ショウジョウバエ幼生及び成体脳における細胞外酸性化と酸素消費量の測定のためのプロトコルを提案します。代謝のアナライザーは、適応し、最適化されたプロトコルで利用されています。マイクロ組織拘束このプロトコルの重要なコンポーネント設計し、特にこの分析での使用のために作成します。
このプロトコルでは、ショウジョウバエの幼虫及び成虫の脳の代謝を測定する方法について説明します。全臓器の代謝を定量化初代培養細胞と細胞を分析する際にキャプチャできないエネルギー利用の組織レベルの理解を提供します。この分析は前のヴィヴォが、連携して 1 つの組織で機能を実行する特殊な細胞数から計測でき、体内臓器のモデルをより密接に。代謝リプログラミングは、腫瘍、神経変性疾患など、多くの神経疾患で観察されています。このプロトコルは、神経疾患モデルの市販代謝解析における代謝のキイロショウジョウバエのコミュニティの調査を支援するために開発されました。代謝のアナライザーで全体の脳代謝測定は脳のジオメトリのため困難です。このアナライザーは、96 ウェル プレートの底に残るためのサンプルを必要とします。携帯サンプルやティッシュ パンチはセル板の表面に付着または回転楕円体プレートをそれぞれ利用できます。しかし、キイロショウジョウバエの脳の三次元球面形状は、プレートに付着するから組織を防ぎます。このプロトコルでは、特別に設計され、製造されたマイクロ組織拘束まだアナライザーの 2 つの固体センサー プローブから代謝の測定を可能にしながら、脳の動きを防止することによりこの問題を回避する必要があります。酸素消費量と細胞外酸性化率、再現性と代謝阻害剤との処置に敏感。マイナーな最適化で、このプロトコルは、サンプル サイズが拘束によって生成される商工会議所を超えない、全体組織および/またはモデル システムで使用のために適応になります。基礎代謝測定とミトコンドリアの阻害剤との処置の後の分析はこのプロトコルで記述されている、エネルギー ソースの好みや飼育環境など、数え切れないほどの実験条件が尋問でした。
代謝リプログラミングが膠芽腫多形 (GBM)、ハンチントン病、および主要な憂鬱無秩序 (MDD) の1,2,3を含む多くの神経疾患に発見されました。代謝治療戦略の焦点となる、基本的な代謝研究のためのツールを持って進んでいます。ただし、これらのメソッドのほとんどは、細胞と細胞を研究するまたはより大きいティッシュ ポスト固定または凍結を分析する設計されました。いくつかのアプローチは、単純ながら他の人は同じ目的のための質量分析法4との組み合わせでクロマトグラフィーを利用したより高価で複雑な分析を利用して特定の代謝物を測定するキットに頼ってきました。大規模プロテオームやゲノム研究を補完する大きな代謝風景を理解するには、メタボリック ・ プロファイリング5,6と代謝フラックス解析 (MFA)7も浮上しました。プロファイリングは、時間の経過とともにラベル付けされた代謝物の追跡を許可することでこの時に MFA を拡充時間で細胞や 1 つの点で組織における代謝物の定量的表現で提供されます。後者は、明らかにエネルギー源が異なる細胞や疾患の状態8で組織で利用されている方法で有用されています。ただし、これらのメソッドでは、全体的な代謝率の測定は含まれません。
クラーク電極9と間接熱量計10などの伝統的な方法の酸素消費量を測定するために使用または停止流れ呼吸をするように構成スモール モデル システムの全体的な代謝の状態を調査するには酸素と二酸化炭素の濃度をそれぞれ測定します。これらの技術は、正確に生物レベルで代謝リプログラミングの読み出しに洞察力を提供しながらの制限があります。クラーク電極の使用は技術的に困難なことができ、スループットの高い研究には向いていません。細胞や組織を試金する必要な感度で停止流量計は機能できません。数年前、具体的にはこれらの小さいアプリケーションの11の新しい技術が開発されました。これらの楽器はもともと細胞および 24 ウェルまたは 96 形式で初代培養細胞の細胞の酸性化と酸素消費量を測定するために設計されたもの。セットアップとデータ出力のシンプルさは、従来のアプローチの代わりにこのメソッドを設立しました。この方法はセルのための強力なツール、ティッシュ パンチ12,13,14の測定の最近の進歩を許可しています。ただし、これらのアッセイに利用方法は小さなモデル システムから全臓器の計測はできません。
