Summary
모기 품 어진 바이러스 전송의 효율적인 제어를 위해 각각 모기의 벡터 잠재력의 지식은 특정 관심의 이다. 우리는 Aedes albopictus Zika 바이러스의 전송에 대 한 3 개의 다른 Culex taxa의 벡터 역량을 분석 하는 방법으로 강제 타 액 분 비를 설명 합니다.
Abstract
벡터 적성 척추 호스트 모기 품 어진 바이러스 (mobovirus)를 전송 하는 모기의 잠재력으로 정의 됩니다. 가능한 바이러스 입자는 감염 된 모기의 타 액을 통해 혈액 식사 동안 전송 됩니다. 강제 타 액 분 비 분석 실험 동물 실험의 사용을 피하고 단일 모기 기초 벡터 잠재력을 결정 하실 수 있습니다. 메서드는 시간의 짧은 기간 내에 한 실험에서 모기의 많은 수를 분석 하는 적당 한. 강제 타 액 분 비 분석 실험 두 가지를 포함 하 여 독일에 갇혀 856 개별 모기를 분석 하는 데 사용 했다 Culex pipiens pipiens biotypes, 뿐만 아니라 실험적으로 감염 했다 Aedes albopictus Culex torrentium Zika 바이러스 (ZIKV)와 18 ° C에서 27 ° C 2, 3 주 동안 incubated 하 고. 결과 ZIKV에 대 한 다른 Culex taxa의 벡터 역량의 부족을 표시. 반면, Aedes albopictus 하지만 동시에 테스트 하는 Aedes aegypti 실험실 식민지와 유사한 전송 속도와 27 ° C에서 ZIKV에 취약 했다.
Introduction
2015 년, Zika 바이러스 (ZIKV), 가족 Flaviviridae, 콜롬비아와 브라질에서 등장 하 고 주목할 만한 수의 전염병을 일으키는 아메리카 및 카리브 해, 급속 하 게 확산에 속하는 모기 품 어진 바이러스 (mobovirus) 관련 임상 케이스 microcephaly의 Guillain-바레 증후군1. 종의 Aedes aegypti , Aedes albopictus 모기 ZIKV2, 기본 및 보조 벡터 간주 됩니다 하지만 다른 종의 속 Aedes 또한 실험 벡터 능력3 입증 . Aedes 종 달리 Culex 종 지금까지 테스트의 대부분은 바이러스4전송 수 없습니다. 단지, Culex quinquefasciatus 에 대 한 데이터 제공 불확실 결과3. 현재, 정보 부족 한 모기 벡터 적성에 ZIKV에 대 한 온건한 온도 조건 하에서 (< 20 ° C). 그러나,이 정보는 중앙 유럽 등 온대 기후 지역에 가능한 퍼짐의 위험 평가 대 한 상당한.
ZIKV에 대 한 유능한 벡터는 취득 하 고, 유지 하 고, 증폭 하 고 마지막으로 바이러스를 전송 수 있습니다. 따라서, 테스트 모기 시체 또는 시체의 부분, 다리, midgut, 머리 또는 침 샘를 포함 하 여 ZIKV에 대 한 충분 하지 않습니다 벡터 역량을 확인 하. 그것은 출시 된 타 액 내 감염 성 바이러스 입자에 대 한 테스트 필수입니다. 벡터 역량 평가, 감염 율 (IR, 부풀어 오른된 모기의 수 ZIKV 양성 모기 시체의 수)와 전송 속도 (TR, ZIKV 양성 수 ZIKV 양성 모기 시체의 타 액과 모기의 수), 될 필요가 확인 했습니다. 모기의 국세청은 단순히 균질 화 모기는 역전사 실시간 중 합 효소 연쇄 반응 (RT-정량)에 의해 다음에 의해 쉽게 분석 될 수 있다 ZIKV를 대상으로. 또한, 감염 모기 당 바이러스 복사본 번호를 확인 하 여 추가 특징 될 수 있습니다. 대조적으로, 전송 속도의 분석 개별 모기의 타 액에 있는 가능한 바이러스 입자의 검출에 의존합니다. 이 호스트5에 니의 분석 이어서 취약 호스트 동물에 감염 된 모기의 먹이로 달성 될 수 있다. 그러나,이 방법은 적당 한 모델 생물에 의존 하며 비용과 동물 복지 규정에 의해 제한 된. 전송 속도 분석 하기 위한 실험 동물의 사용을 방지 하 고 비용을 줄이기 위해 다시 먹이 시스템 인공 혈액 작은 물방울 되어를 사용 하 여 설명6. 그러나, 개인의 높은 숫자와 함께 개별 규모 테스트는 어렵고입니다. 개별 규모에 타 액 분 비 분석 결과의 첫 번째 설명 19667 에 출판 되었음 및 최근 몇 년 동안 강제 타 액 분 비 실험 방법의 선택 모기3,8의 벡터 역량을 평가 하 되 .
