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Genetics

माउस Splenocytes का उपयोग रोगज़नक़ का आकलन करने के लिए-घड़ी जीन अभिव्यक्ति पर आणविक पैटर्न प्रभाव जुड़े

Published: July 24, 2018 doi: 10.3791/58022
Automatic Translation
1
1Department of Biology, University of Hartford

Summary

इस प्रोटोकॉल एक माउस splenocytes का उपयोग करने के लिए रोगज़नक़ की खोज तकनीक का वर्णन आणविक पैटर्न है कि आणविक घड़ी जीन अभिव्यक्ति बदल जुड़े ।

Abstract

जीन अभिव्यक्ति के व्यवहार से, circadian लय शरीर विज्ञान के लगभग सभी पहलुओं को विनियमित. यहां, हम एक पद्धति मौजूद रोगज़नक़ के साथ माउस splenocytes चुनौती-जुड़े आणविक पैटर्न (PAMPs) lipopolysaccharide (एलपीएस), ODN1826, और गर्मी लिस्टिरिया monocytogenes मारे गए और आणविक circadian पर उनके प्रभाव की जांच घड़ी. पहले, अध्ययनों से एक किस्म का उपयोग कर आणविक घड़ी पर एलपीएस के प्रभाव की जांच पर ध्यान केंद्रित किया है vivo और पूर्व vivo दृष्टिकोण में मॉडलों के एक वर्गीकरण से (जैसे, माउस, चूहा, और मानव) । इस प्रोटोकॉल अलगाव और splenocytes की चुनौती का वर्णन है, साथ ही पद्धति को मात्रात्मक पीसीआर के माध्यम से घड़ी जीन अभिव्यक्ति पोस्ट चुनौती का आकलन करने के लिए । इस दृष्टिकोण को न केवल आणविक घड़ी पर अंय अणुओं के रूप में अच्छी तरह से है कि घड़ी की अभिव्यक्ति बदल सकता है पर माइक्रोबियल घटकों के प्रभाव का आकलन किया जा सकता है । इस दृष्टिकोण के अलावा कैसे PAMP-टोल रिसेप्टर इंटरेक्शन की तरह घड़ी अभिव्यक्ति प्रभाव के आणविक तंत्र को चिढ़ाने के लिए उपयोग किया जा सकता है ।

Introduction

स्तनधारियों में मास्टर घड़ी, जो शरीर विज्ञान और व्यवहार के लगभग सभी पहलुओं के लिए 24 एच दोलनों आर्केस्ट्रा, hypothalamus1,2के suprachiasmatic नाभिक (SCN) के भीतर स्थित है । एक जीव स्तर पर जैविक प्रक्रियाओं को विनियमित करने के अलावा, मास्टर घड़ी भी शरीर3,4,5भर में परिधीय सेलुलर घड़ियों सिंक्रनाइज़ । जबकि आणविक घड़ी मशीनरी के होते हैं कम से तीन इंटरलाकिंग transcriptional-शोधों प्रतिक्रिया छोरों, कोर शामिल है की अवधि (Per1-3), Cryptochrome (Cry1-2), Bmal1, और घड़ी जीन6,7। कोर आणविक घड़ी के सटीक समय को बनाए रखने के अलावा, कुछ सहायक घड़ी जीन उत्पादों (जैसे, Rev-erbα और Dbp) भी गैर घड़ी जीन की अभिव्यक्ति को विनियमित, यानी, घड़ी नियंत्रित जीन (CCGs)6 , 7.

कार्यात्मक आणविक घड़ियों विभिन्न प्रतिरक्षा ऊतकों में वर्णित किया गया है (जैसे, तिल्ली और लिम्फ नोड्स)8 और कोशिकाओं (जैसे, बी कोशिकाओं, वृक्ष कोशिकाओं, मैक्रोफेज)8,9. इन कोशिकाओं का पता लगाने और रोगज़नक़-जुड़े आणविक पैटर्न (PAMPs) का जवाब, सूक्ष्म प्रतिरक्षा मान्यता रिसेप्टर्स जैसे टोल जैसे रिसेप्टर्स (TLRs)10के माध्यम से, माइक्रोबियल घटकों के संरक्षण. तारीख करने के लिए, 13 कार्यात्मक TLRs वर्णित किया गया है, जो बैक्टीरियल कोशिका दीवार घटकों, flagellar प्रोटीन, और माइक्रोबियल न्यूक्लिक एसिड10के रूप में माइक्रोबियल घटक पहचान । PAMP, lipopolysaccharide (एलपीएस), TLR4 द्वारा मांयता प्राप्त ग्राम नकारात्मक बैक्टीरिया की एक कोशिका दीवार घटक, दोनों जीव और आणविक स्तर पर circadian लय में परिवर्तन करने के लिए दिखाया गया है । उदाहरण के लिए, vivo चैलेंज में एलपीएस प्रेरित photic-जैसे चरण विलंब चूहों11 में गतिविधि द्वारा मापा और SCN और जिगर में कम घड़ी जीन अभिव्यक्ति के लिए नेतृत्व के रूप में सीटू संकरण और मात्रात्मक पीसीआर में द्वारा निर्धारित, क्रमशः, चूहों में12. एलपीएस के साथ vivo चैलेंज में एक के बाद, मानव परिधीय रक्त ल्यूकोसाइट्स13 के विश्लेषण और चमड़े के नीचे वसा ऊतक14 qPCR के माध्यम से मापा के रूप में कई घड़ी जीन की बदली अभिव्यक्ति का पता चला. अंत में, पूर्व मानव मैक्रोफेज और माउस पेरिटोनियल मैक्रोफेज की vivo एलपीएस चुनौतियां भी बदल घड़ी अभिव्यक्ति के लिए नेतृत्व के रूप में14qPCR द्वारा मापा ।