疾患モデルの代謝解析はしばしば、同じ組織内に存在する特殊な関数のセル間の相互作用を伴います。たとえば、グリア細胞は神経細胞によって利用される代謝産物を生産します。これらの代謝相互作用ニューロン生存15必要です。小さなモデル システムは、これらの質問を調査するため有利であります。様々 な種類の細胞を含む、全臓器の代謝を測定する研究は、エネルギー利用の vivoの理解に追加されます。最近、ベッカーらは、全く飛ぶヘッド16の酸素消費量を測定する方法を報告しました。24 ウェルの細胞板の 1 つも一緒にヘッド数をプールすることによって、代謝アナライザーを使用して酸素消費量の測定値が得られました。これは簡単に本体から分離、頭に適している間大量このメソッドを解剖する必要があるため幼虫の脳などの臓器に使用するはるかに困難です。したがって、酸素消費量と細胞外酸性化測定の感受性が増加、96 ウェルのセルプレートを利用する方法は、単一全幼虫の脳を試金するために開発されました。
本研究で使用される新陳代謝のアナライザーには、96 ウェルの細胞板の井戸の底で推移する測定対象サンプルが必要です。セルと比較的フラット組織は、これはない挑戦です。ただし、キイロショウジョウバエ幼虫と大人の脳は、伝統的なプレート コーティング プロトコルを使用して可能な限りはないです。脳の球面三次元形状は板表面に確実に付着しないとこれらのことが多くの場合井戸に正しく配置する際に、破損しています。この新しいプロトコルの重要な部分は、設計と代謝の測定と干渉せずに存在する脳の小部屋を提供するマイクロ組織拘束17の開発です。生成された商工会議所は約高さで 0.016 し多くショージョーバエ ・脳を簡単に保持するために十分なスペースを提供します。拘束不活性ポリマー リングにアタッチされたナイロン メッシュで構成され、さらに議論が代表の結果に。これらの拘束を使用して解剖脳代謝測定準備に必要な時間を最小限に抑えます。測定手順の最適化 (25 分) の六つの測定サイクル後安定した、再現性のある酸素消費量と細胞外酸性化率を生成します。脳代謝により、注射治療、阻害剤、または他の治療を介して代謝アナライザー カートリッジ薬配信ポート 2 h の最小値のこれらの条件の下でアクティブのまま。このプロトコルは、他の組織の小さなモデル システム18容易に適応させることができます。
下記のプロトコルでは、全ショウジョウバエ幼虫脳ミトコンドリア ストレスに挑戦したときの酸素消費量を測定する方法について説明します。脳をストレス、19ATP 合成酵素を阻害するオリゴマイシンを追加します。基底の測定値から酸素消費量の減少は、脳内 ATP によって呼吸量の測定を示しています。I と III では, 非ミトコンドリアの酸素消費量を示すロテノン20と21アンチマイシン治療後の酸素消費量のさらなる減少、電子輸送鎖複合体の阻害剤、脳。この試金はハエの脳でどのようにミトコンドリア呼吸の一例に例えれば、このプロトコルを使用して、さまざまな遺伝子型の代謝を比較する方法。しかし、このプロトコルは単に基底酸素消費量と、同様特定のエネルギー使用率または基板使用率仮説を調査しより精巧な研究デザインに関して細胞の酸性化率を測定する合わせることができます。
ここでは、キイロショウジョウバエ幼虫と大人の頭脳の前のヴィヴォ代謝解析手法を説明します。基底条件下で酸素消費量と細胞外酸性化率を示し、どのように代謝活性脳はティッシュをミトコンドリアと解糖系呼吸に依存になっているかどうかを決定することができます。それぞれ11。
阻害薬や治療薬で脳の治療さらに組織の新陳代謝の状態に関する情報を提供できます。ワールブルク効果22または23glutaminolysis を調査するグルタミンをテストするグルコースなどの特定の代謝物への依存関係を決定するため、代謝基質を追加もできます-代謝リプログラミングに共通な。長期的な研究は、幼虫やハエは薬の注入ポートを使用して代わりにも供給される可能性も、脳は、間隔または実験的なデザインによって、エンドポイントで試金することができます。このメソッドは、多数のアプリケーションの最適化することができます。
