens (Cx. s. pipiens), Culex torrentium (Cx. torrentium) ve iki Ae. albopictus nüfus. İtalya'da toplanmıştır, iki Ae. albopictus nüfus, biri dışında tüm sivrisinekler Almanya'da toplanmıştır.
Protocol
1. dişi sivrisinekler hazırlayın
- Sivrisinekler bir aspiratör (yaklaşık 400 sivrisinekler başına büyük kafes) kullanarak büyük bir kafes toplamak.
- Karbondioksit (CO2) 7 için sivrisinek anestezi s.
- Plastik şişe başına 20 kadın sıralamak (Ø 50 mm × 100 mm).
Not: sivrisinekler uyan başka bir 3 kullanırsanız, s Co2. - Sivrisinekler gecede açlıktan.
2. yapay kan yemek
Not: Tüm adımlar BSL-3 koşullar altında gerçekleştirilir.
-
Bulaşıcı kan yemek hazırlayın.
- 1 x 108 plak oluşturan birimler (PFU) konsantrasyonu virüs stok seyreltik / mL.
Not: Hisse senedi toplama doku kültürü bulaşma dozu 50 yönteminin (TCID50) gerçekleştirerek belirlenir ve Spearman & Kärber algoritması10,11tarafından hesaplanır. - Mix süresi insan kanı (kan koruma) kan bankasından (için uygun değildir artık, ama sivrisinekler için yararlı insan) Sığır serum (FBS) ve çalışma çözümü virüs stokunun ile fruktoz (%8 çözüm), filtrated (insan kan: fruktoz: FBS süresi: çalışma çözüm 5:3:1:1 =).
Not: Bu bilinen doğal memeli ev sahibi ZIKV çünkü biz insan kanı, seçti.
- 1 x 108 plak oluşturan birimler (PFU) konsantrasyonu virüs stok seyreltik / mL.
- 140 µL kan yemek Mix TCID50 üzerinden daha fazla çözümleme için dondur.
-
Bu tür bağlı olarak farklı beslenme yöntemleri kullanarak yapay besleme gerçekleştirin:
- Aedes aegypti: besleme sistemi 30 dk (Besleyici başına 1 mL) için bir membran kullanın.
- Culex spp.: gecede bir pamuklu çubuk ile bulaşıcı kan sağlamak ve kan (şişe başına 300 µL) kadar sıcak değil.
-
Aedes albopictus: iki damlacıkları (50 µL her) kan yemek karışımı plastik şişe koymak ve 2s için yem sivrisinekler yapalım. Kanı sıcak değil.
Not: Sivrisinek ilk 15 dk içinde besleyecek. Güvenlik nedeniyle nedeniyle uzun süreli kuluçka zamanı gereklidir. 2 h, böylece kirlenme riski sıralanması sırasında düşürülmüştür sivrisinekler beslenen sonra kan damlacıkları süzülmüş.
- CO2 7 için sivrisinek anestezi s.
Not: sivrisinekler uyan başka bir 3 kullanırsanız, s CO2. - Tam olarak sıralama ve sayısı sivrisinekler yeni bir şişe tıkanmış.
- Fruktoz (%8 çözüm) şişe ve bir fiş arasında ile doymuş bir pamuk yastık ekleyin.
- Sivrisinek belirlenen sıcaklığı 18 ° C veya nem % 80 27 ° C 14 veya 21 gün boyunca tutun.
- Sivrisinek fruktoz doymuş Pamuklu ped ile beslenir. Her 72 h fruktoz flakon (%8 çözüm) 1,5 mL ile doldurmak (en fazla 20 sivrisinekler, bağlı olarak besleme oranı, adım 2.5 bakınız).
3. zorla salya tahlil günde 14 ya da 21
Not: Tüm adımlar BSL-3 koşullar altında gerçekleştirilir.
- 2 x 104 Vero hücreleri tohum / 96 bir kuyu başı plaka (değiştirilmiş Dulbecco´s takıma %3 FBS, 100 U/mL penisilin, 100 mg/mL streptomisin, 5 µg/mL Amfoterisin B, 2 mM L-glutamin ile kartal Orta (DMEM) büyüme ortamının 200 µL ile iyi % 1 esansiyel olmayan amino asitler (NEAA), % 1 Sodyum pyruvate).
-
Salya cihazını hazırlayın:
- Bir açı 30 ° bankta bir kare cam levha (20 × 20 cm) yerleştirin.
Not: Bu underpressure Emanet laboratuarında nedeniyle gereklidir. Plaka yatay veya dikey ise, sıvı sızıntısı olacak. - Çift taraflı yapışkan bant cam levha üzerine yerleştirin.
