Dieses Protokoll beschreibt einen halbautomatischen Ansatz um Hepatozyten-wie Zellen aus menschlichen pluripotenten Stammzellen in einem 96-well-Plattenformat zu produzieren. Dieser Prozess ist schnell und kostengünstig, so dass die Herstellung von hochwertigen Chargen von Hepatozyten-ähnliche Zellen für Grundlagen- und angewandte Forschung am Menschen versichert.
Menschlicher pluripotenter Stammzellen stellen eine erneuerbare Energiequelle des menschlichen Gewebes. Unsere Forschung konzentriert sich auf die Erzeugung von menschlichen Lebergewebe aus humanen embryonalen Stammzellen (HES) und induzierte pluripotente Stammzellen (iPSCs). Aktuellen Differenzierung Verfahren generieren menschliche Hepatozyten-ähnliche Zellen (GLT) eine Mischung von fetalen und adulten Eigenschaften anzeigen. Zur Verbesserung der Zelle Phänotyp haben wir vollständig definiert unsere Differenzierung-Verfahren und die Zelle Nische, was bei der Erzeugung von Zell-Populationen, die verbesserte gen-Expression und Funktion anzeigen. Während dieser Studien Fortschritt, wurde die Fähigkeit, große Mengen von Multi-well-Platten für das Screening von Arbeitskräften intensive Verfahren und Variation von Charge zu Charge beschränkt. Um dieses Problem zu lösen, haben wir eine halbautomatische Plattform um pluripotente Stammzellen in GLT. Stem Cell seeding differenzieren und Differenzierung wurden mit liquid Handling und automatischen Pipettier-Systemen in 96-Well-Plattenformat durchgeführt. Im Anschluss an die Differenzierung war Zelle Phänotyp mit automatisierte Mikroskopie und ein Multi gut Luminometer analysiert.
Primären humanen Hepatozyten (PHHs) entsprechen dem aktuellen Stand für die Leber biomedizinische Forschung. Trotz ihrer Vorteile darstellen PHHs eine begrenzte Quelle von Reifen Hepatozyten mit instabilen Phänotyp1. Humanen embryonalen Stammzellen (WSR) und menschliche induzierte pluripotente Stammzellen (iPSC) wurden als eine leistungsfähige Ressource für die biomedizinische Forschung, verspricht eine erneuerbare Energiequelle des menschlichen Gewebes, einschließlich Leber,2,3,4 vorgeschlagen . Aktuelle Hepatozyten Differenzierung Verfahren generieren Zellen, die Hepatozyten Marker, Gene und ähnliche PHHs3,4,5,6,7Funktionen ausdrücken, 8,9,10,11. Vor kurzem hat die Verwendung von definierten Materialien und Matrizen z. B. rekombinante Laminins, verbesserte Zelle Phänotyp und experimentelle Reproduzierbarkeit5,12,13,14.
Traditionellen Zelle Kulturtechniken beruhen stark auf manuelle pipettieren, das ist zeitaufwändig und fehleranfällig. Dies schränkt den Durchsatz der Test und das Plattenformat, mit denen man zusammenarbeiten kann. Bis heute sind die meisten Studien beschreiben die Generation der GLT arbeitsintensiv in der Natur und daher klein in Größe15,16,17.
Aktuelle Fortschritte in der Handhabung von Flüssigkeiten und pipettieren Systeme in Kombination mit automatisierten Mikroskopie und Labor-Analysatoren, haben es möglich gemacht, Verfahren zu entwickeln, die die Voraussetzung für menschliche Eingriffe zu minimieren. Wir haben diese Technologien zunutze gemacht und entwickelt eine halbautomatische Differenzierung-System, um große Mengen von menschlichen Lebergewebe für Basic und angewandten biomedizinischen Forschung. Dieser Ansatz kann mit menschlichen ESC und iPSC-Linien mit geringfügigen Anpassungen erforderlich, abhängig von der Zell-Linie durchgeführt werden. Kombinieren dieses System mit hoher Inhaltsanalyse, zeigen wir, dass HLC Phänotypisierung weniger zeitaufwendig und in Skala18,19,20,21durchgeführt werden kann.
Zusammenfassend hat die Automatisierung der Zelle Kulturtechniken, die hierin beschriebenen in Zuverlässigkeit, experimentelle Zeitmanagement und Assay-Durchsatz zu Verbesserungen geführt.
Unsere halbautomatische Verfahren ist effizient, zuverlässig und wirtschaftlich, so dass die Produktion von GLT im Maßstab (Abbildung 1). Nicht gab es keinen signifikanten Unterschied in Bezug auf die Anzahl der Zellen zwischen den Brunnen in der Platte, so dass diese Plattform einen geeigneten Ansatz für zellbasierte Screening (Abbildung 2). Darüber hinaus ermöglicht die Teilautomatisierung Workflow dem Benutzer, große Anzahl von Platten auf einmal zu produzieren, was vor der Verwendung manueller Prozesse5,12nicht möglich war.
