Summary
Kafes elektronik sonda sorunsuz bir şekilde entegre ve beyin içinde kayıt istikrarlı, uzun vadeli, tek-nöron düzeyi sağlar. Vivo deneyler, kafes elektronik, iğneler, stereotaksik enjeksiyon, giriş/çıkış arabirim, kayıt deneyler ve histoloji kafes içeren doku yükleme imalatı içeren için kafes elektronik bu protokolü kullanır sondalar.
Abstract
İmplante edilebilir beyin Elektrofizyoloji probları değerli nörolojik yeteneklerini nedeniyle yüksek kronolojik zamanmekansal çözünürlük ile kayıt sinirsel aktivite için sığ ve derin beyin bölgelerden araçlardır. Bunların kullanımı engel, ancak, mekanik ve yapısal uyuşmazlıkları sonda ve beyin arasındaki doku bu sık götürmek yanında micromotion için ve gliosis kaynaklanan ile kronik kayıt deneyler kararsızlığa sinyal. Buna karşılık, ultraflexible kafes elektronik implantasyonu şırınga enjeksiyon yolu ile takip formu kesintisiz, gliosis ücretsiz arayüzü en az bir yıl bireysel nöronların istikrarlı izlemeyi etkinleştirir çevreleyen beyin dokusu ile mesh probları zaman ölçeği. Şırınga enjekte edilebilir kullanarak tipik fare sinirsel kayıt deneyinde önemli adımlar kafes elektronik fabrikasyon bir standart fotolitografi temelinde işlem olası yükleme birçok üniversitelerde de dahil olmak üzere elektronik, kafes bu protocol detayları Elektronik mesh standart kapiller iğneler, stereotaksik enjeksiyon içinde vivo, giriş/çıkış standart araçları arabirimlerine, ölçülü veya kayıt oturumları, serbestçe hareket ve histolojik beynin kesit örgü bağlantı doku içeren elektronik kafes. Histoloji veri ve temsilcisi sinirsel kayıtları mevcuttur. Müfettişler bu iletişim kuralı ile tanıdık kafes elektronik deneyleri dahil ve çalışmalar yaşlanma gibi uzun vadeli istikrarlı sinirsel arayüz tarafından tanınan benzersiz fırsatlardan yararlanmak için gerekli bilgiye sahip olabilirsin işlemleri, beyin gelişimi ve beyin hastalığı patogenezi.
Introduction
Araçları ile tek-nöron kararlılık Beyin Haritalaması yetenekli nörobilim ve Nöroloji Merkezi önemli gelişmedir. Noninvaziv teknolojileri elektroansefalografi (EEG), magnetoencephalography (MEG) ve fonksiyonel manyetik rezonans görüntüleme (fMRI) gibi sinirsel çalışmalar için davranış insanlar1ile beyin aktivitesi korele için değerli kanıtlanmış, 2, ama onlar eksikliği kronolojik zamanmekansal çözünürlük gerekli yapısı ve sinir ağları temel mikrometre ve milisaniyelik dinamikleri ölçekler için sırasıyla3,4. Belirli electrocorticography (ECoG) probları ve optik görüntüleme yöntemleri voltaj duyarlı boya kullanarak tek-unit spiking etkinlik vivo içinde5,6kayıt başarmış ama onlar genellikle sadece yakınındaki etkilidir beyin yüzey, sığ beyin bölgeleri çalışmaların uygulanabilirliği sınırlama. Buna ek olarak, implante edilebilir elektrikli sondalar serbestçe floresan etiketleme, gerek kalmadan hemen her beyin bölgesinden hayvanlar hareketli tek-nöron Elektrofizyoloji ölçebilirsiniz onları özellikle sistemleri düzeyi nörolojik için vazgeçilmez hale Yarıiletken Endüstrisi microfabrication teknikleri itti kanal yüz ve bin-3,7,8,9içine sayar. Bu yetenekleri sayesinde, implante edilebilir elektrikli sondalar birçok önemli katkılar nörobilim ve Nöroloji, bilgi işleme görsel sistem10' da, nörolojik tedavisinde temel çalışmaları da dahil olmak üzere yapmış olduğunuz Parkinson hastalığı11ve beyin-Makine arayüzleri (BMIs) gelişmiş protez12,13gösterimi gibi bozukluklar.
Yine de, uzun vadeli istikrarsızlık spike genlikleri ve ay14,15 hafta timescales üzerinde kararsız sinyallere azalan olarak tecelli nispeten kısa süreli çalışma implante edilebilir probları uygulanabilirliği sınırlıdır olaylar, gibi beyin yaşlanma ve kalkınma büyük ölçüde cevapsız sorular bırakarak. Uzun vadeli istikrarsızlık, kısıtlamaları, geleneksel probları ve beyin dokusunda boyutu, mekanik ve topoloji14,15,16,17,18arasında bir uyumsuzluk sonucudur. Nöronal sinapslarda ve somata yaklaşık nanometre mikrometre çapında19, onlarca onlarca sırasıyla, büyüklüğü açısından geleneksel probları kez önemli ölçüde daha büyük, silikon elektrot dizilerin durumunda vardır > 4 kez bir tek nöron hücre gövdesi7,8boyutu. Bu sonda nispeten büyük boyutunu bağlantı hızına böylece kronik immün yanıt-e doğru katkıda bulunmak ve okudu nöro çevrim perturbing yoğun sinir dokusu ve doğal yapısını bozabilir. Mekanik özellikler açısından geleneksel sondalar içinde onlar implante edilir son derece yumuşak sinir dokusu büyük ölçüde katı; Hatta "esnek" probları 10-20 µm kalınlığında yaprak polimid yapılan beyin doku20,21en az 100.000 kat daha sert. Sertlik bükme bu göreli yamultma hareket güvenilmez tek-unit genişletilmiş kayıtları sırasında izleme ve implantasyon sitesinde kronik gliosis inducing önde gelen sonda ve beyin dokusu arasında neden olabilir. Son olarak, geleneksel beyin probları topolojik yapısını mutlaka sağlam bir cilt dokusunun dışlar. Tür uyuşmazlığı topolojisi sinir devreleri bağlantısı bozan, nöronlar, Gliyal hücreler ve kan damarlarının beyin doku22içinde doğal üç boyutlu (3D) interpenetrated dağıtım önler ve 3D taşımacılığının engeller sinyal molekülleri23. Birlikte, bu eksikliklerin geleneksel probları onları klinik uygulamaları ve boyuna nörolojik çalışmalar tek-nöron düzeyinde için aranan uzun vadeli uyumluluk kısa sonbahar yapmış.
Bu eksiklikleri gidermek için gelişmekte olan "doku benzeri" sinirsel probları kafes elektronik16,21,24olarak adlandırdığı yeni bir paradigma tarafından sinirsel ve elektronik sistemleri arasında hattı bulanıklaştırma istedi. Kafes elektronik yukarıdaki eşleşen boyutu, mekanik ve topoloji (1) yapısal özelliklerini sinir dokusunun mikrometre boyutu ölçek nanometre aynı (2) mekanik özellikleri bu beyin dokusu ve (3) bir 3D benzer dahil ederek sorunlara çözüm getirir olduğunu macroporous topoloji > % 90'ı açık alan ve böylece interpenetration sinir hücreleri ve hücre dışı ortam ile moleküllerin difüzyon barındırır. Kafes elektronik probları tam olarak belirli beyin bölgelerine bir şırınga ve hatta derin beyin bölgeleri21,25içinde yerleştirilmesi sırasında en az akut hasara neden bir iğne aracılığıyla teslim edilebilir. Nöronal soma ve akson hafta sonrası enjeksiyon, böylece elektronik kayıt ve beyin dokusu21 çevreleyen arasında kesintisiz, gliosis içermeyen bir arabirim oluşturma açık 3B kafes elektronik sonda bünyesinde interpenetrate gösterilmiştir , 26 , 27. bu benzersiz özellikler stably en az bir yıl zaman ölçeği27üzerine aynı bireysel neurons spiking etkinliğini izlemek kafes elektronik probları etkinleştirdiyseniz. Ayrıca, fotolitografi (PL) göre kafes elektronik imalat dahil edilebilir, basit kişi maske litografi kullanarak sonda başına en çok 128 elektrotlar ile gösterdiği kanal sayar elektrot sayısının yüksek ölçeklenebilirlik sağlar 28 ve özel ekipman29olmadan periferik Elektronik hızlı elektrik bağlantısı için izin veren bir Tak ve kullan giriş/çıkış (g/ç) tasarım.
Çok çeşitli çalışmalar kafes elektronik ölçüm protokolleri birleşmeyle üzerinden yararlanabilir. Çoğu intracortical kayıt deneyler şırınga enjeksiyon, implantasyon, takip büyük ölçüde azaltılmış bağışıklık yanıtı üzerinden mesh elektronik Minimal İnvasif implantasyonu yordamdan faydalı olacağını ve bırak yeteneği mesh elektronikte doku sonraki Histoloji ve immunostaining biyolojik çevrenin her kayıt site çevreleyen kesin çözümleme sırasında. Kronik kayıt deneyler özellikle değer yıl ay için çok sayıda bireysel nöronlar izlemek için kafes elektronik benzersiz yeteneği elde. Bu yeteneği ile daha önce pratik, sinir devreleri boyuna yaşlanma çalışmalar, araştırmalar gelişmekte olan beyin ve patogenezi içine soruşturma gibi tek-nöron kararlılık çalışmaları için fırsatlar oluşturur Encephalopathy16.