- Rol modelleme kil bu kadar 0.5 cm çapında ulaşır ve yatay olarak 1 cm çift taraflı yapışkan bant uzakta ekleyebilirsiniz.
- 10 µL filtre ucu ucuna ilk 0.3 cm kesti.
Not: Bu dışında Biyogüvenlik Laboratuvar deney başlamadan önce hazırlamak için tavsiye edilir. - Filtre ipuçları fosfat tamponlu tuz (PBS, pH 7,4) 10 µL ile doldurun.
- Filtre ipuçları modelleme kil yapışkan bant doğru ucu yerleştirin.
- Hafif basınç ile filtre ipuçları güvenli.
- Bir açı 30 ° bankta bir kare cam levha (20 × 20 cm) yerleştirin.
-
Sivrisinekler hazırlayın:
- Sivrisinek CO2ile anestezi.
- Bacaklar ve kanatlar sivrisinekler hareketsiz kaldırın.
- Yaşayan sivrisinek yapışkan bant filtre bahşiş yukarıda cesetleri gidermek.
- Hortum yavaşça filtre ucu yerleştirin.
- Salya tahlil 30 dk için çalıştırın.
- Filtre ipuçları kaldırmak ve kil ve teyp atın.
4. tükürük işlenmesi
Not: Adımlar 4.1 – 4.6.2 BSL-3 koşullar altında gerçekleştirilir.
- İçeriği içeren PBS 10 µL tepki tüpler içine sınırdışı.
- Karışımı yavaşça ve içeriği örnek başına bir şey kullanarak hazırlanmış 96 iyi plaka kuyu içine aktarın.
- Plaka 37 ° c % 5 CO2ile 7 gün kuluçkaya.
- Binoküler hücreler cytopathic etkisi (CPE) varlığı için kontrol etmek için kullanın.
- Kuyu için CPE pozitifse süpernatant, tarafından pipetting 140 µL RNA çıkarılması için bir tepki tüp içine hasat.
-
RNA, RNA ekstraksiyon kiti kullanarak arındırmak.
- Mix 140 µL süpernatant, 560 µL AVL ile (viral lizis arabellek) tampon ve oda sıcaklığında 10 dakika için kuluçkaya.
- 560 µL etanol (% 96) ve girdap örnek ekleyin.
Not: Örnekleri bu adımdan sonra inaktive ve BSL-3 Laboratuvardan dışarı taburcu. - Damlalıklı 630 µL üzerine bir sütun ve 1 dk. için 6.000 x g ile santrifüj örnek.
- Filtrate, damlalıklı sütun üzerinde kalan 630 µL atmak ve aralıklarla tekrarlayın.
- RNA yıka, sütun, membran, 6.000 x g 1 dk. için de arabelleğe 1 sütun ve santrifüj yıkama 500 µL ekleyerek bağlı.
- Toplama tüp atın ve sütun yeni bir koleksiyon tüp içine yerleştirin. 500 µL çamaşır tampon 2 ve santrifüj 12.500 x g 3 dk de ekleyin.
- Toplama tüp atın ve sütun bir 1,5 mL tepki tüp içine yerleştirin.
- 50 µL elüsyon arabelleği ekleyin ve oda sıcaklığında 1 dk. için kuluçkaya.
- 6.000 x g 1 dk. için de santrifüj kapasitesi ve sonra sütun atar.
- ZIKV RNA RT-qPCR üzerinden için örnekleri analiz.
5. sivrisinek organları işlenmesi
Not: Adımlar 5.1-5,5 BSL-3 koşullar altında gerçekleştirilir.
- Sivrisinek organlarının çıkarın ve her vücut tepki tüp içine yerleştirin.
Not: Bu noktada deneme duraklatmak ve örnekleri-80 ° C'de depolamak mümkündür - Homojenizasyon medya (DMEM herhangi bir supplementals olmadan) 500 µL tepki tüp içine ekleyin.
- El motor Mikser kullanarak vücudun homojenize ve her örnek için yeni bir pistil kullanın.
- Homogenate 200 µL 96 iyi plaka arıtma içine ekleyin.
Not: Bu noktada deneme duraklatmak ve örnekleri-80 ° C'de depolamak mümkündür - 60 ° C'de 60 dk için kuluçka tarafından plaka devre dışı bırakma
- RNA tarafından otomatik nükleik asit arıtma arındırmak.
