Vi præsenterer en protokol til måling af forbrug af ilt og ekstracellulære forsuring i Drosophila melanogaster larve og voksen hjerner. En metabolisk analyzer er udnyttet med en tilpasset og optimeret protokol. Mikro-væv begrænsninger var er et afgørende element i denne protokol og designet og skabt specielt til deres brug i denne analyse.
Denne protokol beskriver en metode til at måle stofskiftet i Drosophila melanogaster larve og voksen hjerner. Kvantificere stofskifte i hele organer giver en væv-niveau forståelse af energi-udnyttelse, der ikke kan hentes, når du analyserer primærelementer og cellelinjer. Mens denne analyse er ex vivo, det giver mulighed for måling af en række specialiserede celler arbejder sammen for at udføre en funktion i et væv og modeller tættere i vivo orgel. Metaboliske omprogrammering er blevet observeret i mange neurologiske sygdomme, herunder neoplasi, og neurodegenerative sygdomme. Denne protokol blev udviklet for at bistå Fællesskabets D. melanogaster undersøgelse af stofskiftet i Neurologiske sygdomsmodeller ved hjælp af en kommercielt tilgængelig metaboliske analyzer. Måling af metabolisme af hele hjerner i den metaboliske analyzer er en udfordring på grund af geometrien af hjernen. Denne analyzer kræver prøver at forblive i bunden af en 96-brønd plade. Celle prøver og væv slag kan holde sig på overfladen af cellen plade eller udnytte klumpformet plader, henholdsvis. Kugleformet, tre-dimensionelle form af D. melanogaster hjerner forhindrer imidlertid væv fra fastholdelsen af pladen. Denne protokol kræver et specielt designet og produceret mikro-væv tilbageholdenhed, der omgår dette problem ved at forhindre enhver bevægelse af hjernen, mens det stadig tillader metaboliske målinger fra de analyzer to solid-state sensor sonder. Forbrug af ilt og ekstracellulære forsuring er reproducerbare og følsom over for en behandling med metaboliske hæmmere. Med en mindre optimering, kan denne protokol være tilpasset til brug med enhver hele væv og/eller modelsystem, forudsat at prøvestørrelse ikke overstiger salen genereret af tilbageholdenhed. Mens basal metaboliske målinger og analyse efter en behandling med mitokondrie-hæmmere er beskrevet i denne protokol, kunne utallige forsøgsbetingelser, som energi kilde præference og opdræt miljø, blive afhørt.
Metaboliske omprogrammering er blevet identificeret i mange neurologiske sygdomme, herunder glioblastom Multiforme (GBM), Huntingtons sygdom og større depressiv lidelse (MDD)1,2,3. Som stofskifte bliver fokus for terapeutiske strategier, har værktøjer til metaboliske grundforskning avanceret. Men de fleste af disse metoder var designet til at studere cellelinjer og primærelementer eller analysere større væv efter fiksering eller -frysning. Nogle metoder har påberåbt sig kits til simplistisk måle specifikke metabolitter, mens andre har udnyttet mere kostbare og komplekse analyser udnytte kromatografi i kombination med massespektrometri4 for det samme mål. For at forstå det større metaboliske landskab, metabolisk profilering5,6 og metaboliske flux analyse (MFA)7 opstået for at supplere de større proteom og genomisk undersøgelser. Profilering giver en kvantitativ repræsentation af metabolitter i en celle eller væv på et tidspunkt i tid, mens MFA udvider på dette ved at tillade sporing af mærket metabolitter over tid. Sidstnævnte har været nyttig i afslører hvordan energikilder udnyttes forskelligt i en celle eller væv i en sygdom stat8. Disse metoder omfatter dog ikke måling af det samlede stofskifte.
For at afhøre de lille modelsystemer samlede metabolisk tilstand, kan traditionelle metoder, såsom Clark elektrode9 og indirekte kalorimetri10, bruges til at måle iltforbrug eller konfigureret til stop flow respirometri, til måle ilt og CO2-koncentration, henholdsvis. Disse teknikker, har mens præcist giver indsigt i udlæsning af metaboliske omprogrammering på niveauet organisme begrænsninger. Brugen af Clark elektrode kan være teknisk udfordrende og er ikke beregnet til høj overførselshastighed undersøgelser. Stop strømmen respirometer kan ikke fungere med følsomhed skal assay celler eller væv. Flere år siden, blev ny teknologi udviklet specielt til disse små programmer11. Disse instrumenter var oprindeligt designet til at måle iltforbruget og ekstracellulære forsuring af cellelinjer og primærelementer i en 24 – eller 96-brønds format. Enkelheden i opsætning og data outputtet etableret denne metode som et alternativ til de traditionelle metoder. Denne metode er et kraftfuldt værktøj til celler, og de seneste fremskridt har tilladt for måling af væv slag12,13,14. De metoder, der anvendes i disse assays tillader ikke for måling af hele organer fra små modelsystemer.