Bu protokol için tek bir tipik fare sinirsel kayıt deneyi şırınga enjekte edilebilir kafes elektronik (bkz. Şekil 1) kullanarak anahtar adımlar açıklanmaktadır. Açıklanan adımları standart PL tabanlı işlem olası kafes elektronik standart kapiller iğneler, kafes elektronik in vivo, bağlantı stereotaksik enjeksiyon yükleme birçok üniversitede bir kafes elektronik imalat dahil I/O standart araçları arabirimleri, ölçülü veya serbestçe hareket kayıt oturumları ve histolojik kafes elektronik içeren beyin dokusunun kesit için kafes. Sadece Histoloji çalışmaları için kafes elektronik kullanarak bazı araştırmacılar elektrik arayüz oluşturma ve kayıt, bu durumda onlar bu adımları atlayabilirsiniz gerektirmeyebilir. Bu iletişim kuralı ile kendilerini tanımaya sonra müfettişler kafes elektronik kendi deneylerde kullanmak için gerekli bilgiye sahip olmak zorundadırlar.
Protocol
Tüm yordamları omurgalı hayvan konularda gerçekleştirilen kurumsal hayvan bakım ve kullanım Komitesi (IACUC) Harvard Üniversitesi tarafından onaylanmıştır.
1. Mesh elektronik imalatı
Not: Bu bölümde açıklanan yordamı Harvard Üniversitesi'nde nano sistemleri (CNS) için merkezi gibi bir standart Üniversitesi temiz oda tesisi kullanılmak için tasarlandı. Bu tesis hem de benzer İmkanlar çapında Amerika Birleşik Devletleri, örneğin, bölüm, Ulusal Nanoteknoloji altyapı ağı (Ulusal Bilim Vakfı (NSF) tarafından desteklenen NNIN) olarak dış kullanıcıları için erişilebilir. Bu özellikleri, Araçlar, araç ve malzeme bu bölümde açıklanan birçoğu erişim temiz oda tesisi ile birlikte sağlanan ve ayrı satın alma gerek duymaz.
Dikkat: Kafes elektronik fabrikasyon kullanılan kimyasalların tehlikeli, direnir, CD-26, sökücü PG, SU-8 Geliştirici ve çözüm aşındırma Ni de dahil olmak üzere çoğu. Bu kimyasalların kullanmadan önce malzeme güvenlik bilgi formları (MSDS) başvurun ve uygulamak ve uygun güvenlik önlemleri her zaman izleyin.
- Termal olarak 100 buharlaşır Ni nm üzerine temiz bir Si gofret.
Not: Tipik ifade temel 5 x 10-7 T baskısı ve 1-2 Å/s hızı parametreleridir. Ni ince tabaka daha sonra kafes elektronik gofret serbest bırakmak için çözülmüş kurbanlık bir katman olarak hizmet vermektedir. - İlk PL maskesi (PL maskesi-1) SU-8 negatif fotorezist (Şekil 2A) ile mesh elektronik tabakası pasivasyon alt tanımlamak için kullanın.
Not: PL içinde ultraviyole (UV) ışık ışığa duyarlı bir substrat düzenlenen bir maske üzerine tuttu standart microfabrication bir tekniktir. Işık ya yapar çözünmez (negatif direnir) veya çözünür (pozitif direnir) maruz kalan alanlar üzerinde belgili tanımlık substrate. Maskeler bilgisayar destekli tasarım (CAD) yazılımında çizilmiş ve sonra genellikle bir satıcıdan sipariş. Bir maske aligner bir yüzey üzerinde mevcut kalıpları için maskeleri hizalayın ve onları UV ışığına maruz için kullanılır. Kafes elektronik imalatı dört farklı maskeleri (PL-PL maskesi-4 maskesi-1) gerektirir. İstek üzerine veya kaynak sitesinden maskesi tasarımlarımız mevcuttur meshelectronics.org.- Spin-kat SU-8 2000.5 negatif fotorezist gofret için yaklaşık bir SU-8 kalınlığı 400-500 Nm 4000 devirde üzerine.
- Yumuşak gofret 1 dk 1 dk 95 ° C'de ardından 65 ° C'de bir ocağın üzerinde pişirin
- Gofret içine SU-8 PL maskesi-1 alt kafes SU-8 katmana karşılık gelen ortaya çıkarmak için bir maske aligner yükleyin. Bir i-line (365 nm dalga boyu) doz 100 mJ/cm2maruz.
- Yazı fırında 1 dk 1 dk 95 ° C'de ardından 65 ° C'de bir ocağın üzerinde gofret
- Gofret SU-8 geliştirici bir tepsi içinde bırakın. SU-8 mesh desen tam olarak gelişmiş kadar hafifçe 2 min için çözüm tahrik. İzopropil alkol, 1 min ve darbe kuru için bir tepsi içinde yıkayın.
- Sert gofret 1 h için 180 ° C'de bir ocağın üzerinde pişirin.
Not: SU-8 150 ve 250 ° C geliştirme takip arasında pişmiş normalde zor olmasıdır. Sabit fırında geliştirme ve daha fazla Glossar sırasında mekanik istikrarı sağlamak için SU-8 oluşabilir herhangi bir yüzey çatlak anneals. Sert fırın 180 ° c 190 ° C için üst ve alt SU-8 tabaka için SU-8 katman kafes Elektronik için iyi sonuçlar verir.
- Kullanım PL maskesi-2 metal tanımlamak için ara bağlantı ve I/O yastıkları (Şekil 2B).
- Spin-ceket LOR3A gofret 300 yaklaşık kalınlığı için 4000 devirde üzerine nm.
Not: Polydimethylglutarimide tabanlı karşı koymak hangi hızları sonraki metallization işlem sırasında kırılması LOR3A var. - Gofret 180 ° c 5 min için bir ocağın üzerinde pişirin.
- Spin-ceket S1805 olumlu fotorezist 4000 devirde yaklaşık bir kalınlık 500 nm.
- Gofret üzerinde bir Pinar 115 ° c için 1 dk pişirin.
- Gofret S1805 PL maskesi-2 metal karşılık gelen ara bağlantıları açmak ve I/O yastıkları bir maske aligner yüklemek. 40 mJ/cm2h-line (405 nm dalga boyu) doz ortaya çıkarmak.
- Gofret CD-26 fotorezist geliştirici bir tepsi içinde bırakın. Yavaşça çözüm için metal desen bağlantılar kadar 1dk oldu tam gelişmiş bir tahrik. Deiyonize su (DI) tepsiye 1 dk ve darbe kuru için durulayın.
- 3 termal buharlaştırma Cr nm takip 80 nm au.
Not: En az 5 x 10-7 T temel baskısı ve 1 Å/s oranını ifade genellikle en iyi film kaliteli verim. - Metal tam olarak, metal yalnızca istenen ara bağlantı ve g/ç paneli bölgeleri kafes elektronik bırakarak kesme vuruşu kadar gofret sökücü PG yaklaşık 3 h için düz bir kabı içine bırakın. İzopropil alkol ve darbe kuru durulayın.
- Spin-ceket LOR3A gofret 300 yaklaşık kalınlığı için 4000 devirde üzerine nm.
- PL maskesi-3 Pt elektrot (Şekil 2C) tanımlamak için kullanın.
- 1.3.1 1.3.4 aracılığıyla adımları yineleyin.
- Gofret S1805 PL maskesi-3 Pt elektrot karşılık gelen ortaya çıkarmak için maske aligner yüklemek. 40 mJ/cm2h-line doz ortaya çıkarmak.
- Gofret CD-26 fotorezist geliştirici bir tepsi içinde bırakın. Pt elektrot desen tam olarak gelişmiş kadar yavaşça 1 dk. için çözüm tahrik. 1 dk ve darbe kuru için DI tepsisinde durulayın.
- Bir elektron ışını evaporatör mevduat 3 kullanın Cr nm takip tarafından 50 nm nk.
Not: Tipik ifade 5 x 10-7 T temel bir baskısı ve 2 oranı parametreleridir Å / s. - Metal tam olarak, sadece kafes elektronik istenen elektrot sitelerinde Pt bırakarak kesme vuruşu kadar gofret sökücü PG yaklaşık 3 h için düz bir kabı içine bırakın. İzopropil alkol ve darbe kuru durulayın.
- PL maskesi-4 SU-8 negatif fotorezist (Şekil 2B) ile mesh elektronik tabakası pasivasyon üst tanımlamak için kullanın.
- PL maskesi-4 üst passivating mesh katmanı SU-8 için karşılık gelen açığa dışında 1.2.1 1.2.5, aracılığıyla adımları yineleyin.
- Sert gofret 1 h için 190 ° C'de bir ocağın üzerinde pişirin.
Not: Bu sıcaklık 10 ° C altındaki SU-8 (adım 1.2.6) sabit fırında için daha yüksek olduğunu. Bu yüksek sıcaklık biraz alt SU-8, en iyi SU-8 katmanla birleştirmek ve böylece bir tek, sürekli SU-8 yapı oluşturmak neden akıyor.
