Summary
Dieses Protokoll beschreibt einen halbautomatischen Ansatz um Hepatozyten-wie Zellen aus menschlichen pluripotenten Stammzellen in einem 96-well-Plattenformat zu produzieren. Dieser Prozess ist schnell und kostengünstig, so dass die Herstellung von hochwertigen Chargen von Hepatozyten-ähnliche Zellen für Grundlagen- und angewandte Forschung am Menschen versichert.
Abstract
Menschlicher pluripotenter Stammzellen stellen eine erneuerbare Energiequelle des menschlichen Gewebes. Unsere Forschung konzentriert sich auf die Erzeugung von menschlichen Lebergewebe aus humanen embryonalen Stammzellen (HES) und induzierte pluripotente Stammzellen (iPSCs). Aktuellen Differenzierung Verfahren generieren menschliche Hepatozyten-ähnliche Zellen (GLT) eine Mischung von fetalen und adulten Eigenschaften anzeigen. Zur Verbesserung der Zelle Phänotyp haben wir vollständig definiert unsere Differenzierung-Verfahren und die Zelle Nische, was bei der Erzeugung von Zell-Populationen, die verbesserte gen-Expression und Funktion anzeigen. Während dieser Studien Fortschritt, wurde die Fähigkeit, große Mengen von Multi-well-Platten für das Screening von Arbeitskräften intensive Verfahren und Variation von Charge zu Charge beschränkt. Um dieses Problem zu lösen, haben wir eine halbautomatische Plattform um pluripotente Stammzellen in GLT. Stem Cell seeding differenzieren und Differenzierung wurden mit liquid Handling und automatischen Pipettier-Systemen in 96-Well-Plattenformat durchgeführt. Im Anschluss an die Differenzierung war Zelle Phänotyp mit automatisierte Mikroskopie und ein Multi gut Luminometer analysiert.
Introduction
Primären humanen Hepatozyten (PHHs) entsprechen dem aktuellen Stand für die Leber biomedizinische Forschung. Trotz ihrer Vorteile darstellen PHHs eine begrenzte Quelle von Reifen Hepatozyten mit instabilen Phänotyp1. Humanen embryonalen Stammzellen (WSR) und menschliche induzierte pluripotente Stammzellen (iPSC) wurden als eine leistungsfähige Ressource für die biomedizinische Forschung, verspricht eine erneuerbare Energiequelle des menschlichen Gewebes, einschließlich Leber,2,3,4 vorgeschlagen . Aktuelle Hepatozyten Differenzierung Verfahren generieren Zellen, die Hepatozyten Marker, Gene und ähnliche PHHs3,4,5,6,7Funktionen ausdrücken, 8,9,10,11. Vor kurzem hat die Verwendung von definierten Materialien und Matrizen z. B. rekombinante Laminins, verbesserte Zelle Phänotyp und experimentelle Reproduzierbarkeit5,12,13,14.
Traditionellen Zelle Kulturtechniken beruhen stark auf manuelle pipettieren, das ist zeitaufwändig und fehleranfällig. Dies schränkt den Durchsatz der Test und das Plattenformat, mit denen man zusammenarbeiten kann. Bis heute sind die meisten Studien beschreiben die Generation der GLT arbeitsintensiv in der Natur und daher klein in Größe15,16,17.
Aktuelle Fortschritte in der Handhabung von Flüssigkeiten und pipettieren Systeme in Kombination mit automatisierten Mikroskopie und Labor-Analysatoren, haben es möglich gemacht, Verfahren zu entwickeln, die die Voraussetzung für menschliche Eingriffe zu minimieren. Wir haben diese Technologien zunutze gemacht und entwickelt eine halbautomatische Differenzierung-System, um große Mengen von menschlichen Lebergewebe für Basic und angewandten biomedizinischen Forschung. Dieser Ansatz kann mit menschlichen ESC und iPSC-Linien mit geringfügigen Anpassungen erforderlich, abhängig von der Zell-Linie durchgeführt werden. Kombinieren dieses System mit hoher Inhaltsanalyse, zeigen wir, dass HLC Phänotypisierung weniger zeitaufwendig und in Skala18,19,20,21durchgeführt werden kann.
Zusammenfassend hat die Automatisierung der Zelle Kulturtechniken, die hierin beschriebenen in Zuverlässigkeit, experimentelle Zeitmanagement und Assay-Durchsatz zu Verbesserungen geführt.
Protocol
(1) seeding humanen pluripotenten Stammzellen (hPSCs) in 96 auch Platten für Hepatozyten Differenzierung
Hinweis: Reagenzien und Geräte, die in diesem Protokoll verwendeten hat wurde in Tabelle 1aufgeführten. Für dieses Experiment verwendete Medien sind steril und bei Raumtemperatur für die Zellkultur. Alle Reagenzlösung/Volumes in diesem Teil des Protokolls beschriebenen basieren auf einem einzigen Brunnen einer 96-Well-Platte, sofern nicht anders angegeben.
