Mesh elektronik sonder sömlöst integrera och ger stabila, långsiktiga, singel-neuron inspelning i hjärnan. Detta protokoll använder mesh elektronik för i vivo experiment, som innefattar tillverkning av mesh elektronik, laddar in nålar, stereotaxic injektion, ingång/utgång gränssnitt, inspelning experiment och histologi av vävnad som innehåller mesh sonder.
Implanterbara hjärnan elektrofysiologi sonder är värdefulla verktyg i neurovetenskap på grund av deras förmåga att registrera neural aktivitet spatiotemporal med hög upplösning från ytliga och djupa hjärnregioner. Deras användning har hindrats, dock genom mekaniska och strukturella skillnader mellan sonder och hjärnan vävnad som ofta leder till mikrorörelse och gliosis med leder signal instabilitet i kronisk inspelning experiment. I kontrast, efter implantation av ultraflexible mesh elektronik via spruta injektion, sonder mesh form en sömlös, gliosis-fri gränssnitt med omgivande hjärnvävnad som möjliggör stabil spårning av enskilda nervceller på minst ett år tidsskalan. Detta protokolldetaljer de viktigaste stegen i en typisk mus neurala inspelning experiment med spruta-injicerbara mesh elektronik, inklusive tillverkning av mesh elektronik i en standard photolithography-baserad process möjliga vid många universitet, lastning Mesh elektronik till standard kapillär nålar, stereotaxic injektion i vivo, anslutning av mesh indata/utdata till standard instrumentation gränssnitt, återhållsam eller fritt rörliga inspelningen och histologiska snittning av hjärnan vävnad som innehåller mesh elektronik. Representativa neurala inspelningar och histologi data presenteras. Utredarna bekant med detta protokoll kommer att ha kunskapen som krävs för att införliva mesh elektronik i egna experiment och dra nytta av de unika möjligheter som långsiktigt stabil neurala gränssnitt, såsom studier av åldrande processer, hjärnans utveckling och patogenesen av hjärnsjukdom.
Utveckling av verktyg kan kartlägga hjärnan med singel-neuron upplösning är av central betydelse att neurovetenskap och neurologi. Icke-invasiv teknik för neurala studier såsom elektroencefalografi (EEG), Magnetencefalografi (MEG) och funktionell magnetresonanstomografi (fMRI) har visat sig vara värdefull för korrelering hjärnaktivitet med beteende i människor1, 2, men de saknar spatiotemporal resolutionen nödvändig för studera strukturen och dynamiken i neurala nätverk på sin grundläggande mikrometer och millisekund skalor, respektive3,4. Vissa electrocorticography (ECoG) sonder och optisk imaging metoder med spänningskänsliga färgämnen har lyckats spela in enstaka tillsatta verksamhet i vivo5,6, men de är i allmänhet effektiva bara nära den hjärnans yta, begränsa tillämpligheten till studier av grunt hjärnregioner. Däremot implanterbara elektriska sonder kan mäta singel-neuron elektrofysiologi i fritt rörliga djur från praktiskt taget alla hjärnregionen utan behov av fluorescerande etiketter, vilket gör dem oumbärliga för system-nivå neurovetenskap, särskilt som mikrofabrikation tekniker från halvledarindustrin har drivit räknas kanalen i hundratusentals3,7,8,9. Grund av dessa funktioner, har implanterbara elektriska sonder gjort många viktiga bidrag till neurovetenskap och neurologi, inklusive grundläggande studier av informationsbehandling i det visuella systemet10, behandling av neurologiska sjukdomar som Parkinsons sjukdom11och demonstration av hjärnan-maskin-gränssnitt (BMIs) för avancerad protetik12,13.