यहां, हम PAMPs एलपीएस, ODN1826 (सिंथेटिक oligonucleotides युक्त unmethylated CpG रूपांकनों), और गर्मी मारे लिस्टिरिया monocytogenes (HKLM), TLR4, TLR9, और TLR2, क्रमशः द्वारा मांयता प्राप्त के प्रभाव का आकलन करने के लिए एक प्रोटोकॉल का वर्णन आणविक घड़ी माउस splenocytes में जीन अभिव्यक्ति । प्रोटोकॉल माउस splenectomy, splenocyte अलगाव और चुनौती, आरएनए निष्कर्षण, सीडीएनए संश्लेषण, और qPCR कई घड़ी जीन की अभिव्यक्ति का आकलन करने के लिए शामिल है । इस प्रोटोकॉल बहुत कम जानवर या सेलुलर हेरफेर है, जो तब विभिंन PAMPs के साथ पूर्व vivo चुनौती दी जा सकती है के साथ प्रतिरक्षा कोशिकाओं की एक बड़ी संख्या के समय पर अधिग्रहण के लिए अनुमति देता है । आणविक घड़ी के लिए प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया8,15,16, के विभिंन पहलुओं को मिलाना दिखाया गया है इसलिए, आणविक घड़ी के विघटन की संभावना सबसे उचित समय निर्भर भिंनता ख़राब होगा प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया । इसके अलावा, के बाद से circadian लय के विघटन गंभीर विकृतियों के लिए नेतृत्व कर सकते हैं17,18,19,20, यह एक विस्तृत श्रृंखला के साथ splenocytes चुनौती के लिए शोधकर्ताओं के लिए ब्याज की हो सकती है अणु और घड़ी पर उनके प्रभाव का आकलन ।

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Protocol

अध्ययन के दौरान, पशु देखभाल और उपचार राष्ट्रीय स्वास्थ्य नीति के संस्थानों के साथ अनुपालन, संस्थागत दिशा निर्देशों के अनुसार थे, और Hartford पशु संस्थागत पशु देखभाल और उपयोग समिति के विश्वविद्यालय द्वारा अनुमोदित किया गया ।

1. पशुओं की Entrainment

नोट: बीस सप्ताह पुराने पुरुष B6129SF2/जे चूहों के अध्ययन में उपयोग किया जाता है ।

  1. चढ़ना चूहों के लिए एक 12 एच प्रकाश (मानक उपरि सफेद प्रकाश)/12 एच अंधेरे चक्र 2 सप्ताह के लिए प्रयोग करने से पहले ।
    नोट: यहां zeitgeber समय (ZT) 0 रोशनी से मेल खाती है और रोशनी के लिए ZT12, जबकि अंय सभी पर्यावरणीय कारकों (यानी, भोजन, पानी, और कमरे के तापमान) लगातार 21रखते हुए ।