- Elektronik kafes çoğu şimdi komple (Şekil 2E ve Şekil 3); Onları Si gofret Ni kurban katman çözülerek serbest bırakın.
- 50 W 1 dk. için gofret oksijen plazma ile tedavi. Bu hidrofilik yapma ve kafes içinde sulu çözüm kolayca askıya alınmasına izin SU-8 yüzey oksitlenir.
- Düz bir ölçek içinde hidroklorik asit, Demir klorür ve DI birleştirmek bir hacimsel oranı 1:1:20, sırasıyla, Ni etchant bir çözüm yapmak.
- Kafes elektronik tamamen Si gofret serbest bırakıldı kadar gofret Ni etchant çözüm yaklaşık 3 h için düz bir kabı içine bırakın.
- Pasteur pipet elektronik probları yayımlanan kafes Ni etchant DI bir 100 mL ölçek kabı aktarmak için kullanın. Kafes elektronik DI taze bir ölçek için durulama emin olmak için en az 3 kez aktarın.
- Kafes elektronik dezenfeksiyon için % %70/30 etanol/su çözüm aktarmak amacıyla Pasteur pipet kullanın, sonra durulama için steril su kafes elektronik aktarmak için pipet kullanın.
Not: Sterilizasyon sonra mesh elektronik functionalization için diğer çözümler için transfer edilebilir. Örneğin, hücresel yapışma teşvik etmek, kafes elektronik poli-D-lizin (1 mg/mL) 24 h için sulu bir çözüm için transfer edilebilir. - Kafes elektronik aktarmak için bir Pasteur pipet steril 1 x fosfat bir 100 mL ölçek kabı probları kullanım serum (PBS) enjeksiyon içinde vivoönce arabelleğe alınmış.
2. yükleme Mesh elektronik içine iğneler
- Olarak satın pipet sahibi her iki uçta da akmaya açıktır. Enjeksiyon sırasında (Şekil 4A) hiçbir sızıntı yani Epoxy, dairesel vida fastener karşısında son mühür. Devam etmeden önce sertleşmesine epoksi izin.
- Cam kapiller iğne pipet yuvasına takın. Dairesel sıkma vidalı ve koni çamaşır makinesi (figür 4B) kullanarak yerine sabitleyin. 400 µm iç çapı (650 µm dış çap) cam kapiller iğne bu iletişim kuralı için kullanıldı. Kapiller iğne malzemelerde (Örn., metal) ve çapları kullanılmış olabilir ama injectability emin olmak için kafes elektronik tasarımını değişiklikler gerektirebilir.
Not: 1.17 mm iç çap (1.5 mm dış çap için 250 µm) 150 µm arasında değişen kılcal iğneler bizim laboratuvar olarak kullanılmaktadır. Enjeksiyon daha küçük iğneler aracılığıyla kavşak açı enine ve boyuna SU-8 kafes öğeleri arasındaki keskinleşmişti yapma, SU-8 kafes öğelerin genişliğini azaltarak, ince SU-8'i kullanarak ve bir kaba kullanarak terfi (i.e., daha büyük birim hücre) yapısı kafes. Photomasks daha küçük kılcal iğneler isteği veya kaynak sitesinden için tasarlanmış kafesler için meshelectronics.org. Cam kılcal iğnelerle 400 µm bir iç çapı ve 550 µm dış çapı da ticari olarak kullanılabilir. Bunlar iğne ile uyumluluğunu sürdürmek 400 µm iç çap gerektiren kafesleri, ama onlar burada açıklanan çalışmaları için kullanılan değildi neden akut doku hasarı azaltmak. - 1 mL şırınga Kılcal boru 2 – 4 cm uzunluğunda kullanarak pipet sahibi yan prizine takın.
- Cam kapiller iğne kafes elektronik içeren PBS 100 mL kabı yerleştirin. Elektronik araştırma ve el ile bir kafes elektronik sonda (Şekil 5 ve ek Video 1) iğne çekmek için belgili tanımlık tenkıye geri çek bir kafes I/O yastıkları yakınındaki iğne getirin.
Not: I/O yastıkları kök Interconnect bölge ve kafes aygıt bölge vardır çıplak gözle tarafından kolayca tanımlanabilen kafes elektronik probları çözümde askıya alınır. Bu iğneler doğru yönlendirmeye sahip kafes elektronik net yükleme sağlar. - İtme/çekme kafes elektronik iğne içinde konumunu ayarlamak için hala salin dalmış iken şırınga pistonu.
Not: Ideal konumlandırma ile mümkün olduğunca iğne sonuna yakın ultraflexible kafes aygıt bölge var. Bu yapılandırmayı beyine aygıt bölge ilk enjekte güvence altına alınması ve I/O yastıkları son zerk edilecek sıvı hacmi en aza indirir. - Dikkatle pipet sahibinin yan prizinden Kılcal boru bağlantısını kesin. Yavaş yavaş iğne içinde kafes elektronik konumunu değiştirmek bir emiş gücü oluşturma önlemek için bağlantısını kesin.
3. stereotaksik Mesh elektronik enjeksiyon canlı fare beyin içine
Not: 75 mg/kg ketamin ve 1 mg/kg dexdomitor karışımı ile mayi enjeksiyonla fareler anestezi. Anestezi diploma ameliyat başlamadan önce ayak çimdik yöntemi ile doğrulandı. Vücut ısısı 37 ° C homeothermic battaniye iken anestezi altında üzerinde fareyi yerleştirerek devam edildi. Isıyla için tüm metal cerrahi aletler 1 kullanılmadan önce s için dahil olmak üzere, steril eldiven kullanarak, bir sıcak boncuk Sterilizatör ameliyat, steril bir alan bakım kullanarak ameliyatı için uygun steril tekniği uygulanmıştır Cerrahi sitesi, % 70 etanol ile plastik aletleri dezenfeksiyon ve depilated kafa derisi çevresinde cilt kesi önce iodophor ile çalışmaya hazır. Ameliyat, sonuç sonra hayatta kalma ameliyatlarında yaranın antiobiotic merhem uygulandı ve fare yastık Isıtma 37 ° C ile donatılmış bir kafes döndürüldü. Sternal recumbency korumak için yeterli bilinci yerine kadar fareler katılımsız terk. Fareler buprenorfin analjezi mayi enjeksiyon yolu ile ilâ 72 h için ameliyatı takiben 0,05 mg/kg vücut ağırlığı her 12 h bir doz verildi. Fareler ameliyatı takiben diğer hayvanlardan izole edildi. Fareler euthanized Fentobarbital 270 mg/kg vücut ağırlığı bir doz, her iki mayi enjeksiyon veya transcardial perfüzyon ile (bkz. Adım 6.1). Müfettişler Geiger, et al. şu anlamlara gelebilir 30, Kirby, vd. 31ve Gage, ve ark. 32 kemirgen stereotaksik cerrahi hakkında ayrıntılı bilgi için.
- Fare anestezi ve stereotaksik çerçevede düzeltebilirim.
- Oküler yağ kuruluk anestezi iken altında önlemek için fareyi'nın gözleri uygulanır.
- Bir diş matkap ve stereotaksik çerçeve bir kranyotomi kafatası üzerinde istenen koordinatlarda açmak için kullanın. Enjeksiyon sitesinden bir paslanmaz çelik topraklama vida veya tel ekleme için ikinci bir kranyotomi açın.
- Kafatasında bir sıkma substrat diş çimento ile düzeltmek. Yaklaşık 1 mm geniş boşluğa yordamda daha sonra katlama adım güvenilirliğini geliştirmek amacıyla substrat kesti.
Not: (0,18 ± 0.05 mm kalın kablolar için tasarlanmış) sıfır ekleme kuvvet (ZIF) Bağlayıcısı 32 kanal için doğru kalınlığı oldukları gibi birçok malzeme çalışmaya devam eder, ancak bir "L" şekil için iyi çalışıyor (Şekil 7A), düz esnek kablo (FFC) kesti. - Pipet tutucu bir dik açı sonunda kelepçe (Şekil 4 c ve Şekil 6A) kullanarak stereotaksik çerçeve üzerine mesh elektronik içeren iğne ile bağlayın.
- Kullanarak bir şırınga pompa (Şekil 6D) tutturulmuş bir 5 mL şırınga pipet sahibinin yan çıkış eklemek bir yaklaşık 0,5-1 m uzunluk Kılcal boru.
Not: pipet sahibine bağlanmadan önce Kılcal boru içinde hava kabarcığı yok olduğundan emin olun. Kabarcıklar enjeksiyon sırasında akışını kesme ve kafes elektronik düz, kontrollü teslimini önlemek. - Stereotaksik çerçeve iğne ucu istenen başlangıç yeri beyin içinde konumlandırmak için kullanın.
Not: burada kullanılan kafes elektronik probları bir uzunluğu, ca. yaymak elektrotlar kayıt ile tasarlanmıştır 2 mm ve ilk elektrot ile bulunan ca. 0,5 mm mesh elektronik ( Şekil 3A, en sol kenar) başlangıç kenarından. Bu nedenle, başlangıç konumu 0,5 mm faiz beyin bölgesi derin öyle ki stereotaksik koordinatları seçilmesi gerekir. Yayılmış ve kayıt elektrotları kafes elektronik içinde konumunu maskesi tasarım işlemi sırasında serbestçe seçilebilir ve onların stereotaksik enjekte edilir gibi beyin region(s) ilgi kayıt elektrotları yayılan bu yüzden seçilmelidir bir atış güzergahı. - Kafes elektronik sonda cam iğne içinde üst görüntülemek için kamerayı (Şekil 6B) yerleştirin. Biraz bilgisayar yazılımı üstünde belgili tanımlık perde-kafes elektronik özgün konumunu işaretlemek için bir çizgi çizmek kullanıcı sağlar.