Ändå, långsiktig instabilitet manifesteras som minskar spike amplituder och instabila signaler på tidsskalor av veckor till månader14,15 har begränsad tillämpligheten av implanterbara sonder till studien av relativt kortsiktiga fenomen, lämnar frågor såsom hjärnans åldrande och utveckling till stor del obesvarade. Begränsningarna i långsiktig instabilitet är ett resultat av en obalans mellan konventionella sonder och hjärnvävnad i storlek, mekanik och topologi14,15,16,17,18. Vad gäller storlek, medan nervcellernas synapser och somata är ungefärligt tiotals nanometer till tiotals mikrometer i diameter19, respektive, traditionella sonder är ofta betydligt större, när det gäller kisel mikroelektrod matriser > 4 gånger storleken på en enda neuron cellkroppen7,8. Den relativt stora storleken på dessa sonder kan störa den naturliga struktur och anslutning av tät nervvävnad, därmed bidra till kronisk immunrespons och störande neurala kretsarna som studeras. När det gäller mekaniska egenskaper är traditionella sonder drastiskt styvare än den extremt mjuka nervvävnad där de implanteras; även ”flexibel” sonder gjorda av 10 – 20 µm tjocka skivor av polyimid är minst 100.000 gånger styvare än hjärnan vävnad20,21. Denna obalans i böjstyvhet orsakar relativa skjuvning rörelse mellan sonden och hjärnan vävnaden, vilket leder till otillförlitliga single-unit spårning under längre inspelningar och förmå kronisk gliosis vid implanteringsstället. Slutligen, konventionella brain sonder topologisk struktur nödvändigtvis utesluter en solid volym av vävnaden. Sådan obalans i topologin stör uppkopplingen av neurala kretsar, utgör hinder för den naturliga tredimensionella (3D) interpenetrated fördelningen av nervceller, gliaceller och blodkärlen i hjärnan vävnad22och hindrar 3D transport av Signaling molekyler23. Tillsammans, har dessa brister av konventionella sonder gjort dem understiger den långsiktiga kompatibilitet begärs för kliniska tillämpningar och längsgående neurovetenskap studier på singel-neuron nivå.
För att övervinna dessa brister, försökte vi sudda ut gränsen mellan de neurala och elektroniska system genom att utveckla ett nytt paradigm av ”vävnad-liknande” neurala sonder kallas mesh elektronik16,21,24. Mesh elektronik behandlar ovanstående matchande frågor i storlek, mekanik och topologi genom att införliva (1) strukturella drag hos samma nanometer till mikrometer storlek skala av nervvävnad, (2) mekaniska egenskaper liknar dem i hjärnvävnad, och (3) en 3D avdunsta topologi som är > 90% öppet utrymme och därmed rymmer sammanflätningen av nervceller och diffusionshastighet för molekyler genom den extracellulära miljön. Mesh elektronik sonder kan levereras just till delar av hjärnan genom en spruta och en kanyl, orsakar minimal akuta skador medan implantera även i djupa hjärnan regioner21,25. Neuronala soma och axoner har visat sig interpenetrate öppna 3D mesh elektronik probe strukturen inom veckor efter injektion, och skapar därmed en sömlös, gliosis-fri gränssnitt mellan inspelning elektronik och omgivande hjärnan vävnad21 , 26 , 27. dessa unika funktioner har aktiverat mesh elektronik sonder till stabilt spåra tillsatta aktivitet från samma enskilda nervceller under minst ett år tidsskalan27. Dessutom ger tillverkning av mesh elektroniken baserat på photolithography (PL) hög skalbarhet av antalet elektroder som kan införlivas, med påvisad kanal räknas upp till 128 elektroder per sonden med hjälp av enkel kontakt mask litografi 28 och en plug-and-play indata/utdata (I/O) design som möjliggör snabb elektrisk anslutning till perifera elektronik utan specialutrustning29.
Ett brett spektrum av studier får införliva mesh elektronik i mätning protokoll. De flesta intracortical inspelning experiment kunde dra nytta av mesh electronics minimalinvasiv implantation förfarande via spruta injektion, drastiskt minskad immunsvaret efter implantation, och möjligheten att lämna mesh elektronik i den vävnaden under efterföljande histologi och immunfärgning för exakt analys av biologiska miljön kring varje inspelning webbplats. Kronisk inspelning experiment kommer särskilt härleda värdet från mesh elektronik unika förmåga att spåra ett stort antal enskilda nervceller för månader och år. Den här funktionen skapar möjligheter för studier med singel-neuron upplösning som var tidigare opraktiskt, såsom längsgående åldrande studier av neurala kretsar, utredningar av utveckla hjärnan och förfrågningar i patogenesen av encefalopati16.