2. उपकरणों की तैयारी, संस्कृति माध्यम, और चुनौती मध्यम

  1. आटोक्लेव संदंश आणि विदारक कैंची. एल्यूमीनियम पंनी और आटोक्लेव में फ्रॉस्टेड माइक्रोस्कोप स्लाइड के जोड़े लपेटें ।
  2. RPMI १६४० करने के लिए 10% की एक अंतिम एकाग्रता के लिए भ्रूण गोजातीय सीरम (FBS) जोड़कर संस्कृति माध्यम तैयार करें । ५० मिलीलीटर ट्यूबों में चैलेंज मध्यम के 10 मिलीलीटर तैयार करने के लिए संस्कृति माध्यम में निंनलिखित PAMPs जोड़कर (RPMI 10% FBS के साथ); एलपीएस (5 µ g/ml), ODN1826 (5 µ g/एमएल), हीट-मारे लिस्टिरिया monocytogenes (108 HKLM/एमएल), या इसके सुझाए गए एकाग्रता में किसी अन्य PAMP ।
  3. गर्म संस्कृति मध्यम और चैलेंज मध्यम ३७ डिग्री सेल्सियस के लिए एक पानी के स्नान में, और लगभग ७० मल बाँझ फॉस्फेट के कमरे के तापमान पर खारा (पंजाब, पीएच ७.२) के बफर रखना ।
  4. एक ५० मिलीलीटर ट्यूब और बर्फ पर जगह करने के लिए एक 10 मिलीलीटर पिपेट और पिपेट सहायता का उपयोग संस्कृति मध्यम के 10 मिलीलीटर जोड़ें ।
  5. एक १०० मिलीलीटर चोंच के लिए ७०% इथेनॉल के लगभग 30 मिलीलीटर जोड़ें और जगह विदारक कैंची के सिरों और संदंश चोंच में माइक्रोबियल संक्रमण को रोकने के लिए ।
  6. 10 µ l β-Mercaptoethanol (एक धुएं हुड के नीचे) एक ५० मिलीलीटर ट्यूब में बफर RLT की हर 1 मिलीलीटर को जोड़कर आरएनए अलगाव के लिए lysis बफर तैयार करें । केवल राशि है कि (प्रति नमूना है, जो लगभग 1 x 106 कोशिकाओं के होते हैं) ६०० µ एल की जरूरत होगी बनाओ ।
    नोट: बफर RLT एक आरएनए निष्कर्षण किट है कि सिलिका झिल्ली के लिए शाही सेना के बंधन का समर्थन करता है के एक घटक है ।

3. Splenocyte अलगाव और चुनौती

  1. Euthanize चूहों के माध्यम से एक विशेष zeitgeber समय में उंहें अपने मूल पिंजरे में रखने और2 एल के एक प्रवाह की दर पर पिंजरे में सह जोड़ने के द्वारा narcosis/1 मिनट के लिए श्वास बंद हो जाता है के बाद2 की आपूर्ति जारी रखें ।
  2. खोपड़ी के आधार पर गर्दन के दोनों ओर अंगूठे और तर्जनी रखने के द्वारा गर्भाशय ग्रीवा अव्यवस्था के माध्यम से मौत की पुष्टि करें । वैकल्पिक रूप से, खोपड़ी के आधार पर एक रॉड प्रेस, जबकि जल्दी से खींच (दूसरे हाथ का उपयोग) पूंछ या हिंद अंगों का आधार खोपड़ी22से गर्भाशय ग्रीवा के कशेरुकाओं की जुदाई का कारण ।
  3. स्प्रे ७०% इथेनॉल के साथ माउस ट्रंक और एक कागज तौलिया के साथ पोंछ । अपनी पीठ पर माउस प्लेस और थोड़ा इसके दाईं ओर झुका । दूर फर कट, विदारक कैंची का उपयोग, माउस के बाईं ओर के साथ, के बारे में आधे रास्ते के सामने और पीछे पैर के बीच ।
  4. संदंश का प्रयोग, ले लो और ध्यान से एक चीरा ताकि तिल्ली को नुकसान नहीं है । संदंश और एक बाँझ ५० मिलीलीटर बर्फ पर संस्कृति मीडिया के लगभग 10 मिलीलीटर युक्त ट्यूब में जगह के साथ तिल्ली निकालें । शेष जानवरों के लिए दोहराएं ।
    नोट: तिल्ली एक गुर्दा बीन का रंग है, और यह अब और गुर्दे की तुलना में चापलूसी है ।
  5. एक छोटी सी बाँझ पेट्री डिश के लिए संस्कृति माध्यम के 2 मिलीलीटर के साथ एक तिल्ली स्थानांतरण ।
    1. यह दो बाँझ फ्रॉस्टेड स्लाइड के फ्रॉस्टेड हिस्से के बीच पीस द्वारा तिल्ली Homogenize. यदि संभव हो, तो homogenization प्रक्रिया के दौरान समस्या और कक्षों को मध् यम में रखें ।
    2. एक बार अच्छी तरह से homogenized, संस्कृति माध्यम के 2 मिलीलीटर प्लास्टिक एक ५० मिलीलीटर ट्यूब में एक ४० µm नायलॉन सेल छलनी के माध्यम से splenocytes युक्त ।
    3. फ्रॉस्टेड स्लाइड के नए जोड़े का उपयोग कर शेष तिल्ली के लिए उपरोक्त कदम दोहराएँ, संस्कृति माध्यम के साथ ५० मिलीलीटर ट्यूबों, और सेल उपभेदों.
  6. 10 मिलीलीटर की कुल मात्रा के लिए splenocytes युक्त ५० मिलीलीटर ट्यूब में से प्रत्येक के लिए शीत संस्कृति माध्यम के 8 मिलीलीटर जोड़ें/ किसी hemocytometer का उपयोग कर milliliter प्रति कक्षों की संख्या निर्धारित करें ।
  7. लगभग 1 x 106 कोशिकाओं को जोड़ने के लिए/ उन कुओं की संख्या में कक्ष जोड़ें जो प्रयोग के लिए उपयोग की जा रही विभिंन PAMPs की संख्या के अनुरूप हों और एक नियंत्रण को अच्छी तरह शामिल करें । संबंधित कुओं के लिए संस्कृति मध्यम या चैलेंज मध्यम के 3 मिलीलीटर के 3 मिलीलीटर जोड़ें ।
  8. 3 एच के लिए 5% CO2 में ३७ ° c में प्लेटें मशीन ।
  9. अच्छी तरह से एक १,००० µ एल प्लास्टिक टिप एक P1000 micropipette से जुड़ी का उपयोग कर के नीचे से कोशिकाओं परिमार्जन । एक ही १,००० µ एल प्लास्टिक टिप के लिए एक 15 मिलीलीटर ट्यूब का उपयोग कर कोशिकाओं से युक्त माध्यम स्थानांतरण ।
  10. कमरे के तापमान पर 5 मिनट के लिए १६७ x g पर केंद्रापसारक के माध्यम से कोशिकाओं गोली । supernatant निकालें और पंजाब के 5 मिलीलीटर के साथ सेल गोली धोने ।
  11. 5 मिनट के लिए १६७ एक्स जी में एक दूसरी बार कोशिकाओं गोली, supernatant को हटाने, और सेल गोली करने के लिए lysis बफर के ६०० µ एल जोड़ने के क्रम में कोशिकाओं को लाइसे करने के लिए. फिर आरएनए अलगाव के लिए आगे बढ़ना ।