-
Bereiten Sie Laminin 96-well-Platten beschichtet.
- Tauen Sie ein Fläschchen mit rekombinanten Laminin 521 (100 µg/mL) (LN-521) für 2 h bei 4 ° c über Nacht
- Bereiten Sie eine 5 µg/mL Lösung durch Verdünnung LN-521 im eiskalten 1 x Dulbeccos Phosphat-gepufferte Kochsalzlösung (DPBS) (mit Ca2 +/Mg2 +).
- Verwenden Sie eine automatische Flüssigkeit Umgang mit Dispenser mit einem Standardrohr Verzicht auf Kassette, 50 µL der LN-521-Lösung pro Bohrloch einer 96-well-Platte hinzuzufügen.
Hinweis: Alle Volumen verzichtet werden durchgeführt mit einer automatischen Handhabung von Flüssigkeiten-Dispenser mit einem Standardrohr Abgabe Kassette, sofern nicht anders angegeben. Prime die Lösung bis zum Abgabe der Kassette Ende, dann gehen Sie zu verzichten. Durch den Vorgang so oft wie nötig wiederholen, können mehrere 96-well-Platten im gleichen Experiment vorbereitet werden. - Inkubieren Sie die LN521-beschichtete Platten bei 37 °C/5% CO2 für 2 bis 4 h.
Hinweis: LN521-beschichteten Platten können bis zu zwei Wochen bei 4 ° c gelagert werden Halten Sie die Platten versiegelt auf einer flachen Oberfläche, Verdunstung und Kontamination zu vermeiden.
- Wärmen Sie die erforderliche Anzahl von vorbeschichtete Platten bei 37 ° C für 30 min bis 1 h.
- Aspirieren Sie die restliche LN-521-Lösung der beschichteten Oberfläche mit einem 8-Kanal-Aspiration-Adapter.
Hinweis: Es ist entscheidend für jede Berührung mit der beschichteten Oberfläche, Beschichtung Verschlechterung zu vermeiden. - Sofort fügen Sie 50 µL pro Bohrloch des mTeSR1 Mediums mit 10 µM Rho-assoziierten Kinase (ROCK)-Inhibitor Y27632 ergänzt hinzu und die Platte im Inkubator bis Zelle Aussaat bei 37 °C/5% CO2.
Hinweis: Lassen Sie nicht die Laminin-beschichtete Brunnen trocken. -
Bereiten Sie eine Zellsuspension von 3 x 105 Zellen/mL in mTeSR1 Medium mit 10 µM ROCK Inhibitor Y27632 ergänzt.
Hinweis: Die Aussaatdichte für jede Zelllinie erfordert Optimierung.- Aspirieren Sie das Medium aus einer Petrischale mit einem undifferenzierten Kultur der hPSCs bei etwa 75 % bis 85 % Konfluenz kultiviert auf LN-521 wie oben beschrieben12.
Hinweis: hPSCs sind kultiviert auf LN-521 in mTSER1 mit dem Medium verändert alle 24 h, und passagiert regelmäßig, sobald die Zellen 80 % Konfluenz wie zuvor beschrieben12erreichen. - Waschen Sie die Zellen mit 5 mL der Raumtemperatur 1 X DPBS (ohne Ca2 +/Mg2 +) und aufziehen der Puffer.
- Die Zellen 5 mL 1 x sanfte Zelle Dissoziation Reagenz hinzu und Inkubation bei 37 ° C für 6 bis 8 min für Zelle Dissoziation.
Hinweis: Um die Reaktion zu stoppen, untersuchen Sie die Loslösung der Zellen von der Matrix unter dem Mikroskop. Die Zellen sollten teilweise von der Platte abgenommen werden. Ist dies nicht der Fall, die Inkubation für eine zusätzliche 1 bis 2 Minuten zu verlängern. - Kündigen Sie die Reaktion durch Absaugen der sanften Zelle Dissoziation Reagenz und 5 mL frische mTeSR1 Medium mit 10 µM-ROCK-Inhibitor Y27632 zu den Zellen ergänzt. Verwenden Sie einen Zelle Schaber, heben Sie die Zellen aus der Matrix und Pipette nach oben und unten mit einer P1000 Spitze mehrmals zu mischen.
- Zählen Sie die lebensfähigen Zellen unter Verwendung einer Hemocytometer basierend auf Trypan Blau Färbung Ausschluss-Methode und bereiten Sie die Zellsuspension mit erforderlichen Konzentrationen.