I detta protokoll beskriver vi alla nyckeln steg i en typisk mus neurala inspelning experiment med spruta-injicerbara mesh elektronik (se figur 1). Anvisningarna omfattar tillverkning av mesh elektronik i en standard PL-baserad process som möjligt vid många universitet, laddar mesh elektronik i standard kapillär nålar, stereotaxic injektion av mesh elektronik i vivo, anslutning av den Mesh I/O standard instrumentation gränssnitt, återhållen eller fritt rörliga inspelningarna och histologiska snittning av hjärnvävnaden som innehåller mesh elektronik. Vissa forskare använder mesh elektronik bara för histologi studier får inte kräva elektriska gränssnitt och inspelning, i vilket fall kan de hoppa över dessa steg. Efter att bekanta sig med detta protokoll, bör utredare ha all kunskapen som krävs för att använda mesh elektronik i sina egna experiment.
Alla steg i tillverkningen och användningen av mesh elektronik är viktiga, men några är särskilt kritisk. Innan du släpper mesh elektroniken från deras wafer, är det viktigt att oxidera ytan för att göra maskorna lätt svävande i vattenlösning (steg 1.6.1). Om detta steg hoppas över, maskorna brukar flyta på ytan av vattnet, vilket gör dem svåra att läsa in i nålar, och om de kan vara laddade, de ofta håller sig till sidorna av glas nålar, som kräver stora volymer (> 100 µL) för injektion. Underlåtenhet att oxidera ytan innan release, därför vanligtvis innebär att maskorna inte kan användas och tillverkning måste åter utförd från början. Ett annat viktigt steg bockning mesh elektroniken ”hejda” till ~ 90° under I/O gränssnitt (steg 4,3). Om vinkeln är mindre än 90°, sedan passar alla 32 I/O kuddar inte till ZIF kontakten; några har blir avskurna i slutet att tillåta införande, att minska antalet anslutna elektroder. Processen måste också göras försiktigt för att förhindra att stjälken bryts.
Utformningen av mesh elektronik kan anpassas för olika tillämpningar genom att ändra fotomasker och använder samma fabrication förfarande som beskrivs i figur 2. Till exempel, medan mesh elektronik sonderna används för att registrera data i figur 9 var avsedda att ha 32 inspelning elektroder span mus hippocampus och primära somatosensoriska cortex, kan elektrodplacering inom den ultraflexible mesh vara valt för att inrikta sig på praktiskt taget alla regioner i hjärnan, eller större elektroder för stimulering kan vara bolagiserade27. Samma grundläggande mesh struktur och fabrication förfarande bevaras, men elektrodplacering och utformning är justerade för att tillgodose behovet av studien. Utredare ska försiktig, dock, och alltid testa att modifierade konstruktioner kan injiceras enkelt genom de avsedda nålarna. Små förändringar till böjande mekanik av mesh elektronik kan ha betydande effekter på inmatningskapacitet. Ett sådant exempel är att en 45° vinkel mellan tvärgående och längsgående SU-8 band ger en mesh elektronik probe som kan injiceras facilely men 90° vinkel resulterar i en som crumples och träskor nålar21.
Mäta impedansen hos inspelning elektroderna är användbart för felsökning. En 20 µm diameter cirkulär Pt elektrod bör ha en impedans magnitud nära 1 MΩ mätt vid en frekvens på 1 kHz i vivo eller 1 x PBS29. En impedans som är betydligt större än detta innebär att elektroden är inte utsatt, vilket kan hända om det är förorenat med fotoresist rester, eller inte elektriskt ansluten. Den senare kan uppstå om det exempelvis finns damm på foto masken under PL som resulterar i en koppla i Au interconnects, eller om en av mesh I/O kuddar inte är kontaktats av de ZIF kontaktstift under I/O gränssnitt. En impedans storlek ungefär hälften det förväntade värdet antyder att kanalen kan vara kortsluten till den intilliggande, skapa en krets av två elektrod impedanser parallellt till varandra. Värdena uppmätta impedansen fungera som en guide under felsökning; kombinerat med optisk mikroskopi av mesh elektronik sonderna, källan till problemet kan vanligtvis identifieras och rättade i nästa fabrication kör eller I/O gränssnitt försök.
