该协议描述了一种半自动化的方法, 从96井板格式的人类多潜能干细胞中产生肝样细胞。这一过程是快速和成本效益, 允许生产质量保证批次的肝细胞样干细胞的基础和应用人类研究。
人类多潜能干细胞代表着人类组织的可再生来源。我们的研究重点是从人类胚胎干细胞 (干细胞) 和诱导多潜能干细胞 (iPSCs) 中生成人肝组织。目前的分化过程产生的人肝细胞样细胞 (HLCs) 显示一个混合的胎儿和成人的特点。为了改善细胞的表型, 我们充分定义了我们的分化过程和细胞的利基, 导致细胞数量的生成, 显示改善的基因表达和功能。虽然这些研究标志着进展, 但能够产生大量的多井板进行筛查, 是有限的劳动密集型程序和批次的批次变化。为了解决这个问题, 我们开发了一个半自动的平台, 将多能干细胞分化为 HLCs. 采用液体处理和自动吹打系统进行96井板格式的干细胞播种和分化。在分化后, 采用全自动显微术和多井紫外线分析细胞表型。
原发性人肝细胞 (PHHs) 代表了目前肝脏生物医学研究的标准。尽管其优势, PHHs 代表一个有限的来源的成熟肝细胞与不稳定表型1。人类胚胎干细胞 (ESCs) 和人类诱导的多潜能干细胞 (iPSC) 被建议为生物医学研究的强大资源, 有望成为人类组织的可再生来源, 包括肝脏2、3、4.目前的肝细胞分化程序产生细胞, 表达肝细胞标记, 基因和功能类似 PHHs3,4,5,6,7, 8,9,10,11。最近, 使用定义的材料和矩阵, 如重组 laminins, 已改善细胞表型和实验再现性5,12,13,14。
传统的细胞培养技术严重依赖手工吹打, 既费时又容易出错。这限制了化验的吞吐量和你可以使用的平板格式。到目前为止, 大多数的研究描述 HLCs 的产生是劳动密集型的性质, 因此小规模在15,16,17。
现有的液体处理和吹打系统的进展, 结合了自动化显微镜和实验室分析仪, 使得有可能制定程序, 最大限度地减少人类干预的要求。我们利用这些技术, 开发了一种半自动分化系统, 用于为基础和应用生物医学研究生成大量的人体肝脏组织。这种方法可以使用人的 ESC 和 iPSC 线进行, 并且需要进行细微的调整, 具体取决于单元格线。将该系统与高含量分析相结合, 证明了 HLC 分型在18、19、20、21的规模上可以更少的耗时和执行。
总之, 这里描述的细胞培养技术的自动化导致了可靠性、实验时间管理和检测吞吐量的提高。
我们的半自动程序是高效, 可靠和经济的, 允许生产的 HLCs 在规模 (图 1)。在平板上的水井间的细胞数量上没有任何显著的差异, 这使得这个平台成为细胞筛选的合适方法 (图 2)。此外, 半自动化工作流使用户能够一次生成大量的板, 这在使用手动过程5、12之前是不可能的。
重要的是, 自动化过程并没有影响分化产量, 大多数细胞表达 HNF4α (89.2%±2) 和白长袍 (图 3)。HLCs 还表达了 CYP P450 酶 CYP2D6 和 CYP3A4, 并显示 CYP1A2 和 CYP3A 代谢活动可比先前报告的实验 (图 3)5。尽管协议的标准化, 细胞融合在分化之前是关键的纯 HLC 分化。因此, 确保良好的细胞分布在井中是一个重要的考虑因素 (图 1)。这已经被证明是细胞系依赖, 因此细胞播种和密度优化是需要的每一个细胞线之前的放大。
在目前的形式, 这个平台不适合生产大量的 HLCs 用于临床应用, 这将最有可能通过使用细胞工厂和生物反应器实现。然而, 所制定的方法确实允许快速生成人类肝细胞进行疾病建模、药物筛选和/或药物再用途研究。此外, 该检测还可用于多路复用, 允许生成多参数数据集进行机械分析。展望未来, 我们还认为, 这种技术可以应用于更复杂的体外系统, 如3D 分化或作为一个平台, 以改善 HLC 表型的体外。
最后, 我们认为, 我们的简单和半自动系统将增加实验吞吐量, 减少实验性的变化, 从而提高生物数据集的质量和他们对人类生理学的推断。
The authors have nothing to disclose.