Wichtig ist, der Automatisierungsprozess keinen Einfluss auf Differenzierung Erträge mit der Mehrheit der Zellen mit dem Ausdruck HNF4α (89,2 % ±2) und ALB (92,8 % ±6) (Abbildung 3). GLT auch ausgedrückt CYP P450-Enzyme CYP2D6 und CYP3A4 und CYP1A2 und CYP3A metabolische Aktivität vergleichbar mit früheren gemeldeten Experimente (Abbildung 3)5angezeigt. Trotz der Standardisierung des Protokolls ist Zelle Konfluenz vor der Differenzierung für reine HLC Differenzierung von entscheidender Bedeutung. Gewährleisten eine gute Zelle Verteilung über dem Brunnen ist daher ein wichtiger Aspekt (Abbildung 1). Dies erweist sich als um Zelllinie angewiesen zu sein, daher Zelle seeding und Dichte Optimierung ist erforderlich für jede Zelle Zeile vor dem Skalieren.
In seiner jetzigen Form dieser Plattform ist nicht geeignet, große Mengen an GLT für klinische Anwendungen zu produzieren, und dies wird wahrscheinlich durch den Einsatz von Zellfabriken und Bioreaktoren erreicht werden. Allerdings erlaubt die entwickelte Methodik für die schnelle Erzeugung von menschlichen Leberzellen für Krankheit Modellierung, Drogen-Screening und/oder Drug repurposing Studien. Darüber hinaus ist der Test zu Multiplexen, erlaubt die Erzeugung von multiparametric Datasets für mechanistische Analyse. Geht nach vorn, glauben wir auch, dass diese Technologie auf komplexer in-vitro- Systemen wie 3D Differenzierung oder als Plattform zur Verbesserung der HLC Phänotyp in Vitroangewandt werden könnte.
Zusammenfassend glauben wir, dass unser einfaches und halbautomatische System experimentelle Durchsatz zu erhöhen und verringern experimentelle Variante, dadurch Verbesserung der Qualität der biologischen Datasets und ihre Extrapolation in Richtung der menschlichen Physiologie.
The authors have nothing to disclose.
Diese Arbeit wurde mit Auszeichnungen aus dem Hauptamt Office (TCS/16/37) und ein Promotionsstipendium MRC unterstützt.
405 LS Washer | Biotek | ||
B27 supplement | Life Technologies | 12587-010 | |
beta-mercaptoethanol | Life Technologies | 31350 | |
Bovine Serum Albumin | Sigma-Aldrich | A2058 | |
DMSO | Sigma-Aldrich | D5879 | |
DPBS with Calcium and Magnesium | ThermoFisher | 14040133 | |
Gentle cell dissociation reagent | STEMCELL Technologies | 7174 | |
GlutaMax | Life Technologies | 35050 | |
GripTips for VIAFLO 96 | Integra | 6434 | |
HepatoZYME-SFM | Life Technologies | 17705021 | |
Human Activin A | Peprotech | 120-14E | |
Human Hepatocyte Growth Factor | Peprotech | 100-39 | |
Human Oncostatin M | Peprotech | 300-10 | |
Human Recombinant Laminin 521 | BioLamina | LN521-02 | |
Hydrocortisone 21-hemisuccinate sodium salt | Sigma-Aldrich | H4881 | |
Knockout DMEM | Life Technologies | 10829 | |
Knockout Serum Replacement | Life Technologies | 10828 | |
mTeSR1 medium | STEMCELL Technologies | 5850 | |
MultidropCombi Reagent Dispenser | ThermoFisher | 5840300 | |
Non-essential amino acids | Life Technologies | 11140 | |
Operetta High-Content Imaging System | PerkinElmer | HH12000000 | |
Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) | Life Technologies | 15140122 | |
Recombinant mouse Wnt3a | R&D Systems | 1324-WN-500/CF | |
Rho-associated kinase (ROCK)inhibitor Y27632 | Sigma-Aldrich | Y0503-1MG | |
RPMI 1640 | Life Technologies | 21875 | |
Standard tube dispensing cassette | ThermoFisher | 24072670 | |
TWEEN 20 | Sigma-Aldrich | P9416 | |
VIAFLO 96 Electronic 96-channel pipette | Integra | 6001 | |
PBS, no calcium, no magnesium | ThermoFisher | 14190250 | |
Formaldehyde solution 4%, buffered, pH 6.9 | Sigma-Aldrich | 1.00496 EMD MILLIPORE | |
P450-Glo CYP3A4 Assay and Screening System | Promega | V8801 | |
P450-Glo CYP1A2 Assay and Screening System | Promega | V8771 | |
DAPI | Invitrogen | D1306 | |
Antibodies | |||
Albumin | Sigma-Aldrich | A6684 | 1:200 (mouse) |
Alpha-fetoprotein | Abcam | ab3980 | 1:500 (mouse) |
CYP2D6 | University of Dundee | University of Dundee | 1:200 (sheep) |
CYP3A4 | University of Dundee | University of Dundee | 1:200 (sheep) |
HNF-4α | Santa Cruz | sc-8987 | 1:400 (rabbit) |
E-cadherin | Abcam | ab76055 | 1:200 (mouse) |
IgG | DAKO | 1:400 | |
Anti-Mouse 488 (secondary antibody) | Life technologies | A-11001 | 1:400 |
Anti-sheep 488 (secondary antibody) | Life technologies | A-11015 | 1:400 |
Anti-rabbit 488 (secondary antibody) | Life technologies | A-11008 | 1:400 |