このメソッドは、脳に最適化されていますが、他の幼虫18および成体組織を分析する使用ことができます。また、他の小型のモデル システムは、全体の生物18または組織を測定するこのメソッドを利用できます。他のシステムに対してこのメソッドを最適化する唯一の制限は、臓器、組織、または有機体のサイズです。マイクロ組織拘束によって作成された商工会議所は、分析を実行するサイズ バリアです。脳またはテストされている組織の代謝の出力が小さすぎるとサンプル サイズは制約ではありません、サンプルをプーリングはアッセイの測定と感度を向上させる使用できます。他のアプリケーションのこのプロトコルの変更のみ 1) 適切な措置の選択を含むマイナーな最適化を必要とし、ミックス サイクル番号とタイミングと 2) ティッシュのための効果的な治療法の濃度を決定します。各サイクル中に代謝のアナライザーで測定する監視酸素濃度によりメジャーと混合時間を求めた。これは、実行が完了した後、概要ウィンドウの Y2 軸ボタンでO2を選択して表示できます。各サイクル中にドロップイン酸素混合サイクル中に初期酸素濃度へのリターンによって続いて測定時に、組織の酸素消費を反映する必要があります。このパターンが観測されるまで、メジャーとミックスの回をテスト必要があります。このメソッドを使用すると、他の昆虫の脳を研究されています。これらの脳は、ここで使用されるが、まだ組織拘束によって生成されたチャンバ内で適合飛ぶ脳よりも大きかった。これらの脳から OCR の測定値が高かったとして 400 pmol/分 (データは示されていない)。全体フライ酸素消費量18,24を測定する他の研究に揃えて OCR 率と同様に、これらの研究からの結果は、キイロショウジョウバエの脳が酸素限定でなかったことをお勧めします。ショージョーバエ ・脳と他の生物からの組織では、このメソッドを適用すると、4 つの重要な手順に特別な注意が必要です。
正常に再現性と生物学的関連性の測定を達成するために従う必要があるプロトコルの重要なステップがあります。まず、マイクロ組織拘束の使用は、このメソッドが必要です。製造仕様と記載されている教材を使用して、これらの制約は、不可欠です。材料は、不活性化学成分と空気の泡の作成せず混合手順中に使用する適切なメディア交換する彼らの能力のために選ばれました。第二に、組織の代謝の出力を最大にするタイムリーな郭清とプレートの準備が必要です。短い郭清度脳著しく損なわない必要があります。他の研究は、ハエ脳できます後保持するように時間日生きている郭清、灌流で正しく保存されている場合の部屋の25を示しています。しかし、脳は、アッセイの前に時間の長い期間のためのアッセイ メディアに座って残っている場合、図 3Bと3 Dを見て、酸素消費量が減少します。アッセイ中サンプルはサイクルごとにミキシング ステップを受けます。この混合だけでなく化学物質の注射でエイズ、またメディアを循環させるし、酸素を提供する行為。脳は代謝活性これらメジャー ミックス サイクル中に長期間の彼らのベンチ上のメディアで培養するだろうよりも滞在することがあります。そのため、幼虫の脳の解剖は、この試金を設定する開始する前に習得すべき。このアッセイのセットアップ時、脳の数を最小限に抑えるために遺伝子の数が少ないを分析するとき必要し、井戸を利用します。これは、解剖と試金の測定の間の遅延を防ぐ。第三に、安定した温度を維持する生理学的条件で代謝率を分析する必要があります。増加の測定温度は、低酸素消費量 (図 3) で観測された、組織死を引き起こすことができます。ハエは、実験目的のため異なる水温で飼育されている、もしこの温度で測定をまた実行してください。アッセイは、異なる温度で実施される場合、解剖は、室温で実行最も可能性の高い、メッキと拘束された脳が分析を実行する前に 15 分に必要な温度で培養する必要があります。最後に、観測井戸後アッセイは配置組織と測定値が影響を受けるかどうかを決めることが大事。時折、1 つ外れ値も除去しうる、解剖顕微鏡の下でプレートを観察した後組織のいずれかの損失または mispositioning のためのデータ解析から脳が井戸の中心が滑ってしまったし、立ち往生しているがあるでしょう[拘束の高分子リング。拘束された井戸に正しく固定されていないと混合サイクル中に邪魔された場合、組織が失われます。一方、彼らは分析から除外されていない場合、これらのイベントのどちらもは頻繁に起こる、彼らは大幅にレートの値を下げます。