4. आरएनए अलगाव और सीडीएनए संश्लेषण

  1. splenocytes से आरएनए अलग करें निर्माता के निर्देशों के अनुसार आरएनए निष्कर्षण किट का उपयोग कर और ' वैकल्पिक ' पर कॉलम डीएनए पाचन प्रदर्शन.
  2. सीडीएनए संश्लेषण करने से पहले, एकाग्रता इष्टतम आरएनए रेंज (अप करने के लिए 2 µ जी) सीडीएनए संश्लेषण किट के भीतर है कि पुष्टि करने के लिए एक microvolume spectrophotometer का उपयोग कर आरएनए एकाग्रता का निर्धारण ।
  3. निर्माता के निर्देशों के अनुसार रिवर्स प्रतिलेखन किट का उपयोग कर नमूनों में से प्रत्येक के लिए संश्लेषित सीडीएनए. एक 20 µ एल कुल प्रतिक्रिया मात्रा में नमूनों में से प्रत्येक के लिए आरएनए के 10 µ एल का उपयोग करें. रिवर्स प्रतिलेखन के पूरा होने पर (thermocycler भागो) प्रत्येक प्रतिक्रिया करने के लिए 20 μL एच2ओ जोड़ें ।
  4. कुछ नियंत्रण नमूनों से पूल mRNA करने के लिए एक P10 या P20 micropipette का उपयोग मानक curving का निर्माण (जैसे, 10 µ एल की कुल के लिए 2 नमूनों से 5 µ एल) एक ०.५ मिलीलीटर ट्यूब में सीडीएनए तैयार करने के लिए.
    1. जोड़ें 10 µ एल 2x रिवर्स transcriptase मास्टर मिक्स ।
    2. रिवर्स प्रतिलेखन के समापन पर, प्रतिक्रिया ट्यूब, जो प्रारंभिक एकाग्रता ("1") मानक वक्र के लिए कमजोर पड़ने वाली श्रृंखला में के रूप में काम करेंगे के लिए 10 µ एल के एच2ओ जोड़ें ।
    3. एक 10 गुना कमजोर पड़ने श्रृंखला प्रदर्शन (1 से 10-4) के ४५ µ एल जोड़कर पानी की एक P100 या P200 micropipette का उपयोग कर चार ०.५ मिलीलीटर ट्यूब में नामित 10-1, 10-2, 10-3, और 10-4।
      1. पहले ट्यूब में शुरू एकाग्रता "1" के 5 µ एल जोड़ें (10-1) एक P20 micropipettor का उपयोग कर, pipetting द्वारा मिश्रण और कई बार नीचे, तो 10-1 ट्यूब से 5 µ एल हस्तांतरण में नामित ट्यूब 10-2 और मिश्रण.
      2. 10-3 और मिश्रण नामित ट्यूब में 10-2 ट्यूब से एक P20 micropipette का उपयोग कर 5 µ एल हस्तांतरण. 10-4 और मिश्रण निर्दिष्ट ट्यूब में 10-3 ट्यूब से एक P20 micropipettor का उपयोग कर 5 µ एल स्थानांतरण ।

5. मात्रात्मक पोलीमरेज़ चेन रिएक्शन (qPCR)