- Akışını başlatma şırınga pompa düşük bir hız ayarı ve Başlat tuşuna basın. 10 mL/h tipik bir başlangıç akış hızı 400 µm iç çap kapiller iğne var. Kafes elektronik sonda iğne içinde hareket etmezse yavaş yavaş akış oranını artırın.
Not: Bu enjeksiyon yeri çevreleyen doku zarar beyne enjekte sıvı hacmi en aza indirmek önemlidir. En iyi sonuçları ile enjeksiyon birimleri elde enjekte kafes uzunluğu 1 mm başına 25 µL. Bu birimin yarısından daha az ideal değerlerdir; Bizim Laboratuvar genellikle 10-50 µL enjekte 4 mm mesh uzunluk başına enjekte. - İğne içinde taşımak kafes elektronik soruşturma başlatılırken, stereotaksik çerçeve iğne ile kafes elektronik sonda, kafes elektronik işaretli özgün konumunu bir kılavuz olarak kullanarak enjekte aynı hızda geri çekmek için kullanın.
Not: görevlisinideponun veya çıkması mesh elektronik hassas teslim edilmek üzere hedeflenen beyin bölgesi olarak adlandırdığı görüş alanı (FoV) enjeksiyon yöntemi25, bu yordam sağlar. Kafes elektronik sonda iğne içinde hareket başladıktan sonra sık sık akış hızı azalır. Bizim Laboratuvar, ancak 20-30 mL/h debi kez mesh ve kapiller iğne duvarlar arasında statik sürtünme üstesinden gelmek için gerekli enjeksiyon süreci başlatılan bir kez oranı sonra 10 mL/h için azaltılmış olabilir. Debi ve enjeksiyon birimleri daha küçük çaplı kapiller iğneler için genellikle küçüktür. - Tuzlu su akan ve iğne kafatası çıkıldığı kadar iğne geri çeker devam ediyor. Enjektör pompası akışını durdurmak.
4. giriş/çıkış arabirim
Not: Bu noktada, kafes elektronik sonda seçilen yörünge boyunca beyin içinde istenen başlangıç noktasından enjekte edilmiştir. İğne geri çektiği ve hemen üzerinde elektronik bağlantılar Fileli kranyotomi beyinden iğne ve g/ç için yastıkları hala içeride iğne (7B rakam) kapsayan. Bu bölüm bir baskılı devre kartı (PCB; kullanır Kafes elektronik sonda için arabirim için Şekil 7, Şekil 8). PCB ZIF konnektörü standart 32 kanallı amplifikatör bağlantı ucu baş-sahne sinirsel kayıt deneyler için bir yalıtım substrat yoluyla bağlanır. PCB çeşitli baş-sahne yapılandırmaları karşılamak için özelleştirilebilir. İstek üzerine veya kaynak web sitesi, meshelectronics.org, ve bizim tasarım dosyaları kullanılabilir PCB PCB İmalat ve montaj hizmetleri satıcılardan ucuza satın almak için kullanılabilir.
- Dikkatle iğne substrat sıkma FFC yol göstermesi için stereotaksik çerçeve kullanın ve boşluk arasında bolluk kafes elektronikte oluşturmak için şırınga pompa ile çözüm akan bağlantılarını (Şekil 7C).
- İğne sıkma substrat yukarıda ve boşluğu arasında olduğunda, hızlı bir oranda kafes elektronik I/O yastıkları sıkma substrat (Şekil 7 d) üzerine çıkarılacak akış devam.
- Cımbız ve DI pipet kullanarak, ca. 90 ° açı ilk I/O pad mümkün olduğunca yakın I/O yastıkları bükebilir.
Not: Bükme bir sonraki adımda bir PCB ZIF konnektörüne sokulacak yastıkları izin vermek gereklidir. Gibi kafes elektronik sonda 32 I/O yastıkları bir kusurlu 90 ° dirsek bu yüzden veya hemen önce belgili tanımlık ilk I/O yastık, gerçekleşmiyor viraj I/O yastıkları ( Şekil 7Een soldaki yastıkları) kesmek almakla sonuçlanır ZIF konnektörü tam olarak aynı genişlikte olduğundan. - Bir kez I/O yastıkları hizalanır, onları yavaşça akan ile yerine basınçlı hava gelişeceğini ve kafes kök, Kuru için 90° açıyla.
Not: elektronik az 32 kanallı probları Mesh için aynı 32 kanal arabirim kurulu ile senitehlikeye. Örneğin, laboratuarımıza 32 kanal PCB ile elektronik probları 16 kanal kafes yaygın olarak kullanır. Bu arabirim kolaylaşır ZIF konnektörü içinde fazladan boşluk sağlar ve ek uncontacted kanalları aracılığıyla oturum kayıt sırasında test empedans kolayca açık devreler tanımlanır. - Düz kenarlı yaklaşık 0,5-1 mm I/O yastıkları kenarından, sıkma substrat kesti. Ayrıca yabancı PCB monte 32 kanal ZIF konnektörü (Şekil 7F) içine ekleme engel olacak sıkma substrat kısımlarını kesin.
- I/O yastıkları PCB ZIF konektörüne takın ve mandal (Şekil 7 g) kapatın. Kullanım ölçüm elektronik kanallar ve başarılı onaylamak için zemin vida arasında empedans ölçmek için arabirim. Empedans değerleri çok yüksek ise, ZIF konnektörü çekebilirsen, ekleme noktasını ayarlamak ve başarılı bağlantı doğrulanır kadar tekrar test.
- ZIF konnektörü kapağı ve maruz kafes elektronik koruma için diş çimento arasında bağlantı yapan operatördür. PCB substrat boşluğu, flip ve PCB üzerine fare kafatası (Şekil 7 H) çimento ile düzeltmek.
Not: gap, FFC bükme bazen elektronik bağlantılar kafes zarar verebilir mekanik zorlanma azaltır. - Sertleşmesine, çimento sağlam, kompakt baş-için bir sahne sırasında sonraki kayıt oturumları (Şekil 7I) arabirim içine PCB bırakılmasına izin.
5. sinirsel kayıt deneyler
- Fareyi bir tailveiner veya diğer restrainer33yerleştirin. PCB pre amplifikatör head-sahne PCB standart amplifikatör konektörüne takın. Başvuru vida zemin için ayrı bir kablosu.
- Ölçülü kayıtları için fare restrainer içinde bırakın. İstediğiniz zaman dönemi (Şekil 8A) için veri edinme sistemi kullanarak verileri kaydetmek.
- Serbestçe kayıtları taşımak için fareyi restrainer gelen pre amplifikatör PCB ekleme ve başvuru vida topraklama sonra bırakın. Kayıt için istenen süreyi fare özgürce davranır veri toplama sistemi kullanarak (Şekil 8B).
- Belgili tanımlık yazmak oturum sonunda, gerekirse geri restrainer içinde fare koymak. Topraklama tel ve pre amplifikatör, kaldırmak sonra geri onun kafes için fare düğmesini bırakın ve sonraki kayıt oturumu kadar hayvan tesise geri getirin.
6. histolojik kesit, boyama ve görüntüleme
- İstenen saat sonrası enjeksiyon kadar bekleyin, sonra fareyi anestezi ve transcardially sıvı formaldehit ile. Kaldır, donma ve cryosection 10 µm kalınlığında dilimler halinde beyin. İmmünhistokimya ve kemirgen beyin dokusunun cryosectioning detaylı bir protokol Evilsizor içinde bulunabilir ve ark. 34.
Not: beyin dokusu kafes elektronik içeren sabit ve izleme elektronik içeride kaldı rağmen normalde, kesitli. Bu hangi kesit önce kaldırılması gerekir ve bu nedenle doku değiştirme veya sonda-doku arabirimi çözümlemek güçleşebilir geleneksel sinirsel probları için karşılaştırıldığında benzersiz bir yetenektir. - Donmuş beyin doku bölümlerde 3 kez 1 x PBS durulayın.
- Bir çözüm bölümlerde % 0,3 Triton X-100 ve % 5 keçi serum 1 x PBS içinde kapatın. Oda sıcaklığında 1 h için oturup bekleyin.
- Birincil antikorlar ve çözüm bölümlerini kuluçkaya. Burada kullanılan birincil antikor çözümleri tavşan anti-NeuN (1: 200 seyreltme), fare Anti-Neurofilament (1: 400 seyreltme) ve fare anti-GFAP'nin (1:500 seyreltme) ile % 0.3 Triton X-100 ve % 3 keçi serum vardı. Gecede 4 ° C'de kuluçkaya
- 1 x PBS ile 40 dk 9 kez olmak üzere toplam bölümlerini durulayın.