따라 중앙 유럽의 우리의 벡터 능력 연구에 모기 최근에 출판 된9, 앤더슨 외에서 보고 우리 강제 타 액 분 비를 설명. 몇 가지 수정 8 . 이 메서드는 표준화 하는 높은 처리량 높은 biosafety 수준 조건 (BSL-3)에서 실험 및 세포 기반 문화 분석 실험에 의해 활성 바이러스의 식별을 포함 수 있습니다. 여기에 설명 된 실험 856 모기를 포함 한다. 그들은 인공 혈액 식사에 의해 ZIKV에 감염 되었고 그 후 타 액에서 감염 성 바이러스 입자의 존재에 대 한 분석. 필드와 Ae aegypti 와 Culex pipiens pipiens biotype molestus (Cx. p. molestus)의 실험 구성 두 개의 오래 된 실험실 인구에 모기 잡은 Culex pipiens pipiens biotype pipiens (Cx. p. pipiens), Culex torrentium (Cx torrentium)와 두 개의 Ae albopictus 인구. 이탈리아에서 수집 된, 두 개의 Ae albopictus 인구 중 하나를 제외한 모든 모기 독일에서 수집 했다.
Protocol
1. 준비 여성 모기
- 흡 인기 (큰 감 금 소 당 약 400 모기)를 사용 하 여 큰 케이지에서 모기를 수집 합니다.
- 7에 대 한 이산화탄소 (CO2)와 모기 anesthetize s.
- 플라스틱 병 당 20 여성을 정렬 (Ø 50 m m × 100 mm).
참고: 모기 일어나, 다른 3 사용의 s2. - 밤새 모기 굶 어.
2. 인공 혈액 식사
참고: 모든 단계는 BSL-3 조건 하에서 수행 됩니다.
-
전염 성 혈액 식사를 준비 합니다.
- 1 x 108 플 라크 형성 단위 (PFU)의 농도에 바이러스 주식 희석 / mL.
참고: 재고 농도 조직 문화 감염 복용량 50 방법 (TCID50)를 수행 하 여 결정 되었고 Spearman & Kärber 알고리즘10,11계산. - 혼합 혈액 은행에서 인간의 혈액 (혈액 보존) 만료 (에 적합 하지 않은 모기에 대 한 유용 하지만, 더 이상 인간)과 당 (8% 솔루션), 만들어지고 소 혈 청 (FBS)와 바이러스의 작업 솔루션 (인간의 혈액:과 당: FBS 만료: 작업 솔루션 = 5:3:1:1).
참고: 우리 때문에 이것이 알려진된 자연 포유동물 호스트 ZIKV의 인간의 혈액 선택.
- 1 x 108 플 라크 형성 단위 (PFU)의 농도에 바이러스 주식 희석 / mL.
- 혈액 식사 혼합 TCID50 통해 추가 분석을 위해의 140 µ L를 고정 합니다.
-
인공 먹이 종에 따라 다른 먹이 방법을 사용 하 여 수행.
- Aedes aegypti: 막 먹이 30 분 (1 mL 당 급지대) 시스템을 사용 하 여.
- Culex 종: 밤새 면 스틱을 통해 감염 혈액을 제공 하 고 피 (병 당 300 µ L) 따뜻한 하지 않습니다.