这项工作得到了首席科学家办公室 (TCS/16/37) 的奖项和一份湄公河博士奖学金的支持。
405 LS Washer | Biotek | ||
B27 supplement | Life Technologies | 12587-010 | |
beta-mercaptoethanol | Life Technologies | 31350 | |
Bovine Serum Albumin | Sigma-Aldrich | A2058 | |
DMSO | Sigma-Aldrich | D5879 | |
DPBS with Calcium and Magnesium | ThermoFisher | 14040133 | |
Gentle cell dissociation reagent | STEMCELL Technologies | 7174 | |
GlutaMax | Life Technologies | 35050 | |
GripTips for VIAFLO 96 | Integra | 6434 | |
HepatoZYME-SFM | Life Technologies | 17705021 | |
Human Activin A | Peprotech | 120-14E | |
Human Hepatocyte Growth Factor | Peprotech | 100-39 | |
Human Oncostatin M | Peprotech | 300-10 | |
Human Recombinant Laminin 521 | BioLamina | LN521-02 | |
Hydrocortisone 21-hemisuccinate sodium salt | Sigma-Aldrich | H4881 | |
Knockout DMEM | Life Technologies | 10829 | |
Knockout Serum Replacement | Life Technologies | 10828 | |
mTeSR1 medium | STEMCELL Technologies | 5850 | |
MultidropCombi Reagent Dispenser | ThermoFisher | 5840300 | |
Non-essential amino acids | Life Technologies | 11140 | |
Operetta High-Content Imaging System | PerkinElmer | HH12000000 | |
Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) | Life Technologies | 15140122 | |
Recombinant mouse Wnt3a | R&D Systems | 1324-WN-500/CF | |
Rho-associated kinase (ROCK)inhibitor Y27632 | Sigma-Aldrich | Y0503-1MG | |
RPMI 1640 | Life Technologies | 21875 | |
Standard tube dispensing cassette | ThermoFisher | 24072670 | |
TWEEN 20 | Sigma-Aldrich | P9416 | |
VIAFLO 96 Electronic 96-channel pipette | Integra | 6001 | |
PBS, no calcium, no magnesium | ThermoFisher | 14190250 | |
Formaldehyde solution 4%, buffered, pH 6.9 | Sigma-Aldrich | 1.00496 EMD MILLIPORE | |
P450-Glo CYP3A4 Assay and Screening System | Promega | V8801 | |
P450-Glo CYP1A2 Assay and Screening System | Promega | V8771 | |
DAPI | Invitrogen | D1306 | |
Antibodies | |||
Albumin | Sigma-Aldrich | A6684 | 1:200 (mouse) |
Alpha-fetoprotein | Abcam | ab3980 | 1:500 (mouse) |
CYP2D6 | University of Dundee | University of Dundee | 1:200 (sheep) |
CYP3A4 | University of Dundee | University of Dundee | 1:200 (sheep) |
HNF-4α | Santa Cruz | sc-8987 | 1:400 (rabbit) |
E-cadherin | Abcam | ab76055 | 1:200 (mouse) |
IgG | DAKO | 1:400 | |
Anti-Mouse 488 (secondary antibody) | Life technologies | A-11001 | 1:400 |
Anti-sheep 488 (secondary antibody) | Life technologies | A-11015 | 1:400 |
Anti-rabbit 488 (secondary antibody) | Life technologies | A-11008 | 1:400 |