- İkincil antikorlar beyin kısımları ile çözüm kuluçkaya. Burada kullanılan ikincil antikor çözümleri Alexa Fluor 488 keçi Anti-tavşan (1: 200 seyreltme), Alexa Fluor 568 keçi Anti-fare (1: 200 seyreltme) ve Alexa Fluor 647 keçi Anti-sıçan (1: 200 seyreltme) idi. Oda sıcaklığında 1 h için bölümleri kuluçkaya.
- 9 kez olmak üzere toplam bölümler 30 dk 1 x PBS ile yıkayın.
- Bölümleri cam slaytlarda antifade mountant kullanarak coverslips ile bağlayın. Slaytlar için en az 24 saat önce görüntüleme karanlıkta bırakın.
- Slaytları 488 kullanarak confocal mikroskopla görüntü nm, 561 nm ve Alexa Fluor 488 için uyarma kaynağı olarak 633 nm lazerler, Alexa Fluor 568 ve Alexa Fluor 647, anılan sıraya göre. Fark girişim kontrast (DIC) mesh elektronik görüntü için aynı mikroskop sonraki overlaying görüntüleri ve analiz için kullanırsınız.
Representative Results
Sonuçları çalışma, hedeflenen beyin bölgesi, geçen zamandan beri enjeksiyon, enjeksiyon ve başarı g/ç yordamı, diğer faktörler arasında arayüz oluşturma sırasında verdirdiler Akut hasar miktarı hayvan türlerinin göre değişir. Tek-unit spiking etkinlik için 1 hafta sonra enjeksiyon ve Spike'ı genlikleri için 4-6 hafta kadar değişebilir (durumunda 150 µm iç çap iğneler) 1 güne kadar görünmeyebilir. Şekil 9 hipokampus ve yetişkin erkek C57BL/6J fare primer somatosensor korteks enjekte bir 32 kanal kafes elektronik sonda temsilcisi elektrofizyolojik verileri gösterir. Yaklaşık 300-µV genlik yerel alan potansiyelleri (LFPs) tüm 32 kanallarda kaydedildi ve tek-unit spiking etkinliği 26 kanallarda kaydedildi. LFPs ve izole sivri benzer kayıt elektronik ve nöronlar arasında son derece kararlı bir arabirim genişletilmiş bu dönem içinde düşündüren 2 ve 4 ay arasında kaldı. Şekil 10 histolojik kesit temsilcisi sonuçları ve beyin dokusu kafes elektronik enjeksiyon sonra 1 yıl içeren immunostaining gösterir. NeuN, sinirsel somata ve neurofilament, sinirsel aksonlar için bir işaretleyici bir marker için boyama doku yoğunluğu kafes elektronik ve beyin dokusu arasında kesintisiz arabirim ima enjeksiyon yerinde küçük hiçbir kaybı ortaya koymaktadır. GFAP'nin (astrocytes için bir işaretleyici) için daha fazla boyama astrocytes kafes elektronik, varlığını küçük kronik immün yanıt aydınlığa çıkartıyor gösteren çevresinde düzeyde yakınındaki arka plan ortaya koymaktadır.
Resim 1: bir şırınga-enjekte edilebilir adımda mesh elektronik deney. Bu iletişim kuralı kafes elektronik kullanarak tipik kemirgen sinirsel kayıt denemede tüm anahtar adımları açıklar. Deneyler genellikle, uygulama, kafes elektronik imalat (1), (2) kapiller iğneler, içine kafes elektronik yüklenmesini sırasına göre kafes elektronik (3) stereotaksik enjeksiyon beyin (4) elektrik I/O mesh için arayüz oluşturma içine gerektirecektir Elektronik, (5) ölçülü veya serbestçe hareket kayıtları ve (6) kafes/doku kesit ve histoloji için boyama. Bazı çalışmalarda, yalnızca Histoloji verileri, bu durumda adımları (4) ve (5) atlanır olabilir istenen olmak. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 2: şematik, Tak ve kullan ağ elektronik ultraflexible aygıt bölgesi (üst satırı) için üretim yordamı gösteren kök bölge (orta sıra) ve I/O bölge (alt satır) arasında bağlantı yapan operatördür. (A)SU-8 negatif fotorezist (kırmızı) PL maskesi-her Tak ve kullan ağ elektronik sonda tabakası pasivasyon alt tanımlamak için 1 ile desenli. (B) desenlendirme PL maskesi-2, termal buharlaşma ve metal kalkış tanımlamak Au arasında bağlantı yapan operatördür ve I/O yastıkları (altın). (C) desenlendirme PL maskesi-3, elektron ışını buharlaşma ve metal kalkış ile Pt elektrot (mavi) tanımlayın. (D) SU-8 negatif fotorezist (kırmızı) PL maskesi-üst passivating tabaka tanımlamak için 4 ile desenli. SU-8 açıklıklar her Pt elektrot ve I/O pad kalır. (E) A tamamlandı üst, orta ve alt satır genişlemiş konumları gösteren kesik kutuları ile elektronik sonda kafes. Photomask tasarım dosyaları bulunmaktadır, istek üzerine yazarlar veya kaynak sitesinden meshelectronics.org. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 3: fotoğrafları ve Tak ve kullan görüntülerini optik mikroskop mesh elektronik. (A)optik mikroskop görüntüleri bir şırınga enjekte edilebilir kafes elektronik sonda ile Tak ve kullan I/O döşenir. Şekil 2 ' deki ama Ni kaplı substrat açıklamasından önce fabrikasyon tamamlanması adımları sonra sonda görüntüsü. Kesikli kutuları soldan sağa ultraflexible aygıt bölge, kök ve I/O bölge C, D ve E, sırasıyla büyütülmüş bölümlerine karşılık gelir. Ölçek çubuğu 1 mm. (B) = 20 tamamlandı içeren bir 3 inç büyüklüğündeki LCD Si gofret fotoğrafı mesh elektronik sondalar. Ölçek çubuğu = 20 mm. (C) optik mikroskop resim 20 µm çapı Pt kayıt elektrot ultraflexible aygıt bölgesinde. Ölçek çubuğu = 100 µm. (D) optik mikroskobu görüntüsü yüksek yoğunluklu Au arasında bağlantı yapan operatördür kök bölgesinde. Her Au Interconnect elektriksel olarak yalıtılmış ve tek bir Pt elektrot bir tek I/O pad'e bağlanan. Ölçek çubuğu = 100 µm. (E) optik mikroskop resmi I/O yastıkları. Her pad daraltılabilir kafes bölge ve kök üzerinde bulunan sürekli bir ince film bölge oluşur. Sigara iletken SU-8 şeritler birlikte uyum sağlamak için yastıkları kafes bölümlerini bağlamak. Ölçek çubuğu 200 µm. = Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 4: derleme kapiller iğneler enjeksiyon sırasında tutmak için cihaz. (A)fotoğraf cihazları bileşenlerinin. Pipet tutucu ve pipet sahibi için (4) bir koni çamaşır makinesi (1) cam kapiller iğne, (2) bir pipet sahibi, (3) bir dairesel vida fastener bileşenler içerir. Öğeler (2) (4) arasında bir pipet sahibi satın alma işlemine dahil edilir. Oku epoksi ile kapalı yapıştırılmış gereken pipet sahibinin çıkış işaretler. (B) Fotoğraf montaj ve cam kapiller iğne ekleme sonra pipet sahibinin. Eklenen Epoksi (okla işaretli) pipet sahibinin en iyi çıkış, görülebilir ve Kılcal boru pipet tutucu bir şırınga (gösterilmez) bağlanır. (C) pipet tutucu ve kapiller iğneyi dik açı sonunda kelepçe ile stereotaksik çerçeve eki sonra fotoğrafı. Ölçek barlar vardır 1 cm. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 5: kafes elektronik cam iğne yükleme. (A)Tak ve kullan ağ Elektronik için yükleme yordamı şematik gösterimi. Çözümde askıya alınmış durumdayken bir cam iğne bir kafes elektronik sonda I/O sonuna yakın konumlandırılmış. Şırınga pistonu sonra el ile mesh elektronik soruşturma çizmek için çekildi. Ultraflexible aygıt bölgesinin sadece içine iğne sonu ile ideal konumlandırma olduğunu. (B) fotoğraf (A) karşılık gelen bir cam iğne yüklenen bir kafes elektronik inceleyebilirsek. Ölçek çubukları 2 mm. = Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 6: şematik stereotaksik cerrahi istasyonu. Ekli pipet sahibi ile motorlu stereotaksik çerçeve(a)iğne istenen beyin bölgesini konumlandırmak için kullanılır. İğne ve yüklü kafes elektronik konumunu bir objektif lens ile izlenir ve kamera (B) bağlı ve (C) bir bilgisayarda görüntülenir. Bir şırınga pompa (D) serum hassas birimleri bırakmak istediğiniz beyin bölgesi içine kafes elektronik doğru kontrollü enjeksiyon için iğne, üzerinden akışı. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 7: yordam arabirim Tak ve kullan I/O. (A)bir substrat sıkma FFC diş çimento kranyotomi için bitişik ile sağlanır. (B) Tak ve kullan ağ elektronik Stereotaxic FoV yöntemiyle istenen beyin bölgesi enjekte. (C) iğneyle mesh I/O yastıkları elektronik hala içinde yoklama, substrat sıkma FFC yeniden konumlandırılmış. (D) akış I/O yastıkları substrat sıkma FFC üzerine çıkarmak için iğne aracılığıyla sürdürülür. (E) göre yürütülmesi yüzü yukarı bakacak şekilde gelişeceğini ve yerde kurutulmuş kök bükülmüş 90 ° I/O yastıkları vardır. (F) FFC substrat makasla bir düz çizgi ca. için 0,5 mm I/O yastıkları kenarından kesildikten. Aşırı substrat kesilir uzak bir 32 kanal ZIF konnektörü içine ekleme izin vermek için. (G) g/ç yastıkları üzerinde özel bir PCB monte 32 kanal ZIF konnektörü eklenir. ZIF konnektörü yapmak için kapalı kilitli I/O yastıkları ile iletişim. (H) mandal çimentolu kapalı, PCB kafatası Kuzey değil ve PCB yerde diş çimento ile sabittir. (ben) PCB kompakt bir headstage ile bir standart amplifikatör bağlamak için oturum kayıt sırasında kolay arabirim oluşturur. Ölçek çubukları 1 cm. = Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 8: ölçülü ve serbestçe hareket kayıtları. (A)kayıt oturumu sırasında bir restrainer bir erkek C57BL/6J fare fotoğrafı. 