- Die gewünschte Anzahl der Zellen in einem sterilen Zentrifugenröhrchen 15 mL oder 50 mL Pipette und spin-down der Zellen durch Zentrifugieren sie 115 X g für 5 min bei Raumtemperatur.
Hinweis: Für eine 96-well-Platte ist 5 mL mTeSR1 3 x 105 Zellen/mL-haltigem Medium für die Zelllinie H9 erforderlich. - Den überstand abgesaugt und sanft Aufschwemmen der Zelle Pellet, bis eine homogene Lösung bei 37 ° C in mTeSR1 Medium ergänzt mit 10 µM ROCK Inhibitor Y27632 erreicht ist.
Hinweis: Die Verwendung von ROCK-Inhibitor wird empfohlen, da es Zelle überleben Post wieder Beschichtung verbessert.
- Aspirieren Sie das Medium aus einer Petrischale mit einem undifferenzierten Kultur der hPSCs bei etwa 75 % bis 85 % Konfluenz kultiviert auf LN-521 wie oben beschrieben12.
- Fügen Sie 50 µL Zellsuspension auf die 96 well-Platte mit 50 µL der mTeSR1 mit 10 µM ROCK Inhibitor Y27632.
- Nach der Aussaat, die Platten zurück in die Zelle Inkubator bei 37 °C/5% CO2 für 24 h, damit die Zellen legen.
- Untersuchen Sie am nächsten Tag die Zellen zu und zurückzuziehen Sie ROCK-Inhibitor, sobald die Zelle zu Zelle Kontakt hergestellt wurde. Bei 40 % Konfluenz wechseln Sie zur Differenzierung Medium (Abbildung 1 b).
Hinweis: Wenn Zelle Konfluenz 40 % übersteigt, sind die Platten nicht für HLC Differenzierung mit der Zelllinie H9 geeignet.
(2) Differenzierung hPSCs Hepatozyten-ähnliche Zellen auf rekombinante Laminins in 96 auch Platten
-
Bereiten Sie die Differenzierung Mittel- und Wachstums-Faktoren.
- Bereiten Sie menschliche Activin A-Stammlösung (100 µg/mL) durch menschliche Activin A Pulver in sterilen 0,2 % Rinderserumalbumin (BSA) in gepufferter Kochsalzlösung auflösen. Aliquot der Lager und laden bei-20 ° C. Verwenden Sie 1:1 000.
- Bereiten Sie Maus Wnt3a Stammlösung (10 µg/mL vor) durch Auflösen der Maus Wnt3a Pulver in sterilen 0,2 % BSA. Aliquot der Lager und laden bei-20 ° C. Verwenden Sie bei 1: 200.
- Bereiten Sie menschliche Hepatozyten-Wachstumsfaktor (HGF) Stammlösung (10 µg/mL) durch menschliche HGF-Pulver in sterilen 0,2 % BSA auflösen. Aliquot der Lager und laden bei-20 ° C. Verwenden Sie bei 1: 1000.
- Bereiten Sie Oncostatin M (OSM)-Stammlösung (20 µg/mL) durch Auflösen des Pulvers in sterilen 0,2 % BSA. Aliquot der Lager und laden bei-20 ° C. Verwenden Sie 1:1 000.
- Definitive Entoderm: bereiten Sie Entoderm Differenzierung Medium, bestehend aus 2 % B27 Ergänzung (50 X, ohne Insulin), 1 % Penicillin/Streptomycin (Endkonzentrationen: 100 IE/mL und 100 µg/mL, bzw.) hinzugefügt, um Roswell Park Memorial Institute 1640 ( RPMI 1640) basale Medium. Bei 4 ° C lagern und innerhalb von zwei Wochen zu verwenden. Ergänzen Sie bei jedem mittleren Wechsel sich das erforderliche Volumen mit Activin A und Wnt3a bei Endkonzentration von 100 ng/mL und 50 ng/mL, beziehungsweise.
- Hepatoblast Differenzierung: bereiten Sie Hepatoblast Differenzierung Medium, bestehend aus 20 % ko-Serum Ersatz (KSR), 0,5 % eine Alternative Ergänzung zu L-Glutamin, 1 % nicht-essentiellen Aminosäuren (NEAA), 0,1 mM Beta-Mercaptoethanol, 1 % DMSO und 1 % Penicillin/Streptomycin (Endkonzentrationen bei 100 IE/mL und 100 µg/mL, beziehungsweise), Ko DMEM (KO-DMEM) hinzugefügt. Unter Vakuum zu filtern und Lagerung bei 4 ° C. Verwenden Sie innerhalb von zwei Wochen.
