Det här protokollet beskriver en halvautomatisk strategi för att producera hepatocyte-liknande celler från mänskliga pluripotenta stamceller i en 96 väl platta format. Denna process är snabbt och kostnadseffektivt, vilket gör att produktionen av kvalitet försäkrade partier av hepatocyte-liknande celler för grundforskning och tillämpad mänsklig forskning.
Mänskliga pluripotenta stamceller utgör en förnybar källa av mänsklig vävnad. Vår forskning är inriktad på att generera human levervävnad från mänskliga embryonala stamceller (hESCs) och inducerade pluripotenta stamceller (iPSCs). Nuvarande differentiering förfaranden generera mänskliga hepatocyte-liknande celler (HLCs) visar en blandning av fostrets och vuxna drag. För att förbättra cell fenotyp, har vi fullt definierat vår differentiering förfarandet och den cell-nischen, vilket resulterar i generationen av cellpopulationer som visar förbättrad genernas uttryck och funktion. Medan dessa studier Markera framsteg, har förmågan att generera stora mängder multi plattor för screening begränsats av arbetskraft intensiv förfaranden och tillverkningssatserna variation. För att tackla problemet, har vi utvecklat en halvautomatisk plattform för att skilja pluripotenta stamceller in i HLCs. Stem cell sådd och differentiering utfördes med vätskehantering och automatiska pipettering system i plattan med 96 brunnar format. Efter differentieringen, cell fenotyp analyserades med hjälp av automatiserad mikroskopi och en multi väl luminometern.
Primära humana hepatocyter (PHHs) representerar den nuvarande standarden för levern biomedicinsk forskning. Trots sina fördelar representerar PHHs en begränsad mogen hepatocyter med instabila fenotyp1. Mänskliga embryonala stamceller (EKSG) och mänskliga inducerade pluripotenta stamceller (iPSC) har föreslagits som en kraftfull resurs för biomedicinsk forskning, lovande en förnybar källa av mänsklig vävnad, inklusive levern2,3,4 . Nuvarande förfaranden för differentiering av hepatocyte generera celler som uttrycker hepatocyte markörer, gener och liknande PHHs3,4,5,6,7, funktioner 8,9,10,11. Mer nyligen, har användningen av definierade material och matriser såsom rekombinant lamininer, förbättrad cell fenotyp och experimentell reproducerbarhet5,12,13,14.
Traditionella cell kultur tekniker är starkt beroende av manuell pipettering, som är både tidskrävande och felbenägen. Detta begränsar genomströmning av analysen och platta format man kan arbeta med. Hittills har är de flesta studier som beskriver generationen av HLCs arbetskrävande som i naturen och därför liten skala i storlek15,16,17.
Aktuella framsteg inom vätskehantering och pipettering system, i kombination med automatiserad mikroskopi och laboratorium analysatorerna, har gjort det möjligt att utveckla förfaranden som minimerar behovet av mänsklig inblandning. Vi har dragit nytta av dessa tekniker och utvecklat ett halvautomatiskt differentiering system att generera stora mängder human levervävnad för grundläggande och tillämpad biomedicinsk forskning. Denna metod kan utföras med både mänskliga ESC och iPSC linjer med mindre justeringar behövs, beroende på cellinje. Kombinera detta system med hög innehållsanalys, visar vi att HLC fenotypning kan vara mindre tidskrävande och utförs på skala18,19,20,21.
Sammanfattningsvis, har automatisering av cell kultur tekniker beskrivs häri lett till förbättringar i tillförlitlighet, experimentell tid förvaltning och analys genomströmning.
Våra halvautomatiska förfarandet är effektiva, pålitliga och ekonomiska, så att produktionen av HLCs på skalan (figur 1). Fanns det inte någon signifikant skillnad i termer av antalet celler mellan brunnar i plattan, vilket gör denna plattform en lämplig strategi för cellbaserade screening (figur 2). Dessutom användaren semi automation arbetsflödet kan producera ett stort antal plattor på en gång, vilket inte var möjligt innan du använder manuella processer5,12.
Ännu viktigare, den automatiserade processen inte inverkade på differentiering avkastning, med majoriteten av celler som uttrycker HNF4α (89,2% ±2) och ALB (92,8% ±6) (figur 3). HLCs också uttryckt CYP P450 enzymerna CYP2D6 och CYP3A4 och visas CYP1A2 och CYP3A metabolisk aktivitet jämföras med tidigare rapporterade experiment (figur 3)5. Trots standardiseringen av protokollet är cell konfluens före differentieringen kritiska för ren HLC differentiering. Säkerställa en bra cell fördelning över brunnen är därför en viktig faktor (figur 1). Detta har visat sig vara cellinje beroende, därför cell sådd och densitet optimering krävs för varje cell linje före skala upp.