-
Aedes albopictus: 플라스틱 유리병으로 혈액 식사 혼합의 두 방울 (50 µ L 각)을 넣어 고 모기 2 h에 대 한 피드. 혈액 따뜻한 하지 않습니다.
참고: 모기는 첫번째 15 분에 공급 합니다. 연장된 보육 시간은 안전 상의 이유로 인해 필요 합니다. 혈액 방울 2 h, 따라서 오염 위험의 정렬 하는 동안 감소 된다 모기 먹이 후 배수는 한다.
- 7 공동2 모기 anesthetize s.
참고: 경우 모기 일어나 사용 하 여 다른 3 CO2의 s. - 정렬 및 카운트 완전히 부풀어 오른 모기 새로운 유리병에.
- 면 패드, 유리병 및 플러그 사이 (8% 솔루션)과 포화 상태를 추가 합니다.
- 14 또는 21 일 동안 18 ° C 또는 80%의 습도에서 27 ° C의 지정 된 온도에서 모기를 유지.
- 과 포화 목화 패드와 함께 모기를 피드. 모든 72 h 1.5 mL 유리병 당과 당 (8% 솔루션)의 보충 (20 모기까지 먹이 따라 속도, 단계 2.5 참조).
3. 강제 14 또는 21 일에 타 액 분 비 분석 실험
참고: 모든 단계는 BSL-3 조건 하에서 수행 됩니다.
- 2 × 104 Vero 세포 씨앗/는 96에 잘 당 잘 성장 매체 (Dulbecco´s 수정이 글 중간 (DMEM) 3 %FBS, 100 U/mL 페니실린, 100 mg/mL 스, 5 µ g/mL 암포 B, 2 mM L-글루타민 보충의 200 µ L 플레이트 1% 비 본질적인 아미노산 (NEAA), 1% 나트륨 pyruvate).
-
타 액 분 비 장치를 준비:
- 30 °의 각에서 벤치에 제곱된 유리 접시 (20 × 20 cm)를 배치 합니다.
참고:이 안전 실험실에서 underpressure 때문. 접시는 수평 또는 수직, 액체 누출 됩니다. - 이중 양면된 접착 테이프는 유리 접시 위에 놓습니다.
- 역할까지 모델링 점토 0.5 cm의 직경을 도달 하 고 가로 1cm 양면 접착 테이프에서 연결.
- 10 µ L 필터 팁의 팁의 첫 번째 0.3 cm을 잘라.
참고: biosafety 실험실 외부 실험을 시작 하기 전에 이것을 준비 합시다. - 버퍼링 하는 인산 염 (PBS, pH 7.4)의 10 µ L로 필터 팁을 채우십시오.
- 스티커 테이프 쪽으로 팁 모델링 점토에 필터 팁을 놓습니다.
- 부드러운 압력으로 필터 팁 보안.
- 30 °의 각에서 벤치에 제곱된 유리 접시 (20 × 20 cm)를 배치 합니다.
-
모기를 준비:
- CO2모기 anesthetize
- 다리와 날개 무력화 모기를 제거 합니다.
- 필터 팁 위에 스티커 테이프에 생활 모기 시체를 수정 합니다.
- 장소 필터 팁으로 부드럽게 코입니다.
- 30 분에 대 한 타 액 분 비 분석 실험을 실행 합니다.
- 필터 팁을 제거 하 고 점토와 테이프 폐기.
4입니다. 타 액의 처리
참고: 단계 4.1-4.6.2 BSL-3 조건 하에서 수행 됩니다.
- PBS의 10 µ L을 포함 하는 반응 튜브에 내용을 추방.
- 부드럽게 혼합 하 고 사용 하 여 샘플 당 하나 잘 준비 96 잘 접시의 우물으로 콘텐츠를 전송.
- 5% CO2와 37 ° C에서 7 일 동안 접시를 품 어.
- Cytopathic 효과 (CPE)의 존재에 대 한 셀을 확인 하는 쌍안경을 사용 합니다.
- 잘 CPE에 대 한 긍정적인 경우에, RNA 추출에 대 한 반응 관에는 상쾌한 pipetting 140 µ L에 의해 수확.
-
RNA 추출 키트를 사용 하 여 RNA를 정화.