- Hepatozyten Differenzierung: Vorbereiten der Hepatozyten Differenzierung Medium, bestehend aus 1 % eine Alternative Ergänzung zu L-Glutamin, 10 µM Hydrocortison-21-Hemisuccinate Natriumsalz (HCC), 1 % Penicillin/Streptomycin (Endkonzentrationen bei 100 IE/mL und 100 µg/mL, beziehungsweise), HepatoZYME Medium hinzugefügt. Die Aktie bei 4 ° C lagern und innerhalb von zwei Wochen. Für jede mittlere Änderung ergänzen das erforderliche Volumen mit HGF und OSM (Endkonzentrationen bei 10 ng/mL und 20 ng/mL, beziehungsweise).
- 24 h Post Aussaat, sorgfältig entfernen das Medium über eine automatische tragbare elektronische Pipette Kanalsystem und 100 µL der frischen Entoderm-Priming-Medium mit 100 ng/mL Activin A und 50 ng/mL Wnt3a ergänzt.
Hinweis: Der Differenzierungsprozess beginnt, sobald die endgültigen Entoderm Medium hinzugefügt wurde. Wenn Zelle Aussaat optimiert ist, ist die zellulare Unterscheidung normalerweise innerhalb von 24 h initiiert. Alle Änderungen erfolgen durch das Medium mit einer automatischen Handheld elektronische Pipette Kanalsystem entfernen und Verzicht auf frisches Medium einen Standard ein automatisches liquid Handling-Dispenser mit 100 µL Medium tube Abgabe Kassette, sofern nichts anderes angegeben. Eine automatische tragbare elektronische Pipette Kanalsystem wurde mit 96 auch Kopf, mit 300 µL-Spitzen verwendet. Kurz gesagt, 90 µL wurden von der gut vermeiden jeglichen Kontakt mit den Zellen abgesaugt, und es ist wichtig, nicht die Zellen während der mittlere Änderung zur Verringerung der Belastung der Zelle zu trocknen. - Für humane embryonale Stammzellen (hESC) ändern Sie das Entoderm Differenzierung Medium täglich für drei Tage. Erfolgt die Differenzierung für menschlichen induzierten pluripotenten Stammzellen (HiPSCs), verlängern Sie die definitive Entoderm Bühne für 2 Tage mit Activin A nur.
- Nach der endgültigen Entoderm Induktion wechseln Sie zu KSR/DMSO-Medium für die Hepatoblast-Spezifikation und verändern Sie alle 2 Tage für 5 Tage das Medium.
Hinweis: Gibt es eine Reihe von fraktionslosen Zellen in den Brunnen, verwenden Sie nicht ergänzt KO-DMEM, um die Zellen einmal vor der nächsten mittlere Änderung zu waschen. Aufgrund der Dauer der zweiten Stufe des Protokolls (5 Tage) werden 3 mittlere Veränderungen mit dem letzten am letzten Tag der Hepatoblast Spezifikation. - Im Anschluss an die Hepatoblast Differenzierung wechseln Sie zu HepatoZYME Medium für Hepatozyten Reifung. Waschen Sie die Zellen einmal mit HepatoZYME ohne Zuschlag nach dem Entfernen der KSR/DMSO-Medium und 100 µL der HepatoZYME Reifung Medium mit 10 ng/mL HGF und 20 ng/mL OSM ergänzt.
- Ändern Sie das Medium alle 48 h für 7 bis 10 Tage. Am 18. Tag der Differenzierung charakterisieren GLT durch Analyse der Genexpression und CYP P450 Stoffwechselaktivität.
3. Charakterisierung von Hepatozyten-ähnliche Zellen differenziert auf rekombinante Laminins
- Den Ausdruck von Hepatozyten-spezifische Marker und Polarisation Marker mit Immunostaining zu erkennen.
- Testen Sie Hepatozyten metabolische Funktion mit CYP P450-Assays, wie vor12beschrieben.
- Bestimmen Sie die Platte Variation, zählen die Gesamtzahl der Zellen pro Bohrloch pro Platte.
4. hohe Durchsatz Immunocytochemistry und Bildaufnahme
- Am Tag 18 der Differenzierung waschen Sie die Brunnen dreimal mit 1 X DPBS, beheben Sie die GLT durch Abgabe 50 µL 4 % Paraformaldehyd (PFA) und bei Raumtemperatur 15 bis 30 min inkubieren. Nach der Fixierung, dreimal mit PBST waschen (0,1 % Tween) (ohne Ca2 +/Mg2 +) mit einer automatischen Platte Scheibe.