Användning av sprutan-injicerbara mesh elektronik för akuta studier är begränsat i det enstaka tillsatta aktivitet vanligtvis inte observeras förrän 1 vecka post injektion27, även senaste arbete (opublicerade) visar att problemet är lätt att övervinna. Avgörande faktorer för den tid som krävs att se tillsatta aktivitet är mesh design, volymen av vätska injiceras i hjärnan tillsammans med mesh elektronik och diametern på nålen används för injektion, eftersom dessa påverkar graden av vävnadsskada under den injektion och graden av healing. Stora injektionsvolymer kan krävas om mesh elektroniken inte behandlas med syrgas plasma före utgivningen i Ni etsmedlet; det vill säga om maskorna inte är hydrofil, kan den följa glas nålen. Ibland, har maskorna defekter som leder till böjning mekanik vilket gör dem svåra att injicera. Under lastning av mesh elektronik är det viktigt att kontrollera att maskorna går enkelt och smidigt inom nålen (som visas i kompletterande Video 1). Om så inte är fallet, en elektronisk sond med olika maskstorlek bör användas. Bästa resultat för sömlös neurala gränssnitt kommer att uppnås med de idealiska injektionsvolymer på 10 – 50 µL per 4 mm av injicerade mesh längd. Nyare resultat med finare mesh elektronik sonder injiceras eller mindre diameter kapillär nålar (så liten som 150 µm innerdiameter, 250 µm ytterdiameter) Visa att enhet tillsatta kan observeras från strax efter injektionen (akut mätningar) genom längre tider. Masken designfiler för dessa finare mesh strukturer finns genom begäran eller från resurs webbplats, meshelectronics.org. Vi uppskattar den totala avkastningen av våra i vivo mesh injektion förfaranden med 400 µm innerdiameter (650 µm ytterdiameter) nålar till omkring 70%, även om avkastningen är närmare 80-90% för våra nyare arbete med 150 µm innerdiameter (250 µm ytterdiameter ) nålar. De vanligaste felorsakerna är (1) att inte injicera mesh smidigt, vilket resulterar i hjärnan ödem från oväntat stora injektionsvolymer in i hjärnan, (2) mesh brott under den manuella manipulation som krävs i I/O gränssnitt förfarande, och (3) blödning från skadar ett blodkärl under injektionen. Skadar ett blodkärl under injektion är sällsynt (orsaken till mindre än 10% av misslyckanden) och kan minskas ytterligare med hjälp av bild-guidad kirurgi. Vi noterar också att skador av blodkärl är en vanlig begränsning av alla förfaranden som rör penetration av hjärnvävnaden, inklusive injektion av viruspartiklar för transfection, implantation av styv brain sonder, och injektion av mesh elektronik.
Mesh elektronik sonder är stabilt spela in från och spåra samma enskilda nervceller på minst månader till år tidsskalor och framkalla nästan ingen kronisk immunrespons, som visas i figur 9 och figur 10, respektive. Detta utgör en betydande fördel jämfört med konventionen djup elektroder, som ofta lider av minskande spike amplituder, instabil signaler och kronisk inflammation under loppet av långsiktiga inspelning experiment14, 15. Dessutom mesh elektroniken har fördelen att de kan lämnas i vävnaden vid histologiska snittning, färgning, och imaging, i motsats till konventionella sonder, som är alltför stelbenta och måste därför avlägsnas före histologi analyser. Mesh elektronik möjliggör därför en unik förmåga att använda immunhistokemisk analys för att studera just den cellulära miljön som omger varje inspelning webbplats.