32 kanal pre amplifikatör PCB standart amplifikatör konektöre ekledi. (B) aynı fare özgürce hareket kayıt deney sırasında PCB 32 kanal pre amplifikatör ile fotoğrafı. Ölçek çubukları 1 cm. = Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 9: temsilcisi sinirsel kayıt sonuçları. (A)temsilcisi LFP ısı haritaları 32 kanal üzerinden mesh elektronik probları farenin hipokampus ve somatosensor korteks enjekte. Fare özgürce 2 ay (üst) ve 4 ay (alt) sonrası enjeksiyon onun kafes araştırdı iken veri kaydedildi. LFP genlik renk çubuğunun sağ göre renk kodlu. Yüksek geçiren filtre uygulanmış izlemeler spiking faaliyet gösteren (siyah) üzerinde spektrogram her 32 kanal için overlaid. (B) sivri verileri sıralama (A) çizilen sonra izole. Tek-unit spiking etkinlik 32 kanal 2 ay sonrası enjeksiyonu (üst) ve 4 ay sonrası enjeksiyon (alt) 26 tarihinde algılandı. Her küme sivri Yukarıdaki sayıların kanal numaraları (a) karşılık gelir. Bu rakam Fu, et al. değiştirildi 28. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 10: temsilcisi Histoloji sonuçları. (A)şematik kafes elektronik yatay (orta Masası) içinde yönünü gösteren ve sagittal (alt paneli) beyin dilimleri. (B) Floresan mikroskop imge-in 10 µm kalınlığında kortikal beyin dilim bir yıl sonra bir 16 kanal kafes elektronik sonda enjeksiyon. Dilimi NeuN (yeşil) için immunostained oldu. (C) aynı beyin dilim immunostained neurofilament (kırmızı) için. (D) aynı beyin dilim immunostained GFAP'nin (mavi) için. Kafes elektronik/doku gösterilen (E) A bileşik görüntü (b) ile (D) etiketli NeuN ile (yeşil), neurofilament (kırmızı), GFAP'nin (mavi), arayüz ve elektronik (mavi) kafes. Ölçek çubukları 100 µm =. Bu rakam Fu ve ark. değiştirildi 27. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Ek Video 1: tekrar yükleme ve kafes elektronik enjeksiyon çözüm içine. Bu dosyayı indirmek için buraya tıklayınız.
Discussion
Tüm adımları fabrikasyon ve kafes elektronik kullanımı önemlidir, ancak birkaç özellikle önemlidir. Onların gofret üzerinden mesh elektronik serbest bırakmadan önce kolayca sulu çözüm (adım 1.6.1) askıya kafes yapmak için yüzeye okside esastır. Bu adım atlanır, kafesler genellikle iğneler, yük zorlaştırır su yüzeyinde yüzen ve onlar-ebilmek var olmak yüklü, onlar genellikle cam iğneler taraf için sopa geniş hacimli gerektiren (> 100 µL) enjeksiyon için. Hata açıklaması, bu nedenle, genellikle kafesler kullanılamaz anlamına gelir önce yüzey okside ve fabrikasyon başından itibaren yeniden gerçekleştirilen olması gerekir. Başka bir önemli adım kafes elektronik "(adım 4.3) arayüz oluşturma sırasında g/ç ~ 90 ° için kök" bükme. Açı 90 ° den az ise, tüm 32 I/O yastıkları ZIF konnektörü sığmaz; Bazı bağlı elektrotlar sayısını azaltarak ekleme, izin için ucunu kesmek zorunda kalacak. İşlem ayrıca yavaşça kök kesilmesini önlemek için yapmanız gerekir.
Kafes elektronik tasarım için çeşitli uygulamalar photomasks değiştirerek ve Şekil 2' de özetlenen aynı imalat yordam kullanılarak özelleştirilebilir. Şekil 9 ' da verileri kaydetmek için kullanılan kafes elektronik probları 32 kayıt elektrotlar farenin hipokampus ve primer somatosensor korteks span için tasarlanmış, örneğin, elektrot yerleştirme ultraflexible kafes içinde olabilir hemen her beyin region(s) hedeflemek için seçilen veya uyarılması için daha büyük elektrotlar dahil27olabilir. Aynı temel kafes yapısı ve üretim prosedürü korunur, ancak elektrot yerleşim ve tasarım çalışma ihtiyaçlarını karşılamak için ayarlanır. Müfettişler dikkatli olun, test ancak ve her zaman değiştirilmiş tasarımları kolayca hedeflenen iğne enjekte edilebilir. Kafes elektronik bükme mekaniği küçük değişiklikler injectability üzerinde önemli etkileri olabilir. Böyle bir örnek uysalca enjekte edilebilir bir kafes elektronik sonda enine ve boyuna SU-8 şeritler arasında 45 ° açı verir ancak 90 ° açı crumples ve iğneler21takunya birinde sonuçları var.
Kayıt elektrot empedans ölçüm sorun giderme için yararlıdır. 20 µm çapı dairesel Pt elektrot bir frekansta 1 kHz vivo içinde veya PBS29x 1 kullanılarak ölçülen 1 MΩ yakınındaki bir empedans büyüklükte olmalıdır. Bundan daha önemli ölçüde daha büyük bir empedans elektrot maruz değil, Eğer fotorezist kalıntı ile kirlenmiş olabilir gibi ya da değil elektriksel olarak bağlı olduğunu gösterir. İkinci Örneğin, varsa, toz fotoğraf maskeyi bir kopukluk au sonuçlarında arasında bağlantı yapan operatördür PL sırasında ya da bir kafes I/O yastıkları ZIF konnektörü pin tarafından I/O arabirim sırasında değil kurulursa oluşabilir. Bir empedans büyüklüğü yaklaşık yarım beklenen değer birbirine paralel iki elektrot impedances bir devre oluşturma bitişik bir kanal kısa devre göstermektedir. Ölçülen empedans değerlerinin bir kılavuz olarak sorun giderme sırasında davranmak; kafes elektronik probları optik mikroskobu ile birlikte, sorunun kaynağı genellikle olabilir tespit ve buna göre düzeltilmiş sonraki üretim çalıştırmak veya I/O arabirim girişimi.
Tek-unit spiking etkinliği genellikle 1 hafta sonrası enjeksiyon27kadar gözlenen değil bu sorun kolayca üstesinden gelmek son çalışması (yayınlanmamış) gösterir, ancak şırınga enjekte edilebilir kafes elektronik Kullanım akut çalışmaları için sınırlı olmamasıdır. Etkinlik spiking mesh görmek için gereken süre önemli belirleyicileri tasarım, bunlar doku hasarı sırasında derecesini etkileyecektir birlikte mesh elektronik beyin ve enjeksiyon için kullanılan iğne çapını içine enjekte sıvı hacmi Enjeksiyon ve iyileşme oranı. Kafes elektronik oksijen plazma Ni etchant sürümde önce ile tedavi değil büyük enjeksiyon birimler gerekli olabilir; diğer bir deyişle, mesh hidrofilik değilse, cam iğne için uygun. Zaman zaman, kafesler enjekte zorlaştırır mekaniği bükme için yol kusurları var. Yüklerken oluşan kafes elektronik kafesler kolayca ve sorunsuz içinde iğne ( ek Video 1' de gösterildiği gibi) hareket ediyor ki kontrol etmek önemlidir. Eğer değilse, bir farklı mesh elektronik sonda kullanılmalıdır. En iyi sonuçlar için sorunsuz sinirsel arayüz 10-50 µL enjekte kafes uzunluğu 4 mm başına ideal enjeksiyon hacimleri ile sağlanacaktır. Daha yeni sonuçları ile ince mesh elektronik sondalar enjekte ve/veya spiking o tek birim kısa bir süre sonra enjeksiyon (akut ölçüler) görülebilir daha küçük çapı kapiller iğneler (150 µm iç çapı, 250 µm dış çap küçük) göster daha uzun süreleri ile. Olan maske tasarım dosyaları bu ince gözenekli yapıları için kullanılabilir isteği veya kaynak Web sitesinden meshelectronics.org. Tahmin ettiğimiz verim 150 µm iç çapı ile (250 µm dış çapı daha yeni çalışmalarımız için % 80-90'a yakın olmasına rağmen 400 µm iç çapı (650 µm dış çap) iğneler yaklaşık % 70, kullanarak vivo içinde kafes enjeksiyon prosedürlerimiz genel verimi ) iğneler. Hatasının en sık karşılaşılan nedenleri (mesh sorunsuz, enjekte değil ki 1 (2) mesh kırılması gereken el ile işleme sırasında beyin içine beyin ödemi beklenmedik bir şekilde büyük enjeksiyon birimlerden sonuçlanan) içinde g/ç yordamı ve (3) arabirim vardır. enjeksiyon sırasında bir kan damarı zarar kanama. Nadir bir kan damarı enjeksiyon sırasında zarar (neden hataları daha az % 10) ve azaltılmış görüntü destekli cerrahi kullanarak daha fazla. Biz de kan damarlarının hasar tüm yordamları enjeksiyon transfection için viral parçacıkların, katı beyin probları implantasyonu ve kafes elektronik enjeksiyon dahil beyin dokusunun penetrasyon içeren ortak bir sınırlama olduğunu unutmayın.