Hinweis: Alle Wäschen in diesem Abschnitt erfolgt über eine automatische Platte-Waschmaschine, sofern nicht anders angegeben. Alle Wäschen erfolgt nach dem gleichen Protokoll. - Permeabilize der Membran durch Abgabe 100 µL PBST (ohne Ca2 +/Mg2 +) und 20 min bei Raumtemperatur inkubieren. Als nächstes führen Sie das Protein blockieren durch Abgabe 100 µL 10 % BSA in PBST und Inkubation für 1 h in Sanftes Schütteln mit einem Teller Shaker. Fügen Sie nach Protein blockieren 50 µL 1 % BSA in PBST, der primäre Antikörper enthält hinzu, bei 4 ° C inkubieren Sie über Nacht mit sanft schütteln mit einem Teller Shaker.
Hinweis: Waschen Sie nicht zwischen Protein Block und Antikörper-Ergänzung. - Waschen Sie nach 24 Stunden dreimal, mit 1 X DPBS (ohne Ca2 +/Mg2 +) und fügen Sie den sekundären Antikörper durch Abgabe 50 µL 1 % BSA in PBST. Inkubieren Sie 1 h bei Raumtemperatur im Dunkeln.
- Waschen Sie 3 Mal nach der Sekundärantikörper Inkubation mit 1 X DPBS. Fügen Sie 50 µL des DPBS mit DAPI (10 µg/mL) und 5 – 10 min bei Raumtemperatur im Dunkeln inkubieren.
- Schließlich waschen Sie 3 Mal mit DPBS und 100 µL 1 X DPBS in den Brunnen. Platten sind bereit für die Bildgebung.
Hinweis: Platten sollte bis Bildgebung bei 4 ° C im Dunkeln gelagert werden. - Bild der Plattenrandes durch den Einsatz eines High-Content imaging Systems, und erwerben mehrere Felder über den Brunnen, eine gute Darstellung des Brunnens zu erhalten. Den Ausdruck der verschiedenen Marker in der GLT mit Columbus Software (High-Content Imaging System Analysesoftware) zu quantifizieren.
Hinweis: Columbus ist eine hohe Content-Analyse-Software, die Segmentierung Analyse der Zelle für Zelle Phänotypisierung bietet. Ähnliche Ergebnisse können erreicht werden, mithilfe von CellProfiler, eine Open Source Software für die Quantitative Analyse von biologischen Bilder22.
Representative Results
Zelldifferenzierung erfolgte mittels einer embryonalen Stammzellen-Linie (H9). Die halbautomatische Plattform wurde verwendet, um zu unterscheiden und zu charakterisieren, die Zellen (Abbildung 1A). Ein automatisches liquid Handling-Dispenser wurde zur Matrix Mantel und Samen einzelne Zellen. Zellulare Unterscheidung wurde eingeleitet, wenn die Zellen 40 % Konfluenz (Tag 0) erreicht. Medien-Änderungen wurden mit eine automatische tragbare elektronische Pipette Kanalsystem entfernen Medium und die Handhabung von Flüssigkeiten-Dispenser für mittlere Zusatz (Abbildung 1A) durchgeführt. Zelle Fixierung und Färbung wurden mit der automatischen Handhabung von Flüssigkeiten-Dispenser in Kombination mit der automatischen Platte Scheibe durchgeführt. Bildgebung und Quantifizierung wurden mithilfe eines High-Content-imaging-System und Columbus Software durchgeführt. Cytochrom P450 Aktivität wurde mit einem etablierten Assay gemessen. Nach substratinkubation Zelle Überstände geerntet wurden und Biolumineszenz aufgezeichnet mit einem multimode Mikrotestplatte Reader (Abbildung 1A). Darüber hinaus war konventionellen Phasenkontrastmikroskopie verwendet, um die Veränderungen der Zellmorphologie während Hepatozyten Differenzierung (Abbildung 1 b) messen.
Am Tag 18 war die Variabilität der Zellzahl zwischen Brunnen nach DAPI-Färbung (Abbildung 2A) untersucht. Sieben Sichtfelder wurden pro Brunnen und die Anzahl der Nukleonen quantifiziert (Abbildung 2A) erfasst. Wir haben keine statistischen Unterschiede zwischen den Brunnen mit einem Durchschnitt von 41.662 ±3 366 Zellen pro Bohrloch (Abb. 2 b) festgestellt.
Am 18. Tag wurden GLT behoben und gebeizt für typische Hepatozyten Marker (Abbildung 3A-G) und für CYP P450 Aktivität getestet. GLT ausgedrückt Hepatozyten Marker wie HNF4α (89,2 % ±2 positive Zellen), ALB (92,8 % ±6 positive Zellen), AFP (61,8 % ±2 positive Zellen). GLT auch CYP P450-Proteine, CYP2D6 und CYP3A4 ausgedrückt und eine eigene polygonale Darstellung angezeigt, dargestellt durch E-Cadherin-Protein-Expression. GLT CYP P450 Aktivität war am 18. Tag gemessen. GLT ausgestellt CYP1A2-Aktivität bei 295.906 ±45, 828 RLU/mL/mg Protein und CYP3A bei 1.066.112 ±177, 416 RLU/mL/mg Protein (Abbildung 3 H).