監視の酸素消費量と細胞の酸性化による全体組織代謝流束の測定は、遺伝的風景や他の実験条件によって代謝を変更する方法を理解するための生物学的に関連するメソッドを提供します。このメソッドは単一の代謝の変化を検出する十分なキイロショウジョウバエ脳停止流れ呼吸または間接熱量測定法を使用して可能ではないです。またクラーク電極を使用して酸素消費量を測定するよりより少なく技術的に困難です。このプロトコルの追加の利点は、ウェルあたり 1 つの全脳を分析する機能です。96 ウェル フォーマットより敏感な測定値とアッセイごとに必要なサンプル数が小さいため一度にしたがって、1 つ以上の遺伝子型ができる試金されます。体内代謝測定はまだ挑戦し慎重に必要とする飼育し、同期された動物、このプロトコル高速で比較的単純な方法を記述するD の多数の代謝感度を分析する可能性があります。キイロショウジョウバエ幼生及び成体の脳。
The authors have nothing to disclose.
ブルーミントン ショウジョウバエ ストック センター (NIH P40OD018637) から取得した株式は、この研究で使用されました。この出版物で報告された研究医歯薬学研究エクセレンスから国立科学研究所の一般医療許可番号の下健康の国民の協会の制度開発賞 (アイデア) ネットワークに支えられP20GM103430、およびロードアイランドの基礎によって。著者は、このプロトコルの開発に彼らのサポートのウォーターズ J と p. Snodgrass ベルトをありがとうございます。
Assay medium | Agilent | 102365-100 | |
Calibrant solution | Agilent | 100840-000 | |
Corning Cell-Tak Cell Tissue Adhesive | Sigma Aldrich | DLW354240 | |
delrin | Grainger | 2XMK6 | |
Drosophila Schneider Media | Thermo Fisher | 21720-024 | |
Dumont High Precision Tweezers (style 5) | Ted Pella | 5622 | |
Loctite 409 | Amazon | ||
Mitostress kit | Agilent | 103015-100 | oligomycin, rotenone, and antimycin A included |
Netwell inserts (6-well) | VWR | 29442-136 | |
nylon mesh | Component Supply | U-CMN-64 | |
Parafilm M wrapping film | Fisher Scientific | S37440 | |
PYREX spot plate | Fisher Scientific | 13-748B | |
Seahorse XFe96 Analyzer | Agilent | ||
Wave v2.4 XFe96 analyzer software | Agilent | https://www.agilent.com/en/products/cell-analysis/software-download-for-wave-desktop | free download to mac or windows |
XFe96 catridge and cell plates | Agilent | 102416-100 |