- AVL의 560 µ L로는 상쾌한의 믹스 140 µ L (바이러스 성 세포의 용 해 버퍼)를 버퍼링 하 고 실 온에서 10 분 동안 품 어.
- 에탄올 (96%)와 소용돌이 샘플의 560 µ L를 추가 합니다.
참고: 샘플이이 단계 후 비활성화 하 고 BSL-3 실험실에서 출력 될 수 있습니다. - 피펫으로 630 µ L 열에 1 분 동안 6000 x g으로 원심 분리기 샘플의.
- 여과 액을 피펫으로 열에 나머지 630 µ L 삭제 하 고는 원심 분리를 반복 합니다.
- RNA를 세척, 6000 x g 1 분에서 버퍼 1 열 및 분리기 세척의 500 µ L을 추가 하 여 열의 막에 바인딩된.
- 컬렉션 튜브를 버리고 고 열 새로운 컬렉션 튜브를 합니다. 12500 x g 3 분 동안에 500 µ L 세척 버퍼 2와 원심 분리기를 추가 합니다.
- 컬렉션 튜브를 버리고 고 열 1.5 mL 반응 관 합니다.
- 차입 버퍼의 50 µ L을 추가 하 고 실 온에서 1 분 동안 품 어.
- 1 분 동안 6000 x g 에서 centrifuge 고 열을 삭제.
- 실시간 정량 Pcr을 통해 ZIKV RNA에 대 한 샘플을 분석 합니다.
5. 모기 시체의 처리
참고: 단계 5.1-5.5 BSL-3 조건 하에서 수행 됩니다.
- 모기의 시체를 제거 하 고 각 신체 반응 관에 배치.
참고:이 시점에서 실험을 일시 중지-80 ° c.에 샘플을 저장 하는 - 반응 관에 균질 미디어 (어떤 supplementals 없이 DMEM)의 500 µ L를 추가 합니다.
- 손 모터 믹서를 사용 하 여 본문을 균질 하 고 모든 샘플에 대 한 새로운 암 꽃 술을 사용 합니다.
- 96 잘 접시 정화에 대 한에 homogenate의 200 µ L를 추가 합니다.
참고:이 시점에서 실험을 일시 중지-80 ° c.에 샘플을 저장 하는 - 60 분 60 ° c.에 외피에 의해 접시를 비활성화
- 자동화 된 핵 산 정화 하 여 RNA를 정화.
참고:이 시점에서 실험을 일시 중지-80 ° c.에 샘플을 저장 하는
6입니다. 분석
- 실시간 정량 Pcr를 사용 하 여 바이러스 성 RNA 복사본 계량.
참고: RNA 복사본에는 모든 ZIKV 양성 모기 시체와 ZIKV 부정적인 모기를 포함 하지 않고 평균 했다. - IR, ZIKV 양성 모기 시체 수가 먹이 여성 당 수로 정의 계산 합니다.
- TR, ZIKV 양성 수 ZIKV 양성 모기 시체의 타 액과 모기의 수를 계산 합니다. 전송 속도 없음 ZIKV 양성 기관과 종 온도 조합에 대 한 계산 되지 않을 수 있습니다.
Representative Results
Aedes aegypti 알려져 있다 유능한 벡터로 ZIKV 이상 열 대 기후 조건12에서. 따라서, 우리 사용 Ae aegypti 긍정적인 컨트롤로 분석 결과 설정 하 고 국세청 27 ° C의 외피 온도 80%의 습도에서 TRs 분석. IR 및 TR 앞에서 설명한 포 외에 의해 정의 되었다. 13. 도전 Ae aegypti 각각 감염 (dpi), 게시 하는 IR 50%와 72%와 42%, 14, 21 일에 31%의 TR을 보여주었다 (그림 1A 및 1B). 그 후, 유럽 모기 ZIKV 감염 및 전송 뿐만 아니라 온화한 열 대 기후 조건을 사용 하 여 테스트 되었습니다.