Den metaboliske analyse af sygdomsmodeller indebærer ofte samspillet mellem celler af specialiserede funktion har bopæl inden for den samme væv. For eksempel producerer glial celler metabolitter udnyttet af neuroner. Disse metaboliske interaktioner er nødvendige for neuronal overlevelse15. Lille modelsystemer er fordelagtige for at undersøge spørgsmål som disse. Undersøgelser for at måle stofskiftet i en hele orglet, der indeholder en lang række celletyper, vil tilføje til forståelsen af energi udnyttelse in vivo. For nylig, Becker et al. rapporterede en metode til måling af iltforbrug i hele flyve hoveder16. Ved at samle en række hoveder sammen i et godt af en 24-godt celle plade, er ilt forbrug aflæsninger fremstillet ved hjælp af en metabolisk analyzer. Mens dette virker godt for hoveder, som er let adskilt fra kroppen, er det meget sværere at bruge for organer såsom larve hjerner, fordi en stor mængde skal være dissekeret for denne metode. Derfor blev en metode udnytter en 96-brønd celle plade, hvilket øger følsomheden af iltforbrug og ekstracellulære forsuring aflæsninger, udviklet for at analysen en enkelt hele larve hjerne.
Den metaboliske analyzer anvendes i denne undersøgelse kræver prøven bliver målt til at forblive i bunden af brønden af en 96-brønd celle plade. For celler og forholdsvis flad væv er dette ikke en udfordring; men for D. melanogaster larve og voksen hjerne, det er ikke muligt ved hjælp af traditionelle plade belægning protokoller. De tre-dimensionelle kugleform af hjerner vil pålideligt ikke overholder plade overflade, og dem, der er ofte beskadiget under forsøget på at placere dem korrekt i brønden. En vigtig del af denne nye protokol er design og udvikling af mikro-væv begrænsninger17 der giver et lille kammer til hjernen til at opholde sig i uden at forstyrre de metaboliske målinger. Salen genereret er ca 0.016 i højde og indeholder nok plads til at nemt holde mange D. melanogaster hjerner. Begrænsninger består af nylon mesh knyttet til et inaktivt polymer ring og vil blive diskuteret yderligere i Repræsentative resultater. Ved hjælp af disse begrænsninger minimerer tidsforbruget til at forberede den metaboliske måling dissekeret hjerner. Optimere den måling procedure genererer støt, reproducerbare iltforbrug og ekstracellulære forsuring satser efter seks måling cyklusser (af 25 min). Hjerner stadig metabolisk aktive under disse betingelser for et minimum af 2 h, som gør det muligt for injektioner af therapeutics, hæmmere eller andre behandlinger via metaboliske analyzer patron drug delivery havne. Denne protokol kan også være let tilpasses til andre væv og lille model systemer18.
Protokollen nedenfor beskriver, hvordan assay iltforbrug i en hele Drosophila larve hjernen når udfordret med mitokondrie stress. For at understrege hjernen, er oligomycinets tilføjet til at hæmme ATP syntase19. Nedgangen i forbrug af ilt fra basal aflæsninger viser en måling af mængden af ATP-afhængigt af respiration i hjernen. Yderligere fald i iltforbrug efter behandlinger med rotenon20 og antimycin en21, hæmmere af elektron transport kæde komplekser I og III, henholdsvis, angive mængden af ikke-mitokondrie iltforbrug i den hjernen. Denne analyse er et eksempel på hvordan mitokondrie respiration i en flyve hjerne kan sammenlignes og hvordan denne protokol kan bruges til at sammenligne metabolisme i varierende genotyper. Men denne protokol kan tilpasses for at måle blot basal iltforbrug og ekstracellulære forsuring priser, samt at designe mere omfattende studier undersøger særlige energi udnyttelse eller substrat udnyttelse hypoteser.
