이 프로토콜에는 hepatocyte 같은 셀 96 잘 접시 형태로 인간의 pluripotent 줄기 세포에서 생산 하는 반자동된 접근 방식을 설명 합니다. 이 프로세스는 신속 하 고 비용 효율적인, 품질의 생산 기초 및 응용 연구를 인간의 hepatocyte 같은 셀 배치를 안심 수 있도록 합니다.
인간의 pluripotent 줄기 세포는 인간 조직의 재생 소스를 나타냅니다. 우리의 연구는 인간 배아 줄기 세포 (hESCs)에서 인간의 간 조직 생성에 집중 하 고 유도 만능 줄기 세포 (Ipsc). 현재 차별화 절차 생성 인간의 hepatocyte 같은 셀 (HLCs) 태아 및 성인 특성의 혼합을 표시 합니다. 세포 표현 형을 개선 하기 위해, 우리는 완전히 정의 우리의 차별화 절차 및 셀 틈새 향상 된 유전자 발현 및 기능을 표시 하는 세포 인구의 세대의 결과로. 이러한 연구 진행 상황 표시, 하는 동안 능력 심사에 대 한 멀티 잘 플레이트의 대량 생성을 노동 집약적인 절차와 일괄 배치에 의해 제한 되었습니다 했다. 이 문제를 해결 하기 위해 우리는 HLCs 줄기 세포 시드로 만능 줄기 세포를 분화 하는 반 자동화 플랫폼을 개발 하 고 차별화 96 잘 접시 형태로 액체 처리 및 자동 pipetting 시스템을 사용 하 여 수행 했다. 차별화, 다음 셀 형 자동화 된 현미경 검사 법 및 멀티 잘 루미 노 사용 하 여 분석 했다.
기본 인간 hepatocytes (PHHs) 간 생물 의학 연구에 대 한 현재 표준을 나타냅니다. 그들의 장점에도 불구 하 고 PHHs는 불안정 형1성숙 hepatocytes의 제한 된 소스를 나타냅니다. 인간 배아 줄기 세포 (ESCs) 및 인간 유도 만능 줄기 세포 (iPSC) 제안 되었습니다 강력한 자원으로 서 생물 의학 연구, 약속의 간2,3,4 포함 하 여, 인간의 조직 재생 소스에 대 한 . 현재 hepatocyte 차별화 프로시저 생성 hepatocyte 마커, 유전자 및 PHHs3,,45,6,7, 유사한 기능을 표현 하는 셀 8,9,,1011. 더 최근에, 정의 된 재료 및 재조합 laminins 같은 행렬을 사용 하 여 향상 된 세포 표현 형 및 재현성 실험5,12,,1314있다.
전통적인 셀 문화 기술 의존 무 겁 게 수동 pipetting에 시간이 소모 및 오류가 발생 하기 쉬우며. 이 분석 결과 하나 작업할 수 있는 플레이트 포맷의 처리량을 제한 합니다. 날짜 하려면, 대부분 연구 HLCs의 생성을 설명 하는 노동 집약적인 자연과 크기15,,1617에 따라서 작은 규모에.
현재 액체 취급에서을 pipetting 시스템, 자동화 된 현미경 검사 법 및 실험실 해석기와 함께 만든 그것은 인간의 개입에 대 한 요구를 최소화 하는 절차를 개발할 수 합니다. 우리가 이러한 기술의 이용 및 많은 양의 기본에 대 한 인간의 간 조직 생성 하는 반자동된 차별화 시스템 개발 고 생물 의학 연구를 적용. 이 이렇게 인간의 ESC와 iPSC 라인 사소한 조정 셀 라인에 따라 필요한 수행할 수 있습니다. 이 시스템을 결합 하 여 높은 콘텐츠 분석, 적은 시간과 규모18,,1920,21에서 HLC 형질 수 설명 합니다.
요약, 여기에 설명 된 세포 문화 기술의 자동화 신뢰성, 실험 시간 관리 및 분석 결과 처리량 개선으로 이끌어 냈다.
우리의 반자동된 절차는, 신뢰할 수 있는 효율적이 고 경제적인 규모 (그림 1)에서 HLCs의 생산을 허용 합니다. 하이 플랫폼 세포 기반 스크리닝 (그림 2)에 대 한 적절 한 접근 격판덮개 우물 사이 셀 수 상당한 차이 없었다. 또한, 반 자동화 워크플로우는 수동 프로세스5,12를 사용 하기 전에 가능 하지 않았다 많은 접시 한 번에 생산 사용자 수 있습니다.