27 ° C 부 화 온도에서 모든 모기 종 14 dpi 14 dpi만에서 긍정 했다 Cx. p. pipiens 및 Cx torrentium 개인을 제외 하 고 21 dpi에서 ZIKV 감염을 보였다. 모든 Aedes 종 높은 바이러스 성 RNA 농도 뿐만 아니라 높은 국세청 (사이 50% 및 72%)을 보였다 (106 109 RNA 복사본/모기 표본까지)는 0 사이 배열 하는 국세청을 밝혀 다른 Culex taxa에 비해 % 그리고 32%와 10 바이러스 부하3 104 RNA 복사본/모기 표본. 모든 Aedes 종 Culex taxa에서 타 액 샘플의 ZIKV (그림 1A 및 1B)을 포함 하는 반면 ZIKV 양성 침 (TR 13-42%), 표시. 흥미롭게도, 21 dpi에서 전송 속도 Ae aegypti 및 Ae albopictus 독일 (30%)에서 유사 했다 하지만 이탈리아에서 Ae albopictus 에 실질적으로 더 낮은 (13%) 했다.
인큐베이션 18 ° C의 적당 한 온도에 도전된 모기의 일반적으로 낮은 바이러스 로드 Aedes 종 (104– 106 RNA 복사본/모기) 뿐만 아니라 다른 Culex taxa (102-104 공개 RNA 복사본/모기). 18 ° C 부 화 온도에서 ZIKV의 전송 하지 조사 모기 종에 대 한 관찰 되었다.
그림 1: 전송 속도 ZIKV 실험적으로 감염 하는 모기의. 다른 모기 종에 ZIKV 가진 벡터 능력 학문의 결과. 6 다른 모기 taxa ZIKV에 감염 되었고 27 ° C 또는 18 ° C 14 (A) 또는 (B) 21 일 알을 품을. TR은 ZIKV 양성 수 ZIKV 양성 모기 시체의 타 액과 모기의 수로 정의 됩니다. 조사 하는 모기의 총 수는 856, 각 시간 포인트/온도/모기 taxa에 30 개인의 최소 이었다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
Discussion
그것은 이전 강제 타 액 분 비와 함께 얻은 결과 고전 다시 먹이 실험6라인 표시 되었습니다. 그러나, 다시 실험을 먹이 강제 타 액 분 비의 우리의 제시 방법에서, 직접 타 액 분 비 활동 증거 또는 타 액의 릴리스를 모니터링 수는 없습니다. 증명 하기 위해 타 액 분 비 활동, 샘플 시험 될 수 있었다 다른 구성 요소는 타 액에 존재 하는 위해 (예., 단백질, 탄수화물, 등.). 또한, 추가 qPCRs 바이러스 성 RNA 사본의 감지를 수 있습니다. 그러나 이것은,, 셀 문화 분석 결과 매우 낮은 입자 번호 경우에 민감도 제한할 수 있습니다 다양 한 분석에 대 한 타 액 샘플의 분할 필요 합니다. 차례 차례로,이 과소 결정된 전송 속도의 발생할 수 있습니다.
재현 가능한 결과 위해 그것은 모든 모기는 실험의 끝까지 살아 남기 위해 필요한입니다. 이것은 시각적으로 모기의 몸 운동 활동을 모니터링 하 여 제어 됩니다. 또한, 주어진된 모기 종에 대 한 타 액 분 비 분석 실험의 원리 사용 제어 바이러스,이 특정 모기 종에 의해 전송 될 알려진 먹이로 테스트할 수 있다. 반대로, 실험에 도입 하는 모든 바이러스 감염 모기에서 테스트할 수 있다.
강제 타 액 분 비 분석 실험은 많은 이점이 있다. 모기의 높은 숫자를 동시에 제어 표준화 된 조건 하에서 기본 단일 표본에 동물 복지 규정9와 충돌 하지 않고 테스트할 수 있습니다.
메서드는 여러 실험실에 의해 사용 됩니다. 그러나, 정확한 설정을 달라질 수 있습니다, 실험실 사이 결과에 차이를 낼 수 있는. 하나의 중요 한 구성 요소는 유리14 또는 플라스틱15의 만들 수 있는 타 액을 수집 하는 모 세관. Biosafety 수준 3 insectary의 높은 안전 규정을 준수, 우리 플라스틱 필터 팁 대신 사용 유리 모 세관, 상해의 위험 감소. 또한, 필터 팁을 수집된 액체 쉽게 옮겨질 수는 피 펫을 사용 하 여 하는 이점이 있다.
