Denne protokol beskriver en semi-automatiserede tilgang til at producere hepatocyt-lignende celler fra humane pluripotente stamceller i en 96 godt plade format. Denne proces er hurtig og omkostningseffektiv, tillader produktion af forsikrede partier af hepatocyt-lignende celler for grundlæggende og anvendt menneskelige forskning.
Humane pluripotente stamceller udgør en vedvarende kilde til humant væv. Vores forskning er fokuseret på at skabe menneskelige levervæv fra menneskelige embryonale stamceller (hESCs) og induceret pluripotente stamceller (iPSCs). Nuværende differentiering procedurer generere menneskelige hepatocyt-lignende celler (HLCs) viser en blanding af føtale og voksne træk. For at forbedre celle fænotype, har vi fuldt ud defineret vores procedure for differentiering og celle niche, resulterer i generation af cellepopulationer, der viser forbedrede Gen-ekspression og funktion. Mens disse undersøgelser mærke fremskridt, har evnen til at generere store mængder af multi godt plader til screening været begrænset af arbejdskraft intensive procedurer og batch til batch variationer. For at tackle dette problem, har vi udviklet en semi-automatiske platform for at differentiere pluripotente stamceller i HLCs. Stem cell såning og differentiering blev udført ved hjælp af flydende håndtering og automatiske pipettering systemer i 96-brønd plade format. Efter differentieringen, celle fænotype blev analyseret ved hjælp af automatiserede mikroskopi og en multi godt luminometrisk.
Primære humane hepatocytter (PHHs) repræsenterer den aktuelle standard for leveren biomedicinsk forskning. Trods deres fordele udgør PHHs en begrænset kilde til modne hepatocytter med ustabil fænotype1. Menneskelige embryonale stamceller (råd) og menneskelige inducerede pluripotente stamceller (iPSC) er blevet foreslået som en kraftfuld ressource for biomedicinsk forskning, lovende en vedvarende kilde af menneskelige væv, herunder lever2,3,4 . Nuværende hepatocyt differentiering procedurer generere celler, der udtrykker hepatocyt markører, gener og funktioner, der svarer til PHHs3,4,5,6,7, 8,9,10,11. Mere nylig, brugen af definerede materialer og matricer som rekombinante laminins, har forbedret celle fænotype og eksperimenterende reproducerbarhed5,12,13,14.
Traditionelle celle kultur teknikker er stærkt afhængige af manuel pipettering, som er både tidskrævende og fejl liggende. Dette begrænser overførselshastighed på analysen og formatet plade man kan arbejde med. Til dato, er de fleste undersøgelser beskriver generation af HLCs arbejdskraftintensive karakter og derfor små i størrelsen15,16,17.
Aktuelle fremskridt i flydende håndtering og pipettering systemer, kombineret med automatiserede mikroskopi og laboratorium analysatorer, har gjort det muligt at udvikle procedurer, der minimerer behovet for menneskelig indblanding. Vi har draget fordel af disse teknologier og udviklet en semi-automatiske differentiering system til at generere store mængder af menneskelige levervæv for grundlæggende og anvendt biomedicinsk forskning. Denne fremgangsmåde kan udføres med både menneskelige ESC og iPSC linjer med mindre justeringer nødvendigt, afhængigt af cellelinie. Ved at kombinere dette system med høj indholdsanalyse, viser vi at HLC fænotyper kan være mindre tidskrævende og udført på skala18,19,20,21.
I Resumé, har automatisering af celle kultur teknikker beskrevet heri ført til forbedringer i pålidelighed, eksperimentelle time management og analyse overførselshastighed.
Vores semi-automatiseret procedure er effektiv, pålidelig og økonomisk, så produktionen af HLCs på skalaen (figur 1). Der var ikke nogen signifikant forskel i antallet af celler mellem brønde i pladen, at foretage denne platform en egnet fremgangsmåde for celle-baseret screening (figur 2). Derudover semi-automation arbejdsprocessen sætter brugeren i stand til at producere store mængder af plader på én gang, hvilket ikke var muligt før ved hjælp af manuelle processer5,12.
Vigtigere, automatisering proces ikke påvirkede differentiering udbytter, med fleste af celler, der udtrykker HNF4α (89.2% ±2) og ALB (92,8% ±6) (figur 3). HLCs også udtrykt CYP P450 enzymer CYP2D6 og CYP3A4 og vises CYP1A2 og CYP3A metaboliske aktivitet sammenlignes med tidligere rapporteret eksperimenter (figur 3)5. Trods standardiseringen af protokollen er celle confluency forud for differentieringen kritisk for ren HLC differentiering. Derfor, at sikre en god celle distribution på tværs af brønden er en vigtig overvejelse (figur 1). Dette har vist sig for at være cellelinie afhængige, derfor celle såning og tæthed optimering er påkrævet for hver celle linje før skala-up.