Kafes elektronik probları Şekil 9 ve Şekil 10, sırasıyla gösterildiği stabil kayıt ve aynı bireysel nöronlar üzerinde en azından ay yıl zaman ölçeği için takip ve hemen hemen hiç kronik immün yanıt uyandırmak edebiliyoruz. Bu yaygın olarak spike genlikleri, kararsız sinyalleri ve kronik inflamasyon uzun süreli deneyler14, kayıt boyunca azalan acı Kongre derinlik elektrotları için karşılaştırıldığında önemli bir avantaj temsil eder 15. Ayrıca, kafes elektronik onlar dokusu histolojik kesit sırasında boyama, bırakılabilir ve görüntüleme, geleneksel probları aksine hangi are çok sert avantajı var ve bu nedenle Histoloji önce kaldırılması gerekir analizleri. Bu nedenle, kafes elektronik immunohistokimyasal analiz her kayıt site çevreleyen hücresel ortamı tam olarak çalışmaya benzersiz yeteneği kullanmak için izin.
Sunulan Protokolü burada açar-up yeni fırsatlar nörolojik heyecan verici. Minimal invaziv teslim yöntemi ve kafes elektronik beyin dokusu ile sorunsuz entegrasyon sinir devreleri kesintileri en aza indirir ve en tip-in kronik sinir kayıt deneyler faydalı olacağını kronik immün yanıt önler. Yetenek kaydetmek ve uzun süreler özellikle milisaniyelik ölçekli spiking aktivite gibi yaşlanma, ay-yıl-uzun süreçler ile ilişkilendirmek Aradığınız müfettişler ilgi olacak aynı tek nöronlar izlemek için kafes elektronik Patogenez beyin hastalığı veya beyin geliştirme16,18. Ayrıca, orada mevcut genişletmek ve aktif elektronik PCB baş-8,35, çoğullama dijital gibi işlevselliğini uygulamak için sahne alanı ekleme gibi bu iletişim kuralı, özelleştirmek için önemli fırsatlar kablosuz iletişim35,36,37ve sinyal35kök hücre veya polimerler ortak doku rejenerasyonu18,38yardım etmek için kafes elektronik enjekte, işleme, 39ve şirket nanowire alan - etkisi transistörler (NW-FETs) içine kafes Elektronik için son derece lokalize ve çok fonksiyonlu beyin probları24,29,40,41 ,42.
Disclosures
Yazarlar ifşa gerek yok.
Acknowledgments
C.M.L. destek Hava Kuvvetleri Office bilimsel araştırma (FA9550-14-1-0136), Harvard Üniversitesi Fizik Bilimleri ve mühendislik Hızlandırıcı Ödülü ve bir ulusal kurumları, sağlık yönetmenin Pioneer Ödülü (tarafından bu eserin kabul eder. 1DP1EB025835-01). T.G.S. destek Savunma Bakanlığı (DoD) tarafından Ulusal Savunma Bilim ve mühendislik yüksek lisans bursu (NDSEG) programı aracılığıyla kabul eder. G.H. Amerikan Kalp Derneği (16POST27250219) ve yolu bursu destek için bağımsızlık Ödülü (üst K99/R00) Ulusal Sağlık Enstitüleri yaşlanma Ulusal Enstitüsünden kabul eder. Bu eser kısmen için nano sistemleri (CNS), bir üye, Ulusal Nanoteknoloji koordine altyapı ağı (NSF ECCS Ödülü No altında Ulusal Bilim Vakfı tarafından desteklenen NNCI), Harvard Üniversitesi merkezinde gerçekleştirilen yapıldı. 1541959.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Motorized stereotaxic frame | World Precision Instruments | MTM-3 | For mouse stereotaxic surgery |
| 512-channel recording controller | Intan Technologies | C3004 | A component of the neural recording system |
| RHD2132 amplifier board | Intan Technologies | C3314 | A component of the neural recording system |
| RHD2000 3 feet ultra thin SPI interface cable | Intan Technologies | C3213 | A component of the neural recording system |
| Mouse restrainer | Braintree Scientific | TV-150 STD | Standard 1.25 inch inner diameter; used to restrain the mouse during restrained recording sessions. |
| Si wafers | Nova Electronic Materials | 3" P <100> .001-.005 ohm-cm 356-406 μm Thick Prime Grade SSP Si wafers w/2 Semi-Std. Flats & 6,000 A°±5% Wet Thermal Oxide on both sides. |
|
| Photomasks (chrome on soda lime glass) | Advance Reproductions | Advance Reproductions and other vendors manufacture photomasks from provided design files. Our photomask design files are available by request or from the resource website, meshelectronics.org. Alternatively, some university clean rooms have mask writers for making photomasks on site. | |
| AutoCAD software | Autodesk Inc. | Design software for drawing photomasks. A free alternative is LayoutEditor. Our photomask design files are available by request or from the resource website, meshelectronics.org. | |
| Thermal evaporator | Sharon Vacuum | Used to evaporate Ni, Cr, and Au onto mesh electronics during fabrication. Many university clean rooms have this or a similar tool. | |
| SU-8 2000.5 negative photoresist | MicroChem Corp. | Negative photoresist used to define the bottom and top passivating layers of mesh electronics. | |
| MA6 mask aligner | Karl Suss Microtec AG | Used to align each photomask to the pattern on the wafer and expose the wafer to UV light. Most university clean rooms have this or a similar tool. | |
| SU-8 developer | MicroChem Corp. | Used to develop SU-8 negative photoresist following exposure to UV light. | |
| LOR3A lift-off resist | MicroChem Corp. | Used with Shipley 1805 photoresist to promote undercutting during metal lift-off processes | |
| Shipley 1805 positive photoresist | Microposit, The Dow Chemical Company | Positive photoresist used to define metal interconnects and Pt electrodes in mesh electronics | |
| MF-CD-26 positive photoresist developer | Microposit, The Dow Chemical Company | To develop S1805 positive photoresist after exposure in a mask aligner. Many university clean rooms stock this chemical. | |
| Spin coater | Reynolds Tech | For coating wafers with positive and negative resists. Most university clean rooms have spin coaters. | |
| PJ plasma surface treatment system | AST Products, Inc. | Used to oxidize the surface of mesh electronics prior to release into aqueous solution. Most university clean rooms have this or a similar tool. | |
| Electron beam evaporator | Denton Vacuum | For evaporating Cr and Pt during fabrication of mesh electronics. Many university clean rooms have this or a similar tool. | |
| Remover PG | MicroChem Corp. | Used to dissolve LOR3A and Shipley S1805 resists during metal lift-off | |
| Ferric chloride solution | MG Chemicals | 415-1L | A component of Ni etching solution |
| 36% hydrochloric acid solution | Kanto Corp. | A component of Ni etching solution | |
| Glass capillary needles | Drummond Scientific Co. | Inner diameter 0.40 mm, outer diameter 0.65 mm. Other diameters are available. | |
| Micropipette holder U-type | Molecular Devices, LLC | 1-HL-U | Used to hold the glass capillary needles during stereotaxic injection |
| 1 mL syringe | NORM-JECT®, Henke Sass Wolf | Used for manual loading of mesh electronics into capillary needles | |
| Polyethylene intrademic catheter tubing | Becton Dickinson and Company | Inner diameter 1.19 mm, outer diameter 1.70 mm | |
| 5 mL syringe | Becton Dickinson and Company | Used in the syringe pump for injection of mesh electronics in vivo | |
| Eyepiece camera | Thorlabs Inc. | DCC1240C | Used to view mesh electronics within capillary needles during injection |
| ThorCam uc480 image acquisition software for USB cameras | Thorlabs Inc. | Used to view mesh electronics within capillary needles during injection | |
| Syringe pump | Harvard Apparatus | PHD 2000 | Used to flow precise volumes of solution through capillary needles during injection of mesh electronics |
| EXL-M40 dental drill | Osada | 3144-830 | For drilling the craniotomy |
| 0.9 mm drill burr | Fine Science Tools | 19007-09 | For drilling the craniotomy |
| Hot bead sterilizer 14 cm | Fine Science Tools | 18000-50 | Used to sterlize surgical instruments |
| CM1950 cryosectioning instrument | Leica Microsystems | Used to slice frozen tissue into sections. Many universities have this or a similar tool available in a shared facility. | |
| 0.3% Triton x-100 | Life Technologies | Used for histology | |
| 5% goat serum | Life Technologies | Used for histology | |
| 3% goat serum | Life Technologies | Used for histology | |
| Rabbit anti-NeuN | Abcam | ab177487 | Used for histology |
| Mouse anti-Neurofilament | Abcam | ab8135 | Used for histology |
| Rat anti-GFAP | Thermo Fisher Scientific Inc. | PA516291 | Used for histology |
| ProLong Gold Antifade Mountant | Thermo Fisher Scientific Inc. | P36930 | Used for histology |
| Poly-D-lysine | Sigma-Aldrich Corp. | P6407-5MG | Molecular weight = 70-150 kDA |
| Right-angle end clamp | Thorlabs Inc. | RA180/M | Used to attach the pipette holder to the stereotaxic frame |
| Printed circuit board (PCB) | Advanced Circuits | Used to interface between mesh electronics and peripheral measurement electronics such as the Intan recording system. Advanced Circuits and other vendors manufacture and assemble PCBs based on provided design files. Our PCB design files are available by request or at the resource site meshelectronics.org | |
| 32-channel standard amplifier connector | Omnetics Connector Corp. | A79024-001 | Component assembled onto the PCB |
| 32-channel flat flexible cable (FFC) | Molex, LLC | 152660339 | Used as a clamping substrate when interfacing to mesh electronics I/O pads with the PCB-mounted ZIF connector |
| 32-channel zero insertion force (ZIF) connector | Hirose Electric Co., LTD | FH12A-32S-0.5SH(55) | Component assembled onto the PCB |
References
- Lopes da Silva, F. EEG and MEG: relevance to neuroscience. Neuron. 80 (5), 1112-1128 (2013).