여기에 제시 된 강제 타 액 분 비 분석 실험의 설치 두 조사 협력 및 업무 공유를 기반으로 합니다. 모기의 demobilizing 다른 동시에 강제 타 액 분 비 설치를 준비 하는 동안 한 사람에 의해 수행 됩니다. 이 크게 처리 시간을 단축 하 고 위험을 최소화 샘플의 철거 작업 환경 및 타 액 분 비 판 사이 변경으로 전환 필요 하지 않습니다. 또한, 제 대 직후 강제 타 액 분 비 장치에 모기를 배치 하는 수 있습니다. 처리 시간이 오히려 짧은 모기 성공적인 강제 타 액 분 비에 필수적 이다. 마지막으로, 모기는 모든 실험을 통해 운동에 대 한 직접 모니터링할 수 있습니다.
여기에 제시 된 타 액 분 비 분석 결과 모기 종의 벡터 잠재력에 통찰력을 얻을 하는 데 사용 됩니다. 그러나, 몇 가지 구체적인 질문에 대답 (예., 척추 동물을 감염 하는 데 필요한 모기 물린의 숫자), 동물 실험 필요 수.
Disclosures
저자는 공개 없다.
Acknowledgments
우리 감사 엘라 Weinert, 미셸 헬 름 및 우수한 기술 지원 Marlis Badusche, Culex 모기의 분석에 대 한 제시카 Börstler, 노르 베르트 베 커와 Björn Pluskota Aedes albopictus 계란과 올 리 Vapalahti에 대 한 제공에 대 한 바이러스 재고를 제공합니다. ML는 Leibniz 협회에 의해 지원 되었다 번호 보았다-2014-SGN-3을 부여 합니다.
Materials
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Inject+matic Sleeper | Inject+matic | ||
Bugdorm-1 Insect Rearing Cage | BugDorm Store | ||
Drosophila cultivation tubes | carl roth | PK11.2 | plastic vial for mosquitoes |
Plug for drosophila cultivation tubes | carl roth | PK15.1 | |
Constant climate chamber | Binder | KBF-240 | |
Blood | banked human blood, expired, not usable for medical application | ||
Dumont-Pincette Electronic SS | Dumont | B40c | |
Vero cells | BNITM | ||
Flash light aspirator | Bioquip | 2809 | |
double-sided adhesive tape | no specific provider | ||
Gammex Powder-free gloves with AMT | Ansell | for safety reasons necessary during work with pricks in the BSL3 laboratory | |
RealStar Zika Virus RT-PCR-Kit | altona diagnostics | 591013 | |
MagMax Pathogen RNA/DNA Kit | Thermo fisher scientific | 4462359 | RNA isolation of mosquito bodies |
Qiamp viral RNA Mini Kit | Qiagen | 52906 | RNA-Isolation of supernatant |
filter tips (20 µL) | Sarstedt | 701,116,210 | Cut the first 3 mm of the tip |
hand motor mixer | carl roth | sold out | |
micro pestles for hand motor mixer | carl roth | CXH8.1 | |
DMEM | P0403550 | ||
L Glutamine Penicilin/Streptomycin | PAN | P0819100 | |
Amphotericin B | PAN | P06-0110 | |
Fructose | carl roth | 4981.5 | |
Phosphate buffered saline | PAN | P04-36500 | |
FBS | PAN | ||
Sodium Pyruvat | PAN | P0443100 | |
MEM NAA | PAN | P0832100 | |
Hemotek Feeder | Hemotek | PS6 | |
Light Cycler | Roche | 480 II | |
Light Cycler Software | Roche | 480 SW 1.5.1 | |
Modeling clay | no specific provider | ||
King Fisher Flex Purification System | ThermoFisher scientific | ||
Aedes albopictus | eggs were collected in Freiburg, Germany | ||
Binocular | MOTIC | SMZ-168 | |
Binocular light | MOTIC | MLC-150C | |
CO2-Incubator | Thermo scientific | MIDI 40 |
References
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