중요 한 것은, 자동화 프로세스 HNF4α을 표현 하는 세포의 대다수와 차별화 수익률에 영향 하지 않았다 (89.2% ± 2) 및 ALB (92.8% ± 6) (그림 3). 또한 HLCs CYP P450 효소 CYP2D6 그리고 CYP3A4 표현 하 고 CYP1A2, CYP3A 신진 대사 활동 이전 보고 실험 (그림 3)5에 비해 표시. 프로토콜의 표준화에도 불구 하 고 분화 하기 전에 셀 confluency은 순수 HLC 차별화 중요 합니다. 따라서, 중요 한 고려 사항 (그림 1)은 잘 걸쳐 좋은 셀 배포를 보장. 이 종속 셀 라인 것을 입증 했다, 따라서 셀 시드 및 밀도 최적화 각 셀 라인 이전 확장에 대 한 필요 합니다.
그것의 현재 모양에서이 플랫폼은 임상 응용 프로그램에 대 한 HLCs의 대량 생산에 적합 하지 않습니다 그리고이 대부분 셀 공장 및 생물 반응 기의 사용을 통해 달성 될 것입니다. 그러나, 개발 방법론에서는 질병 모델링, 마약 검사 및 약물 연구를 재사용에 대 한 인간의 간 세포의 급속 한 세대 수 있습니다. 또한, 분석 결과 멀티플렉싱, 의무가 기계 분석에 대 한 multiparametric 데이터 집합 생성을 허용. 앞으로 고, 우리 또한이 기술을 좀 더 복잡 한 생체 외에서 시스템에 3D 차별화 또는 HLC 형에서 생체 외에서개선 하기 위해 플랫폼으로 적용 될 수 믿습니다.
결론적으로, 우리는 믿습니다 우리의 간단 하 고 반자동 시스템 실험 처리량을 증가 하 고 실험 편차를 줄이기 위해 생물 학적 데이터 세트와 인간의 생리 쪽으로 그들의 추정의 품질 향상.
The authors have nothing to disclose.
이 작품은 주요한 과학자의 사무실 (TCS/16/37)와 MRC 박사 장학금에서 상을 지원 했다.
405 LS Washer | Biotek | ||
B27 supplement | Life Technologies | 12587-010 | |
beta-mercaptoethanol | Life Technologies | 31350 | |
Bovine Serum Albumin | Sigma-Aldrich | A2058 | |
DMSO | Sigma-Aldrich | D5879 | |
DPBS with Calcium and Magnesium | ThermoFisher | 14040133 | |
Gentle cell dissociation reagent | STEMCELL Technologies | 7174 | |
GlutaMax | Life Technologies | 35050 | |
GripTips for VIAFLO 96 | Integra | 6434 | |
HepatoZYME-SFM | Life Technologies | 17705021 | |
Human Activin A | Peprotech | 120-14E | |
Human Hepatocyte Growth Factor | Peprotech | 100-39 | |
Human Oncostatin M | Peprotech | 300-10 | |
Human Recombinant Laminin 521 | BioLamina | LN521-02 | |
Hydrocortisone 21-hemisuccinate sodium salt | Sigma-Aldrich | H4881 | |
Knockout DMEM | Life Technologies | 10829 | |
Knockout Serum Replacement | Life Technologies | 10828 | |
mTeSR1 medium | STEMCELL Technologies | 5850 | |
MultidropCombi Reagent Dispenser | ThermoFisher | 5840300 | |
Non-essential amino acids | Life Technologies | 11140 | |
Operetta High-Content Imaging System | PerkinElmer | HH12000000 | |
Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) | Life Technologies | 15140122 | |
Recombinant mouse Wnt3a | R&D Systems | 1324-WN-500/CF | |
Rho-associated kinase (ROCK)inhibitor Y27632 | Sigma-Aldrich | Y0503-1MG | |
RPMI 1640 | Life Technologies | 21875 | |
Standard tube dispensing cassette | ThermoFisher | 24072670 | |
TWEEN 20 | Sigma-Aldrich | P9416 | |
VIAFLO 96 Electronic 96-channel pipette | Integra | 6001 | |
PBS, no calcium, no magnesium | ThermoFisher | 14190250 | |
Formaldehyde solution 4%, buffered, pH 6.9 | Sigma-Aldrich | 1.00496 EMD MILLIPORE | |
P450-Glo CYP3A4 Assay and Screening System | Promega | V8801 | |
P450-Glo CYP1A2 Assay and Screening System | Promega | V8771 | |
DAPI | Invitrogen | D1306 | |
Antibodies | |||
Albumin | Sigma-Aldrich | A6684 | 1:200 (mouse) |
Alpha-fetoprotein | Abcam | ab3980 | 1:500 (mouse) |
CYP2D6 | University of Dundee | University of Dundee | 1:200 (sheep) |
CYP3A4 | University of Dundee | University of Dundee | 1:200 (sheep) |
HNF-4α | Santa Cruz | sc-8987 | 1:400 (rabbit) |
E-cadherin | Abcam | ab76055 | 1:200 (mouse) |
IgG | DAKO | 1:400 | |
Anti-Mouse 488 (secondary antibody) | Life technologies | A-11001 | 1:400 |
Anti-sheep 488 (secondary antibody) | Life technologies | A-11015 | 1:400 |
Anti-rabbit 488 (secondary antibody) | Life technologies | A-11008 | 1:400 |