Abbildung 1: Hepatozyten Differenzierung von EAP in der 96 gut formatieren. (A). schematische Darstellung der Ausrüstung verwendet, um zellulare Unterscheidung Semi automatisieren, Fixierung, Färbung, imaging und funktionelle Aktivität. (B). Vertreter ändert in zellulären Morphologie bei HLC Differenzierung. Kurz gesagt, sind EAP zur endgültigen Entoderm, gefolgt von Hepatoblast Spezifikation gekennzeichnet durch Zellen anzeigen Kopfsteinpflaster-ähnliche Morphologie und vor der Hepatozyten Reifung mit Zellen, die polygonale Form zu erwerben grundiert. Maßstabsleiste = 100 µm. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 2: Beurteilung der GLT-Brunnen-Brunnen-Variabilität. (A) Darstellung der 96 Platte gut Ansicht der GLT mit DAPI gefärbt. Maßstabsleiste = 1 mm. (B) Quantifizierung der Zellzahl pro Bohrloch. Durchschnitt der Zellzahl pro Brunnen in Spalten (oben) und Zeilen (unten), aus sieben Bereichen Views pro gut und quantifizierte mit Columbus-Software. Durchschnittliche Handynummer über die Platte ist 41.662 ± 3.366 SEM Zellen pro Bohrloch. Keine statistisch signifikanten Unterschiede wurden zwischen Wells beobachtet. Ein One-Way ANOVA mit Tukey Post-hoc-statistische Tests arbeitete. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 3: Hepatozyten Marker Ausdruck und CYP P450 Aktivitätsmessung in GLT am Tag 18. (A) der Anteil der Hepatozyten nuklearer Faktor 4 Alpha (HNF4α) Ausdruck ± SEM basiert auf dreißig Brunnen mit zehn Gesichtsfelder pro Bohrloch. (B) der Anteil von Albumin (ALB) Ausdruck + / SEM, basiert auf 3 separate Brunnen mit zehn Gesichtsfelder pro Bohrloch. (C) der Anteil der alpha-Fetoprotein (AFP) + / SEM basiert auf 3 separate Brunnen mit zehn Gesichtsfelder pro Bohrloch. (D) E-Cadherin Färbung. (E) CYP2D6 Färbung. (F) CYP3A4 Färbung. (G). Immunglobulin G (IgG) Färbung Kontrolle. Maßstabsleiste = 50 µm. (H) CYP P450 1A2 und 3A Stoffwechselaktivität in GLT am 18. Tag. Die Daten stellt sechs biologische + / SEM Aktivität repliziert wird relative leichte Einheiten (RLUs) /mL pro 1 mg Protein zitiert. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Discussion
Unsere halbautomatische Verfahren ist effizient, zuverlässig und wirtschaftlich, so dass die Produktion von GLT im Maßstab (Abbildung 1). Nicht gab es keinen signifikanten Unterschied in Bezug auf die Anzahl der Zellen zwischen den Brunnen in der Platte, so dass diese Plattform einen geeigneten Ansatz für zellbasierte Screening (Abbildung 2). Darüber hinaus ermöglicht die Teilautomatisierung Workflow dem Benutzer, große Anzahl von Platten auf einmal zu produzieren, was vor der Verwendung manueller Prozesse5,12nicht möglich war.
Wichtig ist, der Automatisierungsprozess keinen Einfluss auf Differenzierung Erträge mit der Mehrheit der Zellen mit dem Ausdruck HNF4α (89,2 % ±2) und ALB (92,8 % ±6) (Abbildung 3). GLT auch ausgedrückt CYP P450-Enzyme CYP2D6 und CYP3A4 und CYP1A2 und CYP3A metabolische Aktivität vergleichbar mit früheren gemeldeten Experimente (Abbildung 3)5angezeigt. Trotz der Standardisierung des Protokolls ist Zelle Konfluenz vor der Differenzierung für reine HLC Differenzierung von entscheidender Bedeutung. Gewährleisten eine gute Zelle Verteilung über dem Brunnen ist daher ein wichtiger Aspekt (Abbildung 1). Dies erweist sich als um Zelllinie angewiesen zu sein, daher Zelle seeding und Dichte Optimierung ist erforderlich für jede Zelle Zeile vor dem Skalieren.