Not: Bu noktada deneme duraklatmak ve örnekleri-80 ° C'de depolamak mümkündür
6. analiz
- Viral RNA kopyaları RT-qPCR kullanarak ölçmek.
Not: RNA kopya tüm ZIKV pozitif sivrisinek organları üzerinde ve ZIKV negatif sivrisinek dahil olmadan ortalama. - ZIKV-pozitif sivrisinek ceset sayısına göre beslenen kadın sayısı olarak tanımlanan IR, hesaplayın.
- Sivrisinek ZIKV pozitif tükürük sayısına göre ZIKV-pozitif sivrisinek organları ile sayısı olarak tanımlanan TR, hesaplayın. İletim hızı hiçbir ZIKV pozitif organları ile türler-sıcaklık birleşimler için hesaplanamadı.
Representative Results
En azından Aedes aegypti yetkili vektör olarak ZIKV için tropikal iklim koşulları12altında bilinir. Bu nedenle, biz Ae. aegypti olumlu bir denetim olarak tahlil oluşturmak ve vergi dairesi yanı sıra TRs bir kuluçka 27 ° C sıcaklık ve nem oranı % 80 çözümlemek için kullanılır. IR ve TR daha önce Fortuna ve arktarafından açıklandığı gibi tanımlanmış. 13. IR % 50 ve % 72 ve TR % 42 ve %31 14 ve 21 gün sonrası enfeksiyon (dpi), sırasıyla gösterdi meydan Ae. aegypti (Şekil 1A ve 1B). Daha sonra Avrupa sivrisinekler ZIKV enfeksiyon ve tropikal gibi ılıman iklim koşulları kullanarak iletme için test edildi.
27 ° C kuluçka sıcaklığında ZIKV enfeksiyon 14 dpi hem de 21 dpi, sadece 14 dpi çözünürlükte olumlu Cx. s. pipiens ve Cx. torrentium bireyler hariç tüm sivrisinek tür gösterdi. Bütün Aedes türlerin gösterdi (% 50 ve % 72 arasında) daha yüksek vergi dairesi yanı sıra yüksek viral RNA konsantrasyonu (106 109 RNA kopya/sivrisinek numuneler kadar) farklı Culex takson ile karşılaştırıldığında hangi 0 arasında değişen IRS ortaya % ve % 32 ve viral yük-in 103 -104 RNA kopya/sivrisinek örnekler. Culex takson tükürük örnekleri hiçbiri ZIKV (Şekil 1A ve 1B) içerdiği, ancak tüm Aedes türler ZIKV pozitif tükürük (TR 13-%42), görüntülenen. İlginçtir, iletim hızları 21 dpi (% 30) Almanya'dan Ae. aegypti ve Ae. albopictus benzer, ama (% 13) önemli ölçüde Ae. albopictus İtalya'dan daha düşük idi.
Kuluçka orta sıcaklık 18 ° c meydan sivrisinek genellikle Aedes türler (104–106 RNA kopya/sivrisinek) yanı sıra farklı Culex takson (102 –104 alt virüs yükler ortaya RNA kopya/sivrisinek). Ancak, 18 ° C kuluçka sıcaklığında ZIKV iletimini herhangi bir soruşturma sivrisinek türler için gözlendi değil.
Şekil 1: iletim hızları deneysel olarak ZIKV ile enfekte sivrisinek. Çalışmaların sonuçları vektör yeterlilik ZIKV ile farklı sivrisinek türler. Altı farklı sivrisinek takson ZIKV ile enfekte ve 27 ° C veya 18 ° C 14(a)veya (B) 21 gün inkübe edildi. TR sivrisinek ZIKV pozitif tükürük sayısına göre ZIKV-pozitif sivrisinek organları ile sayısı olarak tanımlanır. Soruşturma sivrisinekler toplam sayısı 856, en az 30 bireylerin her zaman noktası/sıcaklık/sivrisinek takson için yapıldı. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Discussion
Daha önce zorla salya ile elde edilen sonuçların klasik yeniden beslenme deneyler6ile uyumlu olduğunu gösterilmiştir. Ancak, deneyler yeniden beslenme hem de zorla salya sunulan bizim Yöntem, doğrudan salya aktivite kanıt veya tükürük yayın izlemek imkansız. Diğer bileşenler tükürük sunmak için salya etkinliğini kanıtlamak için örnekleri test olabilir (Örn., proteinler, karbonhidratlar, vs.). Ayrıca, ek qPCRs viral RNA kopyaları algılama sağlayacak. Ancak, bu, duyarlılık durumunda çok düşük parçacık sayılar hücre kültür tahlil sınırlayabilir çeşitli analizler için tükürük örnekleri bölme gerektirir. Buna karşılık, bu kararlı iletim hızları bir küçümseme için neden olabilir.