Her, er en roman metode til metaboliske analyse af D. melanogaster larve og voksen hjerne ex vivo beskrevet. Basal betingelser viser iltforbrug og ekstracellulære forsuring priser hvordan metabolisk aktive hjernen er og kan afgøre, om en væv er blevet mere afhængige af mitokondrie versus glycolytic respiration, henholdsvis11.
Behandling af hjerner med hæmmere eller terapeutiske lægemidler kan give yderligere oplysninger om den metaboliske status af væv. Metaboliske substrater kan også tilføjes for at bestemme afhængighederne på specifikke metabolitter, såsom glukose til at teste for Warburg virkning22 eller glutamin at undersøge glutaminolysis23— både fælles i metaboliske omprogrammering. Langtidsstudier, larver eller fluer kunne også fodres narkotika i stedet for ved hjælp af injektion havne og hjerner kunne analyseres med mellemrum eller på farveprøve, afhængigt af forsøgets udformning. Denne metode kan være optimeret til talrige applikationer.
Denne metode er blevet optimeret til hjerner, men kan bruges til at analysere andre larve18 og voksent væv. Derudover kan andre små modelsystemer udnytte denne metode til at måle hele organismer18 eller væv. Den eneste begrænsning til optimering af denne metode til andre systemer er størrelsen af orglet, væv eller organismer. Salen lavet af mikro-væv tilbageholdenhed er den størrelse hindring for kører analysen. Hvis den metaboliske output er for lav til hjernen eller væv bliver testet, og stikprøvestørrelse er ikke en betingelse, kan samle prøver bruges til at øge assay målinger og følsomhed. Ændre denne protokol for andre applikationer bør kun kræve mindre optimeringer, herunder 1) at vælge den relevante foranstaltning og bland cyklus numre og timing, og 2) bestemme effektiv behandling koncentrationer for væv. Foranstaltning og blande gange blev bestemt af overvågning iltkoncentrationen målt ved den metaboliske analyzer under hver cyklus. Dette kan ses ved at vælge O2 i knappen Y2 akse i oversigtsvinduet, når flugt er fuldført. I løbet af hver cyklus, bør der være en drop-in iltkoncentration afspejler det væv iltforbrug under den målte tid, efterfulgt af en tilbagevenden til den oprindelige iltkoncentrationen i løbet af blanding cyklus. Foranstaltning og mix gange bør testes, indtil dette mønster er observeret. Brug denne metode, er andre insekt hjerner blevet studeret. Disse hjerner var større end de flyve hjerner bruges her men stadig passer ind i kammeret genereret af væv tilbageholdenhed. OCR aflæsninger fra disse hjerner var så højt som 400 pmol/min (data ikke vist). Resultaterne fra disse undersøgelser samt OCR priser, der tilslutter med andre undersøgelser, måling af hele-fly ilt forbrug18,24, tyder på, at D. melanogaster hjerner ikke var ilt-limited. For både D. melanogaster hjerner og væv fra andre organismer kræver anvende denne metode særlig opmærksomhed på fire vigtige skridt.
For at kunne opnå reproducerbare og biologisk relevante målinger, er der kritiske trin af den protokol, der skal følges. Første er brug af en micro-væv tilbageholdenhed påkrævet for denne metode. Fremstiller disse begrænsninger ved hjælp af specifikationer og anførte materialer er afgørende. Materialerne blev valgt på grund af deres inert kemiske sammensætning, og deres evne til at give ordentlig medier udveksling under de blanding trin uden oprettelse af luftbobler. For det andet er en rettidig dissektion og plade forberedelse forpligtet til at maksimere den metaboliske output af væv. Korte dissektion gange bør ikke væsentligt ændrer hjernen. Andre undersøgelser har vist, at flyve hjerner kan holdes i live i timer til dage efter dissektion hvis korrekt opbevaret i en perfusion afdeling25. Men, som det ses i figur 3B og 3D, hvis hjerner er venstre sidder i assay medier i lang tid forud for analysen, ilt forbrug satser er faldet. Under analysen underkastes prøver en blanding skridt i løbet af hver cyklus. Denne blanding ikke kun støtte med injektioner af kemiske forbindelser, men også handlinger at recirkulere medierne og give ilt. Hjerner er købedygtig ophold metabolisk aktive i længere perioder under