Det protokoll som presenteras här öppnar upp spännande nya möjligheter i neurovetenskap. Minimalt invasiva leveransmetod och sömlös integrering av mesh elektronik med hjärnvävnad minimerar störningar i neurala kretsar och undviker kroniska immunsvar, som skulle kunna gynna de flesta typer av kronisk neurala inspelning experiment. Förmågan av mesh elektronik vid rekordet och spårar samma enda nervceller för långa perioder blir särskilt intressanta för utredarna försöka korrelera millisekund-skala tillsatta aktivitet med månad till år långa processer såsom åldrande, den patogenesen av hjärnsjukdom eller hjärna utveckling16,18. Dessutom finns det stora möjligheter att utöka och anpassa detta protokoll, till exempel lägga till aktiv elektronik till PCB huvud-scenen för att implementera funktioner som digital multiplexing8,35, trådlös kommunikation35,36,37och signalbehandling35, Co injicera stamceller eller polymerer med mesh elektronik till stöd i vävnad förnyelse18,38, 39, och införliva nanotråd field – effecttransistorer (NW-fETsna) i mesh elektronik för mycket lokaliserad och multifunktionella brain sonder24,29,40,41 ,42.
The authors have nothing to disclose.
C.M.L. erkänner stöd av detta arbete genom av Air Force Office för vetenskaplig forskning (FA9550-14-1-0136), en Harvard University Physical Sciences och Engineering Accelerator award och nationella institut för hälsa regissörens Pioneer Award ( 1DP1EB025835-01). T.G.S. erkänner stöd av Department of Defense (DoD) genom programmet National Defense Science & Engineering Graduate Fellowship (NDSEG). G.H. erkänner gemenskap stöd från American Heart Association (16POST27250219) och vägen till självständighet Award (överordnade K99/R00) från National Institute on Aging av National Institutes of Health. Detta arbete utfördes delvis vid Harvard University Center för nanoskala system (CNS), en medlem av den nationella nanoteknik samordnad infrastruktur Network (NNCI), som stöds av National Science Foundation under NSF ECCS Award nr 1541959.
Motorized stereotaxic frame | World Precision Instruments | MTM-3 | For mouse stereotaxic surgery |
512-channel recording controller | Intan Technologies | C3004 | A component of the neural recording system |
RHD2132 amplifier board | Intan Technologies | C3314 | A component of the neural recording system |
RHD2000 3-ft ultra thin SPI interface cable | Intan Technologies | C3213 | A component of the neural recording system |
Mouse restrainer | Braintree Scientific | TV-150 STD | Standard 1.25 inch inner diameter; used to restrain the mouse during restrained recording sessions. |
Si wafers | Nova Electronic Materials | 3" P <100> .001-.005 ohm-cm 356-406μm Thick Prime Grade SSP Si wafers w/2 Semi-Std. Flats & 6,000 A°±5% Wet Thermal Oxide on both sides. |
|
Photomasks (chrome on soda lime glass) | Advance Reproductions | Advance Reproductions and other vendors manufacture photomasks from provided design files. Our photomask design files are available by request or from the resource website, meshelectronics.org. Alternatively, some university clean rooms have mask writers for making photomasks on site. | |
AutoCAD software | Autodesk Inc. | Design software for drawing photomasks. A free alternative is LayoutEditor. Our photomask design files are available by request or from the resource website, meshelectronics.org. | |
Thermal evaporator | Sharon Vacuum | Used to evaporate Ni, Cr, and Au onto mesh electronics during fabrication. Many university clean rooms have this or a similar tool. | |
SU-8 2000.5 negative photoresist | MicroChem Corp. | Negative photoresist used to define the bottom and top passivating layers of mesh electronics. | |
MA6 mask aligner | Karl Suss Microtec AG | Used to align each photomask to the pattern on the wafer and expose the wafer to UV light. Most university clean rooms have this or a similar tool. | |
SU-8 developer | MicroChem Corp. | Used to develop SU-8 negative photoresist following exposure to UV light. | |
LOR3A lift-off resist | MicroChem Corp. | Used with Shipley 1805 photoresist to promote undercutting during metal lift-off processes | |