  1. qPCR द्वारा mRNA स्तर के सापेक्ष quantitation निर्धारित करें । प्रयोगात्मक सेट अप के भीतर, "Quantitation-सापेक्ष मानक वक्र" और "TaqMan" रसायन विज्ञान का चयन करें । प्रतिक्रिया वॉल्यूम को 10 µ में बदलें l. प्लेट लेआउट (जैसे, लक्ष्य जीन, मानक वक्र, रिपोर्टर, आदि) में प्रासंगिक जानकारी दर्ज करें ।
  2. प्रतिक्रिया तैयार करें ताकि इसमें प्राइमरी के ०.५ µ एल/जांच परख, जीन एक्सप्रेशन मास्टर मिक्स के 5 µ एल, 2 µ एल के एच2ओ और २.५ µ एल के सीडीएनए (10-100 एनजी) शामिल हैं ।
    1. एक मास्टर मिश्रण तैयार करने के लिए पूर्ववर्ती एजेंट के प्रत्येक गुणा (सीडीएनए छोड़कर) प्रतिक्रियाओं की संख्या से, मानक वक्र से उन शामिल करने के लिए सुनिश्चित करने, नकारात्मक नियंत्रण, डुप्लिकेट में प्रत्येक प्रतिक्रिया प्रदर्शन, और 2 अतिरिक्त प्रतिक्रियाओं कि खाते होंगे त्यात pipetting भिन्नता आहे.
    2. प्लास्टिक ७.५ एक micropipette या एक मल्टीचैनल पिपेट के साथ एक ९६ अच्छी प्रतिक्रिया थाली में पूर्व निर्धारित कुओं में तैयार मास्टर मिश्रण के µ एल । प्लास्टिक २.५ µ एल के सीडीएनए के लिए उपयुक्त अच्छी तरह से और मानक, और २.५ में नकारात्मक नियंत्रण कुओं में एच2ओ के µ एल ।
    3. विभिंन आणविक घड़ी जीन के लिए प्राइमर/जांच परख शामिल हैं, और भी एक अंतर्जात नियंत्रण (जैसे, β-actin) के लिए एक परख शामिल हैं ।
  3. आदेश में सापेक्ष अभिव्यक्ति मूल्यों का निर्धारण करने के लिए, प्रत्येक दोहराने के लिए मतलब सापेक्ष मात्रा की गणना, फिर, प्रत्येक नमूने के लिए, लक्ष्य जीन के लिए माध्य सापेक्ष मात्रा के लिए मतलब सापेक्ष मात्रा β-actinके लिए विभाजित ।

6. सांख्यिकीय विश्लेषण

  1. सांख्यिकीय विश्लेषण सॉफ़्टवेयर का उपयोग करके, स्तंभ आँकड़े विकल्प के अंतर्गत कार्यक्रम में डेटा दर्ज करें. Dunnett की पोस्ट हॉक परीक्षण के साथ एक तरह ANOVA चुनें घड़ी जीन अभिव्यक्ति के अर्थ मूल्यों के बीच मतभेदों का आकलन करने के लिए नियंत्रण बनाम PAMP चुनौती के बाद ।

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Representative Results

चूहों ZT13 पर बलिदान किया गया, splenocytes अलग थे और PAMPs एलपीएस, ODN1826, या HKLM के साथ vivo पूर्व चुनौती दी । 3 ज के बाद, आरएनए अलग था, और qPCR को चुनौती दी नियंत्रण कोशिकाओं की तुलना में आणविक घड़ी जीन घड़ी, Per2, Dbp, और Rev-erbα के सापेक्ष अभिव्यक्ति के स्तर का आकलन करने के लिए इस्तेमाल किया गया था । PAMP चैलेंज के बाद, घड़ी व्यंजक स्तर नियंत्रण कक्षों (चित्र 1A) में व्यंजक से काफी भिंन नहीं थे । Per2 अभिव्यक्ति स्तर एलपीएस और ODN1826 के साथ चुनौती दी कोशिकाओं में काफी ऊपर उठाया गया जब चुनौती दी नियंत्रण (चित्रा 1बी) की तुलना में । एलपीएस केवल PAMP Rev-erbα अभिव्यक्ति को बदलने के लिए किया गया था, के रूप में mRNA के स्तर को चुनौती दी नियंत्रण (चित्रा 1सी) की तुलना में काफी कम थे । अंत में, काफी कम mRNA स्तर Dbp के लिए PAMPs में से प्रत्येक के साथ चुनौती के बाद जब नियंत्रण (चित्रा 1डी) की तुलना में मनाया गया । क्या पहले दिखाया गया है के साथ संगत, सभी घड़ी संबद्ध जीन की जांच की, Dbp अभिव्यक्ति के लिए सबसे PAMP चुनौती23से प्रभावित हो जाता है ।

Figure 1
चित्रा 1 : माउस splenocytes में बदल घड़ी जीन अभिव्यक्ति के बाद पूर्व vivo PAMP चैलेंज । Splenocytes ZT13 में अलग थे और एलपीएस, ODN1826, या HKLM के साथ चुनौती दी । सापेक्ष घड़ी mRNA स्तर (β-actin करने के लिए सामान्यीकृत) चुनौती के बाद qPCR 3 ज द्वारा निर्धारित किया गया था । प्रत्येक डेटा बिंदु 1 पशु के लिए अभिव्यक्ति स्तर का प्रतिनिधित्व करता है । प्रयोगात्मक माध्य + SEM दिया जाता है । * p < 0.05, * *p < 0.01, * * *p < 0.001 । Dunnett की पोस्ट हॉक टेस्ट के साथ एक तरह से ANOVA के अनुसार संकेत चुनौतियां नियंत्रण (अनचैलेंज्ड सेल) से काफी अलग थीं । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