Tekrarlanabilir sonuçlar elde etmek için tüm sivrisinekler deneme sonuna kadar hayatta kalmak emin olmak gereklidir. Bu görsel olarak sivrisinek vücut hareket etkinliğini izlemeye tarafından denetlenir. Ayrıca, bu belirli sivrisinek türlerin iletilmesi için bilinen kontrol virüs besleme tarafından test edilecek salya tahlil ilke kullanımı verilen sivrisinek türler vardır. Tersi, bir deney tanıttı her virüs duyarlı bir sivrisinek test edilmesi gerekiyor.
Zorla salya deneyleri pek çok avantajı var. Sivrisinekler sayısının fazlalığı aynı anda tek bir örnek kontrollü standart koşullar altında temel üzerinde hayvan refahı düzenlemeleri9ile çakışmadan test edilebilir.
Yöntemi birkaç laboratuvarları tarafından kullanılır. Ancak, tam kurulumları, hangi sonuçları farklılıkları laboratuvarlar arasında yol açabilir farklı olabilir. Cam14 veya plastik15yapılmış tükürük toplamak için kılcal bir kritik bileşenidir. Biyogüvenlik seviye 3 insectary yüksek güvenlik düzenlemeleriyle uyum sağlamak için biz plastik filtre ipuçları yerine cam kılcal, böylece yaralanma riskini azaltarak kullanılır. Ayrıca, filtre ipuçları toplanan sıvı kolayca bir pipet kullanarak transfer edilebilir avantajı var.
Burada sunulan zorla salya tahlil Kur üzerinde birlikte çalışma ve görev paylaşımı iki müfettişler dayanmaktadır. Diğer aynı anda zorla salya Kur hazırlanırken sivrisinek demobilizing bir kişi tarafından gerçekleştirilir. Bu önemli ölçüde işlem süresi azaltır ve riski en aza indirir örnek olarak değişen terhis İşyeri ve salya-plaka arasında geçiş gerekli değildir. Ayrıca, bu sivrisinekler zorla salya aygıtta hemen sonra terhis yerleştirerek sağlar. İşlem süresi oldukça kısa bu sivrisinek için başarılı Zorlanmış salya esastır. Son olarak, sivrisinekler doğrudan bütün deneyin boyunca hareketliliği için takip edilebilir.
Burada sunulan salya tahlil sivrisinek tür vektör potansiyelini anlayışlar kazanmak için kullanılmaktadır. Ancak, bazı belirli diğer soruları cevaplamak için (Örneğin., omurgalıların bulaştırmak için gerekli olan sivrisinek ısırıkları numaralarını), hayvan deneyleri hala gerekli olabilir.
Disclosures
Yazarlar ifşa gerek yok.
Acknowledgments
Biz Ella Weinert, Michelle Helms ve Marlis Badusche mükemmel teknik destek için analizleri Culex sivrisinekler, Jessica Börstler, Norbert Becker ve Björn Aedes albopictus yumurta ve Olli Vapalahti için sağlamak için Pluskota teşekkür ederim virüs hisse senedi sağlanması. ML Leibniz Derneği tarafından desteklenen; TESTERE-2014-SGN-3 verin.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Inject+matic Sleeper | Inject+matic | ||
| Bugdorm-1 Insect Rearing Cage | BugDorm Store | ||
| Drosophila cultivation tubes | carl roth | PK11.2 | plastic vial for mosquitoes |
| Plug for drosophila cultivation tubes | carl roth | PK15.1 | |
| Constant climate chamber | Binder | KBF-240 | |
| Blood | banked human blood, expired, not usable for medical application | ||
| Dumont-Pincette Electronic SS | Dumont | B40c | |
| Vero cells | BNITM | ||
| Flash light aspirator | Bioquip | 2809 | |
| double-sided adhesive tape | no specific provider | ||
| Gammex Powder-free gloves with AMT | Ansell | for safety reasons necessary during work with pricks in the BSL3 laboratory | |
| RealStar Zika Virus RT-PCR-Kit | altona diagnostics | 591013 | |
| MagMax Pathogen RNA/DNA Kit | Thermo fisher scientific | 4462359 | RNA isolation of mosquito bodies |
| Qiamp viral RNA Mini Kit | Qiagen | 52906 | RNA-Isolation of supernatant |
| filter tips (20 µL) | Sarstedt | 701,116,210 | Cut the first 3 mm of the tip |
| hand motor mixer | carl roth | sold out | |
| micro pestles for hand motor mixer | carl roth | CXH8.1 | |
| DMEM | P0403550 | ||
| L Glutamine Penicilin/Streptomycin | PAN | P0819100 | |
| Amphotericin B | PAN | P06-0110 | |
| Fructose | carl roth | 4981.5 | |
| Phosphate buffered saline | PAN | P04-36500 | |
| FBS | PAN | ||
| Sodium Pyruvat | PAN | P0443100 | |
| MEM NAA | PAN | P0832100 | |
| Hemotek Feeder | Hemotek | PS6 | |
| Light Cycler | Roche | 480 II | |
| Light Cycler Software | Roche | 480 SW 1.5.1 | |
| Modeling clay | no specific provider | ||
| King Fisher Flex Purification System | ThermoFisher scientific | ||
| Aedes albopictus | eggs were collected in Freiburg, Germany | ||
| Binocular | MOTIC | SMZ-168 | |
| Binocular light | MOTIC | MLC-150C | |
| CO2-Incubator | Thermo scientific | MIDI 40 |
References
- Musso, D., Gubler, D. J. Zika Virus. Clinical Microbiology Reviews. (3), 487-524 (2016).