Shipley 1805 positive photoresist | Microposit, The Dow Chemical Company | Positive photoresist used to define metal interconnects and Pt electrodes in mesh electronics | |
MF-CD-26 positive photoresist developer | Microposit, The Dow Chemical Company | To develop S1805 positive photoresist after exposure in a mask aligner. Many university clean rooms stock this chemical. | |
Spin coater | Reynolds Tech | For coating wafers with positive and negative resists. Most university clean rooms have spin coaters. | |
PJ plasma surface treatment system | AST Products, Inc. | Used to oxidize the surface of mesh electronics prior to release into aqueous solution. Most university clean rooms have this or a similar tool. | |
Electron beam evaporator | Denton Vacuum | For evaporating Cr and Pt during fabrication of mesh electronics. Many university clean rooms have this or a similar tool. | |
Remover PG | MicroChem Corp. | Used to dissolve LOR3A and Shipley S1805 resists during metal lift-off | |
Ferric chloride solution | MG Chemicals | 415-1L | A component of Ni etching solution |
36% hydrochloric acid solution | Kanto Corp. | A component of Ni etching solution | |
Glass capillary needles | Drummond Scientific Co. | Inner diameter 0.40 mm, outer diameter 0.65 mm. Other diameters are available. | |
Micropipette holder U-type | Molecular Devices, LLC | 1-HL-U | Used to hold the glass capillary needles during stereotaxic injection |
1-mL syringe | NORM-JECT®, Henke Sass Wolf | Used for manual loading of mesh electronics into capillary needles | |
Polyethylene intrademic catheter tubing | Becton Dickinson and Company | Inner diameter 1.19 mm, outer diameter 1.70 mm | |
5-mL syringe | Becton Dickinson and Company | Used in the syringe pump for injection of mesh electronics in vivo | |
Eyepiece camera | Thorlabs Inc. | DCC1240C | Used to view mesh electronics within capillary needles during injection |
ThorCam uc480 image acquisition software for USB cameras | Thorlabs Inc. | Used to view mesh electronics within capillary needles during injection | |
Syringe pump | Harvard Apparatus | PHD 2000 | Used to flow precise volumes of solution through capillary needles during injection of mesh electronics |
EXL-M40 dental drill | Osada | 3144-830 | For drilling the craniotomy |
0.9 mm drill burr | Fine Science Tools | 19007-09 | For drilling the craniotomy |
Hot bead sterilizer 14 cm | Fine Science Tools | 18000-50 | Used to sterlize surgical instruments |
CM1950 cryosectioning instrument | Leica Microsystems | Used to slice frozen tissue into sections. Many universities have this or a similar tool available in a shared facility. | |
0.3% Triton x-100 | Life Technologies | Used for histology | |
5% goat serum | Life Technologies | Used for histology | |
3% goat serum | Life Technologies | Used for histology | |
Rabbit anti-NeuN | Abcam | ab177487 | Used for histology |
Mouse anti-Neurofilament | Abcam | ab8135 | Used for histology |
Rat anti-GFAP | Thermo Fisher Scientific Inc. | PA516291 | Used for histology |
ProLong Gold Antifade Mountant | Thermo Fisher Scientific Inc. | P36930 | Used for histology |
Poly-D-lysine | Sigma-Aldrich Corp. | P6407-5MG | Molecular weight = 70-150 kDA |
Right-angle end clamp | Thorlabs Inc. | RA180/M | Used to attach the pipette holder to the stereotaxic frame |
Printed circuit board (PCB) | Advanced Circuits | Used to interface between mesh electronics and peripheral measurement electronics such as the Intan recording system. Advanced Circuits and other vendors manufacture and assemble PCBs based on provided design files. Our PCB design files are available by request or at the resource site meshelectronics.org | |
32-channel standard amplifier connector | Omnetics Connector Corp. | A79024-001 | Component assembled onto the PCB |
32-channel flat flexible cable (FFC) | Molex, LLC | 152660339 | Used as a clamping substrate when interfacing to mesh electronics I/O pads with the PCB-mounted ZIF connector |
32-ch zero insertion force (ZIF) connector | Hirose Electric Co., LTD | FH12A-32S-0.5SH(55) | Component assembled onto the PCB |