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Discussion

इस प्रोटोकॉल के भीतर, एक microvolume spectrophotometer के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है और आरएनए की शुद्धता का आकलन जीन अभिव्यक्ति का निर्धारण करने में इस्तेमाल किया जा रहा है । न्यूक्लिक एसिड २६० एनएम पर यूवी प्रकाश को अवशोषित, प्रोटीन आम तौर पर २८० एनएम पर प्रकाश को अवशोषित, जबकि अंय संभावित एक आरएनए निष्कर्षण प्रक्रिया के दौरान इस्तेमाल किया दूषित (जैसे, phenol) २३० एनएम में detectable हैं । इसलिए, 260/280 एनएम (आरएनए प्रोटीन के लिए) और 260/230 एनएम (आरएनए गैर प्रोटीन संदूषणों के लिए) में अवशोषित (ए) अनुपात का आकलन करके आरएनए की गुणवत्ता का आकलन किया जा सकता है । उच्च गुणवत्ता आरएनए 1.8 – 2.1 के बीच एक A260/280 अनुपात है, के रूप में कम अनुपात प्रोटीन संदूषण संकेत मिलता है । एक शुद्ध आरएनए नमूना २.० के एक A260/

जब एक लक्ष्य जीन के सापेक्ष अभिव्यक्ति का निर्धारण (यानी, Per2, घड़ी, Rev-erbα, और Dbp), एक अंतर्जात नियंत्रण जीन (एक जीन जिसमें अभिव्यक्ति का स्तर नमूनों के बीच अलग नहीं है) भी चुना जाना चाहिए । लक्ष्य जीन के सापेक्ष अभिव्यक्ति तो अंतर्जात नियंत्रण जीन की अभिव्यक्ति के लिए सामान्यीकृत है । शुरू सामग्री में अंतर (splenocytes की संख्या), रिवर्स में भिंनता-transcriptase दक्षता, आरएनए गिरावट की बदलती दरों, आदि, अंतर्जात नियंत्रण जीन द्वारा के लिए ठीक हो जाएगा (β-actin इस प्रोटोकॉल में) । हालांकि, यह सत्यापित करने के लिए बुद्धिमान है कि उपचार अंतर्जात नियंत्रण जीन की अभिव्यक्ति में परिवर्तन नहीं करता है की जांच की जा रही है । यह कई कोशिकाओं की एक बराबर संख्या की प्रतिकृति से β-actin स्तर का आकलन द्वारा पूरा किया जा सकता है (उपचार बनाम गैर उपचार). सिद्धांत रूप में, उनके β-actin स्तर समान होना चाहिए । अंतर्जात नियंत्रण भिन्नता के खिलाफ गार्ड के लिए एक और दृष्टिकोण अंतर्जात नियंत्रण के एक पैनल का उपयोग करने के लिए होगा (जैसे, β-actin, Gapdh, और 18S rRNA जीन).

जब आणविक घड़ी पर PAMPs के प्रभाव की जांच, दिन के समय जब चूहों euthanized रहे हैं और splenocytes बाद में चुनौती दी है ध्यान में रखा जाना चाहिए. Tlr अभिव्यक्ति और जवाबदेही पहले समय के दिन निर्भर भिन्नता8,15प्रदर्शित करने के लिए दिखाया गया है, इसलिए, दिन के एक समय जब Tlr जवाबदेही अपने चरम पर है, पर एक बड़ा प्रभाव में परिणाम सकता है घड़ी. इसके अलावा, आणविक घड़ी जीन की अभिव्यक्ति भी splenocytes में दिन भर में उतार चढ़ाव होगा, इसलिए, घड़ी जीन PAMP चुनौती के कारण अभिव्यक्ति की कमी सबसे महत्वपूर्ण अगर पीक9अभिव्यक्ति के समय के दौरान जांच की जाएगी । Dbp और Rev-erbα के बाद से splenocytes में महत्वपूर्ण अभिव्यक्ति चोटियों का प्रदर्शन करने के लिए दिखाया गया है और प्रकाश के आसपास प्रतिरक्षा कोशिकाओं प्लीहा-अंधेरे चरण 8,9,23, 24 (ZT12), वर्तमान पद्धति में, कोशिकाओं को अलग किया गया और ZT13 में चुनौती दी है ताकि इन जीनों में कमी का पता लगाने में एक बड़ा मौका है । इसके विपरीत, एक PAMP जो घड़ी की अभिव्यक्ति को बढ़ा सकता है, यदि दिन के एक समय में देखने पर सबसे अधिक संभावना देखी जाएगी जब घड़ी अभिव्यक्ति अपने निंनतम पर है ।