In seiner jetzigen Form dieser Plattform ist nicht geeignet, große Mengen an GLT für klinische Anwendungen zu produzieren, und dies wird wahrscheinlich durch den Einsatz von Zellfabriken und Bioreaktoren erreicht werden. Allerdings erlaubt die entwickelte Methodik für die schnelle Erzeugung von menschlichen Leberzellen für Krankheit Modellierung, Drogen-Screening und/oder Drug repurposing Studien. Darüber hinaus ist der Test zu Multiplexen, erlaubt die Erzeugung von multiparametric Datasets für mechanistische Analyse. Geht nach vorn, glauben wir auch, dass diese Technologie auf komplexer in-vitro- Systemen wie 3D Differenzierung oder als Plattform zur Verbesserung der HLC Phänotyp in Vitroangewandt werden könnte.
Zusammenfassend glauben wir, dass unser einfaches und halbautomatische System experimentelle Durchsatz zu erhöhen und verringern experimentelle Variante, dadurch Verbesserung der Qualität der biologischen Datasets und ihre Extrapolation in Richtung der menschlichen Physiologie.
Disclosures
Prof. David C. Hay ist Mitbegründer und Vorstandsmitglied von Stemnovate Limited.
Prof. David C. Hay ist ein Vorstandsmitglied von HigherSteaks Limited.
Acknowledgments
Diese Arbeit wurde mit Auszeichnungen aus dem Hauptamt Office (TCS/16/37) und ein Promotionsstipendium MRC unterstützt.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 405 LS Washer | Biotek | ||
| B27 supplement | Life Technologies | 12587-010 | |
| beta-mercaptoethanol | Life Technologies | 31350 | |
| Bovine Serum Albumin | Sigma-Aldrich | A2058 | |
| DMSO | Sigma-Aldrich | D5879 | |
| DPBS with Calcium and Magnesium | ThermoFisher | 14040133 | |
| Gentle cell dissociation reagent | STEMCELL Technologies | 7174 | |
| GlutaMax | Life Technologies | 35050 | |
| GripTips for VIAFLO 96 | Integra | 6434 | |
| HepatoZYME-SFM | Life Technologies | 17705021 | |
| Human Activin A | Peprotech | 120-14E | |
| Human Hepatocyte Growth Factor | Peprotech | 100-39 | |
| Human Oncostatin M | Peprotech | 300-10 | |
| Human Recombinant Laminin 521 | BioLamina | LN521-02 | |
| Hydrocortisone 21-hemisuccinate sodium salt | Sigma-Aldrich | H4881 | |
| Knockout DMEM | Life Technologies | 10829 | |
| Knockout Serum Replacement | Life Technologies | 10828 | |
| mTeSR1 medium | STEMCELL Technologies | 5850 | |
| MultidropCombi Reagent Dispenser | ThermoFisher | 5840300 | |
| Non-essential amino acids | Life Technologies | 11140 | |
| Operetta High-Content Imaging System | PerkinElmer | HH12000000 | |
| Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) | Life Technologies | 15140122 | |
| Recombinant mouse Wnt3a | R&D Systems | 1324-WN-500/CF | |
| Rho-associated kinase (ROCK)inhibitor Y27632 | Sigma-Aldrich | Y0503-1MG | |
| RPMI 1640 | Life Technologies | 21875 | |
| Standard tube dispensing cassette | ThermoFisher | 24072670 | |
| TWEEN 20 | Sigma-Aldrich | P9416 | |
| VIAFLO 96 Electronic 96-channel pipette | Integra | 6001 | |
| PBS, no calcium, no magnesium | ThermoFisher | 14190250 | |
| Formaldehyde solution 4%, buffered, pH 6.9 | Sigma-Aldrich | 1.00496 EMD MILLIPORE | |
| P450-Glo CYP3A4 Assay and Screening System | Promega | V8801 | |
| P450-Glo CYP1A2 Assay and Screening System | Promega | V8771 | |
| DAPI | Invitrogen | D1306 | |
| Antibodies | |||
| Albumin | Sigma-Aldrich | A6684 | 1:200 (mouse) |
| Alpha-fetoprotein | Abcam | ab3980 | 1:500 (mouse) |
| CYP2D6 | University of Dundee | University of Dundee | 1:200 (sheep) |
| CYP3A4 | University of Dundee | University of Dundee | 1:200 (sheep) |
| HNF-4α | Santa Cruz | sc-8987 | 1:400 (rabbit) |
| E-cadherin | Abcam | ab76055 | 1:200 (mouse) |
| IgG | DAKO | 1:400 | |
| Anti-Mouse 488 (secondary antibody) | Life technologies | A-11001 | 1:400 |
| Anti-sheep 488 (secondary antibody) | Life technologies | A-11015 | 1:400 |
| Anti-rabbit 488 (secondary antibody) | Life technologies | A-11008 | 1:400 |
References
- Forbes, S. J., Gupta, S., Dhawan, A. Cell therapy for liver disease: From liver transplantation to cell factory. J Hepatol. 62 (1, Supplement), S157-S169 (2015).