disse foranstaltning-mix cyklusser, end de ville inkubere i medierne på bænk toppen. Dissektion af larve hjerner bør derfor håndteres før du begynder at oprette dette assay. Når oprettelsen af denne analyse, analysere et lille antal genotyper på et tidspunkt, at minimere antallet af hjerner behov og brønde udnyttet. Dette forhindrer forsinkelser mellem at dissekere og assay målinger. For det tredje, opretholde en stabil temperatur er forpligtet til at analysere stofskifte i fysiologisk relevante betingelser. Øget assay temperaturer kan forårsage vævsdød, observeret af lavere ilt forbrug satser (figur 3 c). Hvis fluer er opdrættet på en anden temperatur til forsøgsformål, bør målingerne også udføres ved denne temperatur. Mens dissektioner vil sandsynligvis blive udført ved stuetemperatur, hvis analysen udføres ved en anden temperatur, forgyldt og behersket hjerner bør sættes i varmeskab ved den krævede temperatur i 15 min., inden du kører analysen. Endelig, observere brønde efter analysen er afgørende for at finde ud af hvis væv positionering påvirket målingerne. Lejlighedsvis, vil der være en outlier godt, efter at have observeret plade under dissekere mikroskop, kan være elimineret fra dataanalyse på grund af enten tab af væv eller mispositioning, hvor hjernen har gled ud af centrum af brønden og sidder fast under polymer ring af tilbageholdenhed. Væv kan gå tabt, hvis tilbageholdenhed ikke var sikret korrekt til brønden og blev forstyrret i de blanding cykler. Mens ingen af disse begivenheder sker ofte, hvis de ikke er undtaget fra analysen, vil de lavere sats værdierne betydeligt.
Måling af hele-væv metaboliske flux af overvågning forbrug af ilt og ekstracellulære forsuring giver en biologisk relevante metode for at forstå hvordan stofskiftet er ændret af den genetiske landskab eller øvrige eksperimentelle betingelser. Denne metode er følsom nok til at opdage metaboliske ændringer i en enkelt D. melanogaster hjernen, hvilket ikke er muligt ved hjælp af stop-flow respirometri eller indirekte kalorimetri. Det også mindre teknisk udfordrende end at bruge en Clark elektrode til at måle iltforbrug. En yderligere fordel ved denne protokol er evnen til at analysere en hele hjernen pr. brønd. 96-brønds format giver mulighed for mere følsomme aflæsninger, og således mere end én genotype kan analyseres på et tidspunkt på grund af det mindre antal prøver, der kræves pr. assay. Mens måling metabolisme i væv er stadig udfordrende og kræver omhyggeligt opdrættet og synkroniseret dyr, denne protokol beskriver en fast, forholdsvis simple metode, og har potentiale til at analysere mange metaboliske følsomheder i D. melanogaster larve og voksen hjerner.
The authors have nothing to disclose.
Lagre fra Bloomington Drosophila Stock Center (NIH P40OD018637) blev brugt i denne undersøgelse. Forskningen rapporteret i denne publikation blev støttet af den institutionelle udvikling Award (idé) netværk for biomedicinsk forskning Excellence fra National Institute of General Medical Sciences af National Institutes of Health under grant nummer P20GM103430, og af Rhode Island Foundation. Forfattere takke J. farvande og P. Snodgrass-bælte for deres støtte i udviklingen af denne protokol.
Assay medium | Agilent | 102365-100 | |
Calibrant solution | Agilent | 100840-000 | |
Corning Cell-Tak Cell Tissue Adhesive | Sigma Aldrich | DLW354240 | |
delrin | Grainger | 2XMK6 | |
Drosophila Schneider Media | Thermo Fisher | 21720-024 | |
Dumont High Precision Tweezers (style 5) | Ted Pella | 5622 | |
Loctite 409 | Amazon | ||
Mitostress kit | Agilent | 103015-100 | oligomycin, rotenone, and antimycin A included |
Netwell inserts (6-well) | VWR | 29442-136 | |
nylon mesh | Component Supply | U-CMN-64 | |
Parafilm M wrapping film | Fisher Scientific | S37440 | |
PYREX spot plate | Fisher Scientific | 13-748B | |
Seahorse XFe96 Analyzer | Agilent | ||
Wave v2.4 XFe96 analyzer software | Agilent | https://www.agilent.com/en/products/cell-analysis/software-download-for-wave-desktop | free download to mac or windows |
XFe96 catridge and cell plates | Agilent | 102416-100 |