चूंकि चूहों रात पशुओं रहे हैं, उनके बाकी चरण प्रकाश अवधि के दौरान है, जो मानव गतिविधि के अनुरूप है । इसलिए, आदर्श रूप में, चूहों को कम से कम यातायात के साथ एक कमरे में रखा जाएगा और एक है कि एक सफेद शोर मशीन शामिल क्रम में दिन में गड़बड़ी के रूप में यह चूहों की circadian लय बाधित कर सकता है । इसके अलावा, पिंजरे परिवर्तन प्रयोग की तारीख के अग्रिम में अच्छी तरह से किया जाना चाहिए । अंधेरे अवधि के दौरान पशु कमरे (जानवरों की इच्छामृत्यु सहित) में कोई भी काम, लाल बत्ती के तहत आयोजित किया जाना चाहिए ताकि चूहों की लय को बाधित करने से बचने के लिए ।

प्रतिदिन लय पर्यावरणीय उत्तेजनाओं (जैसे, प्रकाश या भोजन) के अधीन हैं, जो zeitgebers हैं । एक 12 एच प्रकाश/12 एच अंधेरे चक्र के मामले में, zeitgeber (यानी, प्रकाश) घड़ी एक 24 घंटे की अवधि के लिए रीसेट करता है । जबकि सबसे प्रतिदिन लय circadian (यानी, दैनिक लय है कि एक बाहरी क्यू के अभाव में होते हैं) कर रहे हैं, वे सच circadian लय नहीं कर रहे हैं जब तक वे लगातार पर्यावरण की स्थिति के तहत एक लगभग 24 एच अवधि के साथ दोलन करने के लिए दिखाया गया है . इसलिए, इस प्रक्रिया को लगातार शर्तों के तहत चूहों का उपयोग किया जा सकता है, जो ऊपर वर्णित के रूप में प्रकाश अंधेरे चक्र के लिए चूहों entraining करना होगा, लेकिन फिर लगातार अंधेरे में 3 दिन के लिए नमूने से पहले पशुओं पकड़े । प्रयोग के इस प्रकार के एक काले अंधेरे (डीडी) प्रयोग के रूप में संदर्भित किया जाता है और नमूना के समय बिंदु सीटी (circadian समय), नहीं ZT के रूप में भेजा जाएगा ।

हालांकि इस विधि PAMPs कि splenocytes के भीतर घड़ी जीन अभिव्यक्ति को बदलने की पहचान कर सकते हैं, यह खाते में नहीं ले कैसे इन PAMPs शरीर भर में मास्टर घड़ी या परिधीय घड़ियों को प्रभावित करता है । के बाद से तिल्ली कोशिकाओं की एक विषम जनसंख्या से बना है, व्यक्तिगत PAMPs प्रत्येक कोशिका प्रकार अलग ढंग से प्रभाव सकता है. उदाहरण के लिए, माउस प्लीहा में Tlr9 व्यंजक लय splenocytes, मैक्रोफेज, B कक्षों और dc15के बीच भिन्न होते हैं. इसके अतिरिक्त, Tlr1, Tlr3, Tlr4, Tlr6, Tlr7,और Tlr8 एक अनुयाई splenocyte जनसंख्या में महत्वपूर्ण दैनिक दोलनों प्रदर्शित लेकिन केवल Tlr2 और Tlr6 अनुभव दैनिक में दोलनों समृद्ध प्लीहा मैक्रोफेज24. इसलिए, आदेश में व्यक्तिगत सेल प्रकार पर एक चुनौती के परिणाम की जांच करने के लिए, कोशिकाओं को चुंबकीय कोशिका छंटाई के माध्यम से अलग किया जा सकता है, के रूप में पहले9,15 वर्णित है और फिर बाद में चुनौती दी । इसके अतिरिक्त, प्लीहा सेल जनसंख्या दैनिक चक्र पर उतार चढ़ाव, जो भी एक विशेष PAMP और घड़ी8पर बाद के प्रभाव के लिए संवेदनशीलता में एक भूमिका निभा सकता है ।