Denna plattform är inte lämplig att producera stora mängder HLCs för kliniska tillämpningar i sin nuvarande form, och detta kommer sannolikt att uppnås med hjälp av cell fabriker och bioreaktorer. Dock tillåter den utvecklade metoden för snabb generering av mänskliga leverceller sjukdom modellering, drogkontroll och/eller narkotika återanvända studier. Analysen är dessutom mottagliga för multiplexering, tillåter generationen av multiparametric datamängder för mekanistiska analys. Framöver, tror vi också att denna teknik kan tillämpas till komplexare in vitro- system såsom 3D differentiering eller som en plattform för att förbättra HLC fenotyp i vitro.
Sammanfattningsvis anser vi att vårt enkla och halvautomatiskt system kommer att öka experimentella genomströmning och minska experimentell variation, därigenom förbättras kvaliteten biologiska datamängder och deras extrapolering mot människans fysiologi.
The authors have nothing to disclose.
Detta arbete stöds med utmärkelser från the Chief Scientist’s Office (TCS/16/37) och en MRC PhD stipendium.
405 LS Washer | Biotek | ||
B27 supplement | Life Technologies | 12587-010 | |
beta-mercaptoethanol | Life Technologies | 31350 | |
Bovine Serum Albumin | Sigma-Aldrich | A2058 | |
DMSO | Sigma-Aldrich | D5879 | |
DPBS with Calcium and Magnesium | ThermoFisher | 14040133 | |
Gentle cell dissociation reagent | STEMCELL Technologies | 7174 | |
GlutaMax | Life Technologies | 35050 | |
GripTips for VIAFLO 96 | Integra | 6434 | |
HepatoZYME-SFM | Life Technologies | 17705021 | |
Human Activin A | Peprotech | 120-14E | |
Human Hepatocyte Growth Factor | Peprotech | 100-39 | |
Human Oncostatin M | Peprotech | 300-10 | |
Human Recombinant Laminin 521 | BioLamina | LN521-02 | |
Hydrocortisone 21-hemisuccinate sodium salt | Sigma-Aldrich | H4881 | |
Knockout DMEM | Life Technologies | 10829 | |
Knockout Serum Replacement | Life Technologies | 10828 | |
mTeSR1 medium | STEMCELL Technologies | 5850 | |
MultidropCombi Reagent Dispenser | ThermoFisher | 5840300 | |
Non-essential amino acids | Life Technologies | 11140 | |
Operetta High-Content Imaging System | PerkinElmer | HH12000000 | |
Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) | Life Technologies | 15140122 | |
Recombinant mouse Wnt3a | R&D Systems | 1324-WN-500/CF | |
Rho-associated kinase (ROCK)inhibitor Y27632 | Sigma-Aldrich | Y0503-1MG | |
RPMI 1640 | Life Technologies | 21875 | |
Standard tube dispensing cassette | ThermoFisher | 24072670 | |
TWEEN 20 | Sigma-Aldrich | P9416 | |
VIAFLO 96 Electronic 96-channel pipette | Integra | 6001 | |
PBS, no calcium, no magnesium | ThermoFisher | 14190250 | |
Formaldehyde solution 4%, buffered, pH 6.9 | Sigma-Aldrich | 1.00496 EMD MILLIPORE | |
P450-Glo CYP3A4 Assay and Screening System | Promega | V8801 | |
P450-Glo CYP1A2 Assay and Screening System | Promega | V8771 | |
DAPI | Invitrogen | D1306 | |
Antibodies | |||
Albumin | Sigma-Aldrich | A6684 | 1:200 (mouse) |
Alpha-fetoprotein | Abcam | ab3980 | 1:500 (mouse) |
CYP2D6 | University of Dundee | University of Dundee | 1:200 (sheep) |
CYP3A4 | University of Dundee | University of Dundee | 1:200 (sheep) |
HNF-4α | Santa Cruz | sc-8987 | 1:400 (rabbit) |
E-cadherin | Abcam | ab76055 | 1:200 (mouse) |
IgG | DAKO | 1:400 | |
Anti-Mouse 488 (secondary antibody) | Life technologies | A-11001 | 1:400 |
Anti-sheep 488 (secondary antibody) | Life technologies | A-11015 | 1:400 |
Anti-rabbit 488 (secondary antibody) | Life technologies | A-11008 | 1:400 |