- Avior, Y., Sagi, I., Benvenisty, N. Pluripotent stem cells in disease modelling and drug discovery. Nat Rev Mol Cell Biol. 17 (3), 170-182 (2016).
- Szkolnicka, D., Lucendo-Villarin, B., Moore, J. K., Simpson, K. J., Forbes, S. J., Hay, D. C. Reducing Hepatocyte Injury and Necrosis in Response to Paracetamol Using Noncoding RNAs. Stem Cells Transl Med. 5 (6), 764-772 (2016).
- Choudhury, Y., et al. Patient-specific hepatocyte-like cells derived from induced pluripotent stem cells model pazopanib-mediated hepatotoxicity. Sci Rep. 7, 41238 (2017).
- Cameron, K., et al. Recombinant Laminins Drive the Differentiation and Self-Organization of hESC-Derived Hepatocytes. Stem Cell Rep. 5 (6), 1250-1262 (2015).
- Cayo, M. A., et al. A Drug Screen using Human iPSC-Derived Hepatocyte-like Cells Reveals Cardiac Glycosides as a Potential Treatment for Hypercholesterolemia. Cell Stem Cell. 20 (4), 478-489 (2017).
- Takayama, K., et al. Prediction of interindividual differences in hepatic functions and drug sensitivity by using human iPS-derived hepatocytes. Proc Natl Acad Sci U S A. 111 (47), 16772-16777 (2014).
- Takayama, K., et al. 3D spheroid culture of hESC/hiPSC-derived hepatocyte-like cells for drug toxicity testing. Biomaterials. 34 (7), 1781-1789 (2013).
- Hay, D. C., et al. Efficient differentiation of hepatocytes from human embryonic stem cells exhibiting markers recapitulating liver development in vivo. Stem Cells Dayt Ohio. 26 (4), 894-902 (2008).
- Iii, R. L. G., et al. Maturation of Induced Pluripotent Stem Cell Derived Hepatocytes by 3D-Culture. PLOS ONE. 9 (1), e86372 (2014).
- Chen, Y. -F., Tseng, C. -Y., Wang, H. -W., Kuo, H. -C., Yang, V. W., Lee, O. K. Rapid generation of mature hepatocyte-like cells from human induced pluripotent stem cells by an efficient three-step protocol. Hepatol Baltim Md. 55 (4), 1193-1203 (2012).
- Wang, Y., et al. Defined and Scalable Generation of Hepatocyte-like Cells from Human Pluripotent Stem Cells. JoVE J Vis Exp. (121), e55355 (2017).
- Takayama, K., et al. Long-Term Self-Renewal of Human ES/iPS-Derived Hepatoblast-like Cells on Human Laminin 111-Coated Dishes. Stem Cell Rep. 1 (4), 322-335 (2013).
- Kanninen, L. K., et al. Laminin-511 and laminin-521-based matrices for efficient hepatic specification of human pluripotent stem cells. Biomaterials. , 86-100 (2016).
- Szkolnicka, D., et al. Accurate prediction of drug-induced liver injury using stem cell-derived populations. Stem Cells Transl Med. 3 (2), 141-148 (2014).
- Kim, D. E., et al. Prediction of drug-induced immune-mediated hepatotoxicity using hepatocyte-like cells derived from human embryonic stem cells. Toxicology. 387 (Supplement C), 1-9 (2017).
- Rashid, S. T., et al. Modeling inherited metabolic disorders of the liver using human induced pluripotent stem cells. J Clin Invest. 120 (9), 3127-3136 (2010).
- Grimm, F. A., Iwata, Y., Sirenko, O., Bittner, M., Rusyn, I. High-Content Assay Multiplexing for Toxicity Screening in Induced Pluripotent Stem Cell-Derived Cardiomyocytes and Hepatocytes. Assay Drug Dev Technol. 13 (9), 529-546 (2015).
- Bray, M. -A., et al. A dataset of images and morphological profiles of 30,000 small-molecule treatments using the Cell Painting assay. GigaScience. , (2017).
- Pradip, A., et al. High Content Analysis of Human Pluripotent Stem Cell Derived Hepatocytes Reveals Drug Induced Steatosis and Phospholipidosis. Stem Cells Int. 2016, 2475631 (2016).
- Donato, M. T., Gómez-Lechón, M. J., Tolosa, L. Using high-content screening technology for studying drug-induced hepatotoxicity in preclinical studies. Expert Opin Drug Discov. 12 (2), 201-211 (2017).
- Carpenter, A. E., et al. CellProfiler: image analysis software for identifying and quantifying cell phenotypes. Genome Biol. 7, R100 (2006).