इस विधि प्रतिरक्षा कोशिकाओं है कि बी कोशिकाओं (~ ५८%), टी कोशिकाओं (~ 21%), वृक्ष कोशिकाओं (~ 5%), और मैक्रोफेज (~ 4%)25की predominately मिलकर की एक बड़ी संख्या के अलगाव के लिए अनुमति देता है । कोशिकाओं की बड़ी संख्या एक ही प्रयोग में PAMPs की एक किस्म के साथ splenocytes चुनौती देने का अवसर प्रदान करता है । splenocyte अलगाव प्रक्रिया बहुत प्रदर्शन करने के लिए आसान है, मिनट के भीतर पूरा किया जा सकता है (जानवरों की संख्या पर निर्भर करता है), और ंयूनतम पशु या सेलुलर हेरफेर है, जो आवश्यक है जब आणविक घड़ी की जांच के रूप में ऊपर उल्लेख किया है, इन कार्यों घड़ी के समय के साथ ही घड़ी नियंत्रित जीन बाधित कर सकते हैं । इस प्रक्रिया के लिए परिणाम अत्यधिक reproducible थे, चुनौती दी और चुनौती दी कोशिकाओं के बीच महत्व के रूप में सिर्फ तीन जानवरों के साथ प्राप्त किया गया था और परिणाम पहले से प्रकाशित काम23 (चित्रा 1) के अनुरूप थे । यह ध्यान दिया जाना चाहिए कि समूह के प्रति पशुओं की संख्या में वृद्धि एक चुनौती समूह और नियंत्रण (जैसे, ODN १८२६ और Rev-erbα) के बीच सांख्यिकीय महत्वपूर्ण मतभेदों का पता चला हो सकता है ।

आगे बढ़ रहा है, जबकि इस प्रोटोकॉल केवल PAMP चैलेंज के बाद घड़ी जीन अभिव्यक्ति पर तीव्र प्रभाव पते, यह आगे की जांच के लिए सिद्धांत का सबूत प्रदान कर सकता है । उदाहरण के लिए, इस परख के लिए एक मॉडल के रूप में इस्तेमाल किया जा सकता है आणविक TLR-PAMP बातचीत के बारे में तंत्र को समझने और यह कैसे आणविक घड़ी प्रभावित करता है । यह भी समय यह आणविक घड़ी के लिए लेता है एक PAMP चुनौती है, जो एक समय-पाठ्यक्रम प्रयोग (यानी, समय के बाद बदलती चुनौती के बाद अभिव्यक्ति का आकलन द्वारा निर्धारित किया जा सकता है) के बाद ठीक करने के लिए लगता है की लंबाई निर्धारित करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है । जैसा कि ऊपर उल्लेख किया, बाद के प्रयोगों के लिए विशिष्ट splenocyte सेल आबादी पर PAMP चुनौती की जांच किया जा सकता है । के बाद से कई रोगजनकों संक्रमण पर कई TLRs को उत्तेजित, यह इस प्रोटोकॉल का उपयोग करने के लिए अगर कई PAMPs के साथ चुनौती घड़ी जीन अभिव्यक्ति पर एक synergistic प्रभाव है की जांच दिलचस्प होगा ।

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Disclosures

लेखक का खुलासा करने के लिए कुछ नहीं है ।

Acknowledgments

यह काम Hartford विश्वविद्यालय में कला और विज्ञान के डीन कार्यालय के कॉलेज से संकाय अनुसंधान अनुदान द्वारा समर्थित किया गया था ।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Frosted slides Fisher 12-550-343
Cell strainers Fisher 22363547
Lipopolysaccharide  InvivoGen ltrl-eklps
ODN1826 InvivoGen Tlrl-1826-1
HKLM InvivoGen Tlrl-hklm
RPMI 1640 Gibco 11875-093
PBS Gibco 20012-043
RNeasy Mini Kit Qiagen 74104 or 74106
RNase-Free DNase Set Qiagen 79254
6-well cell culture plate Denville T1006
50 mL tubes Corning 352070
15 mL tubes Corning 352097
High Capacity cDNA Reverse Transcription Kit ThermoFisher 4368814
TaqMan Gene Expression Assays b-actin ThermoFisher Mm00607939_s1
TaqMan Gene Expression Assays Per2 ThermoFisher Mm00478113_m1
TaqMan Gene Expression Assays Rev-erba ThermoFisher Mm00520708_m1
TaqMan Gene Expression Assays Bmal1 ThermoFisher Mm00500226_m1
TaqMan Gene Expression Assays Dbp ThermoFisher Mm00497539_m1
qPCR machine StepOnePlus ThermoFisher
TaqMan Gene Expression Master Mix ThermoFisher 4369016
MicroAmp Fast 96-well reaction plate (0.1 mL) ThermoFisher 4346907
Statistical Analysis Software Prism 7.0a

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References

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आनुवंशिकी मुद्दा १३७ आणविक घड़ी Circadian लय Lipopolysaccharide ODN1826 गर्मी मारे लिस्टिरिया monocytogenes Splenocytes टोल की तरह रिसेप्टर्स पैटर्न मान्यता रिसेप्टर्स रोगज़नक़-आणविक पैटर्न जुड़े इम्यूनोलॉजी
माउस Splenocytes का उपयोग रोगज़नक़ का आकलन करने के लिए-घड़ी जीन अभिव्यक्ति पर आणविक पैटर्न प्रभाव जुड़े
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Silver, A. C. The Use of Mouse… More

Silver, A. C. The Use of Mouse Splenocytes to Assess Pathogen-associated Molecular Pattern Influence on Clock Gene Expression. J. Vis. Exp. (137), e58022, doi:10.3791/58022 (2018).

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