- Logothetis, N. K. What we can do and what we cannot do with fMRI. Nature. 453 (7197), 869-878 (2008).
- Seymour, J. P., Wu, F., Wise, K. D., Yoon, E. State-of-the-art MEMS and microsystem tools for brain research. Microsystems & Nanoengineering. 3, 16066 (2017).
- Buzsaki, G. Rhythms of the Brain. , Oxford University Press. (2006).
- Khodagholy, D., et al. NeuroGrid: recording action potentials from the surface of the brain. Nature Neuroscience. , (2014).
- Hamel, E. J., Grewe, B. F., Parker, J. G., Schnitzer, M. J. Cellular level brain imaging in behaving mammals: an engineering approach. Neuron. 86 (1), 140-159 (2015).
- Jun, J. J., et al. Fully integrated silicon probes for high-density recording of neural activity. Nature. 551 (7679), 232-236 (2017).
- Berenyi, A., et al. Large-scale, high-density (up to 512 channels) recording of local circuits in behaving animals. Journal of Neurophysiology. 111 (5), 1132-1149 (2014).
- Scholvin, J., et al. Close-Packed Silicon Microelectrodes for Scalable Spatially Oversampled Neural Recording. IEEE Transactions on Biomedical Engineering. 63 (1), 120-130 (2016).
- Schiller, P. H.
- Benabid, A. L., Chabardes, S., Mitrofanis, J., Pollak, P. Deep brain stimulation of the subthalamic nucleus for the treatment of Parkinson's disease. The Lancet Neurology. 8 (1), 67-81 (2009).
- Hochberg, L. R., et al. Reach and grasp by people with tetraplegia using a neurally controlled robotic arm. Nature. 485 (7398), 372-375 (2012).
- Lebedev, M. A., Nicolelis, M. A. Brain-Machine Interfaces: From Basic Science to Neuroprostheses and Neurorehabilitation. Physiological Reviews. 97 (2), 767-837 (2017).
- Polikov, V. S., Tresco, P. A., Reichert, W. M. Response of brain tissue to chronically implanted neural electrodes. Journal of Neuroscience Methods. 148 (1), 1-18 (2005).
- Perge, J. A., et al. Intra-day signal instabilities affect decoding performance in an intracortical neural interface system. Journal of Neural Engineering. 10 (3), 036004 (2013).
- Hong, G., Yang, X., Zhou, T., Lieber, C. M. Mesh electronics: a new paradigm for tissue-like brain probes. Current Opinion in Neurobiology. 50, 33-41 (2017).
- Dai, X., Hong, G., Gao, T., Lieber, C. M. Mesh Nanoelectronics: Seamless Integration of Electronics with Tissues. Accounts of Chemical Research. 51 (2), 309-318 (2018).
- Feiner, R., Dvir, T. Tissue-electronics interfaces: from implantable devices to engineered tissues. Nature Reviews Materials. 3 (1), 17076 (2017).
- Kandel, E. R., Schwartz, J. H., Jessell, T. M., Siegelbaum, S. A., Hudspeth, A. J. Principles of Neural Science. , McFraw-Hill. (2013).
- Rousche, P. J., et al. Flexible polyimide-based intracortical electrode arrays with bioactive capability. IEEE Transactions on Biomedical Engineering. 48 (3), 361-371 (2001).
- Liu, J., et al. Syringe-injectable electronics. Nature Nanotechnology. 10 (7), 629-636 (2015).
- Kasthuri, N., et al. Saturated Reconstruction of a Volume of Neocortex. Cell. 162 (3), 648-661 (2015).
- Saxena, T., Bellamkonda, R. V. A sensor web for neurons. Nature Materials. 14, 1190-1191 (2015).
- Xie, C., et al. Three-dimensional macroporous nanoelectronic networks as minimally invasive brain probes. Nature Materials. 14 (12), 1286-1292 (2015).
- Hong, G., et al. Syringe Injectable Electronics: Precise Targeted Delivery with Quantitative Input/Output Connectivity. Nano Letters. 15 (10), 6979-6984 (2015).
- Zhou, T., et al. Syringe-injectable mesh electronics integrate seamlessly with minimal chronic immune response in the brain. Proceedings of the National Academy of Sciences. 114 (23), 5894-5899 (2017).
- Fu, T. M., et al. Stable long-term chronic brain mapping at the single-neuron level. Nature Methods. 13 (10), 875-882 (2016).
- Fu, T. M., Hong, G., Viveros, R. D., Zhou, T., Lieber, C. M. Highly scalable multichannel mesh electronics for stable chronic brain electrophysiology. Proceedings of the National Academy of Sciences. 114 (47), E10046-E10055 (2017).
- Schuhmann, T. G. Jr, Yao, J., Hong, G., Fu, T. M., Lieber, C. M. Syringe-Injectable Electronics with a Plug-and-Play Input/Output Interface. Nano Letters. 17 (9), 5836-5842 (2017).
- Geiger, B. M., Frank, L. E., Caldera-Siu, A. D., Pothos, E. N. Survivable stereotaxic surgery in rodents. Journal of Visualized Experiments. (20), (2008).
- Kirby, E. D., Jensen, K., Goosens, K. A., Kaufer, D. Stereotaxic surgery for excitotoxic lesion of specific brain areas in the adult rat. Journal of Visualized Experiments. (65), e4079 (2012).
- Gage, G. J., et al. Surgical implantation of chronic neural electrodes for recording single unit activity and electrocorticographic signals. Journal of Visualized Experiments. (60), (2012).
- JoVE Science Education Database. Lab Animal Research. Rodent Handling and Restraint Techniques. , Journal of Visualized Experiments. Cambridge, MA. Available from: https://www.jove.com/science-education/10221/rodent-handling-and-restraint-techniques (2018).
- Evilsizor, M. N., Ray-Jones, H. F., Lifshitz, J., Ziebell, J. Primer for immunohistochemistry on cryosectioned rat brain tissue: example staining for microglia and neurons. Journal of Visualized Experiments. 10 (99), e52293 (2015).
- Sodagar, A. M., Perlin, G. E., Yao, Y., Najafi, K., Wise, K. D. An Implantable 64-Channel Wireless Microsystem for Single-Unit Neural Recording. IEEE Journal of Solid-State Circuits. 44 (9), 2591-2604 (2009).
- Wentz, C. T., et al. A wirelessly powered and controlled device for optical neural control of freely-behaving animals. Journal of Neural Engineering. 8 (4), 046021 (2011).
- Harrison, R. R., et al. Wireless neural recording with single low-power integrated circuit. IEEE Transactions on Neural Systems and Rehabilitation Engineering. 17 (4), 322-329 (2009).
- Landa, N., et al. Effect of injectable alginate implant on cardiac remodeling and function after recent and old infarcts in rat. Circulation. 117 (11), 1388-1396 (2008).
- Griffin, D. R., Weaver, W. M., Scumpia, P. O., Di Carlo, D., Segura, T. Accelerated wound healing by injectable microporous gel scaffolds assembled from annealed building blocks. Nature Materials. 14 (7), 737-744 (2015).
- Zhang, A., Lieber, C. M.
- Zhou, W., Dai, X., Lieber, C. M.
- Dai, X., Zhou, W., Gao, T., Liu, J., Lieber, C. M. Three-dimensional mapping and regulation of action potential propagation in nanoelectronics-innervated tissues. Nature Nanotechnology. 11 (9), 776-782 (2016).