I sin nuværende form, denne platform er ikke egnet til at producere store mængder af HLCs til kliniske applikationer, og dette vil sandsynligvis ske ved hjælp af cellefabrikker og bioreaktorer. Men den metode udviklet giver mulighed for den hurtige generation af menneskets leverceller for sygdom modellering, stof screening og narkotika nyorientering undersøgelser. Analysen er desuden imødekommenhed over for multiplexing, tillader generation af multiparametric datasæt for mekanistisk analyse. Fremadrettet, mener vi også, at denne teknologi kan anvendes til mere komplekse in vitro- systemer såsom 3D differentiering eller som en platform til at forbedre HLC fænotype i vitro.
Afslutningsvis mener vi at vores enkle og semi-automatiske system vil øge gennemløbet af eksperimentelle og reducere eksperimentel variation, dermed forbedre kvaliteten af biologiske datasæt og deres ekstrapolering mod menneskets fysiologi.
The authors have nothing to disclose.
Dette arbejde blev støttet med priser fra Chefforskers Office (TCS/16/37) og en MRC ph.d.-stipendium.
405 LS Washer | Biotek | ||
B27 supplement | Life Technologies | 12587-010 | |
beta-mercaptoethanol | Life Technologies | 31350 | |
Bovine Serum Albumin | Sigma-Aldrich | A2058 | |
DMSO | Sigma-Aldrich | D5879 | |
DPBS with Calcium and Magnesium | ThermoFisher | 14040133 | |
Gentle cell dissociation reagent | STEMCELL Technologies | 7174 | |
GlutaMax | Life Technologies | 35050 | |
GripTips for VIAFLO 96 | Integra | 6434 | |
HepatoZYME-SFM | Life Technologies | 17705021 | |
Human Activin A | Peprotech | 120-14E | |
Human Hepatocyte Growth Factor | Peprotech | 100-39 | |
Human Oncostatin M | Peprotech | 300-10 | |
Human Recombinant Laminin 521 | BioLamina | LN521-02 | |
Hydrocortisone 21-hemisuccinate sodium salt | Sigma-Aldrich | H4881 | |
Knockout DMEM | Life Technologies | 10829 | |
Knockout Serum Replacement | Life Technologies | 10828 | |
mTeSR1 medium | STEMCELL Technologies | 5850 | |
MultidropCombi Reagent Dispenser | ThermoFisher | 5840300 | |
Non-essential amino acids | Life Technologies | 11140 | |
Operetta High-Content Imaging System | PerkinElmer | HH12000000 | |
Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) | Life Technologies | 15140122 | |
Recombinant mouse Wnt3a | R&D Systems | 1324-WN-500/CF | |
Rho-associated kinase (ROCK)inhibitor Y27632 | Sigma-Aldrich | Y0503-1MG | |
RPMI 1640 | Life Technologies | 21875 | |
Standard tube dispensing cassette | ThermoFisher | 24072670 | |
TWEEN 20 | Sigma-Aldrich | P9416 | |
VIAFLO 96 Electronic 96-channel pipette | Integra | 6001 | |
PBS, no calcium, no magnesium | ThermoFisher | 14190250 | |
Formaldehyde solution 4%, buffered, pH 6.9 | Sigma-Aldrich | 1.00496 EMD MILLIPORE | |
P450-Glo CYP3A4 Assay and Screening System | Promega | V8801 | |
P450-Glo CYP1A2 Assay and Screening System | Promega | V8771 | |
DAPI | Invitrogen | D1306 | |
Antibodies | |||
Albumin | Sigma-Aldrich | A6684 | 1:200 (mouse) |
Alpha-fetoprotein | Abcam | ab3980 | 1:500 (mouse) |
CYP2D6 | University of Dundee | University of Dundee | 1:200 (sheep) |
CYP3A4 | University of Dundee | University of Dundee | 1:200 (sheep) |
HNF-4α | Santa Cruz | sc-8987 | 1:400 (rabbit) |
E-cadherin | Abcam | ab76055 | 1:200 (mouse) |
IgG | DAKO | 1:400 | |
Anti-Mouse 488 (secondary antibody) | Life technologies | A-11001 | 1:400 |
Anti-sheep 488 (secondary antibody) | Life technologies | A-11015 | 1:400 |
Anti-rabbit 488 (secondary antibody) | Life technologies | A-11008 | 1:400 |