- World Health Organization Regional Office for Europpe (WHO/Europe). No Title. , Available from: http://www.euro.who.int/en/health-topics/emergencies/zika-virus/technical-reports-and-guidelines-on-zika-virus/zika-virus-technical-report.-interim-risk-assessment-for-who-european-region (2016).
- Epelboin, Y., Talaga, S., Epelboin, L., Dusfour, I. Zika virus: An updated review of competent or naturally infected mosquitoes. PLOS Neglected Tropical Diseases. 11 (11), e0005933 (2017).
- Aliota, M. T., Peinado, S. A., Osorio, J. E., Bartholomay, L. C. Culex pipiens and Aedes triseriatus Mosquito Susceptibility to Zika Virus. Emerging Infectious Diseases. (10), 1857-1859 (2016).
- Turell, M. J., Linthicum, K. J., Patrican, L. A., Davies, F. G., Kairo, A., Bailey, C. L. Vector competence of selected African mosquito (Diptera: Culicidae) species for Rift Valley fever virus. Journal of Medical Entomology. 45 (1), 102-108 (2008).
- Cornel, A. J., Jupp, P. G. Comparison of three methods for determining transmission rates in vector competence studies with Culex univittatus and West Nile and Sindbis viruses. Journal of the American Mosquito Control Association. 5 (1), 70-72 (1989).
- Hurlbut, H. S. Mosquito salivation and virus transmission. The American Journal of Tropical Medicine and Hygiene. 15 (6), 989-993 (1966).
- Anderson, S. L., Richards, S. L., Smartt, C. T. A simple method for determining arbovirus transmission in mosquitoes. Journal of the American Mosquito Control Association. 26 (1), 108-111 (2010).
- Heitmann, A., Jansen, S., Lühken, R., Leggewie, M., Badusche, M., Pluskota, B., et al. Experimental transmission of Zika virus by mosquitoes from central Europe. Eurovsurveillance. 22 (2), (2017).
- Hierholzer, J. C., Killington, R. A. Virus Isolation and Quantitation - Virology methods manual. , (1996).
- Horzinek, R. W., Marian, C. Kompendium der allgemeinen Virologie. Zentralblatt für Veterinärmedizin R A. 32 (1-10), 480 (2010).
- Richard, V., Paoaafaite, T., Cao-Lormeau, V. -M. Vector Competence of French Polynesian Aedes aegypti and Aedes polynesiensis for Zika Virus. PLOS Neglected Tropical Diseases. 10 (9), (2016).
- Fortuna, C., Remoli, M. E., Di Luca, M., Severini, F., Toma, L., Benedetti, E., et al. Experimental studies on comparison of the vector competence of four Italian Culex pipiens populations for West Nile virus. Parasites & Vectors. 8, 463 (2015).
- Weger-Lucarelli, J., Rückert, C., Chotiwan, N., Nguyen, C., Garcia Luna, S. M., et al. Vector Competence of American Mosquitoes for Three Strains of Zika Virus. PLOS Neglected Tropical Diseases. Turell, M. J. 10 (10), (2016).
- Dubrulle, M., Mousson, L., Moutailler, S., Vazeille, M., Failloux, A. -B. Chikungunya virus and Aedes mosquitoes: saliva is infectious as soon as two days after oral infection. PLOS ONE. 4 (6), e5895 (2009).
