Summary
פרוטוקול זה מתאר שיטה באמצעות העכבר splenocytes לגלות דפוסי מולקולריים הקשורים הפתוגן שמשנות ביטוי גנים שעון מולקולרי.
Abstract
מהתנהגות על ביטוי גנים, השעון הביולוגי לווסת כמעט בכל ההיבטים של פיזיולוגיה. כאן, אנו מציגים מתודולוגיה אתגר splenocytes עכבר עם ליפופוליסכריד פתוגן-הקשורים דפוסי מולקולרית (PAMPs) (LPS), ODN1826, חום-נהרג ליסטריה ולבחון את השפעתם על מולקולרית היממה שעון. בעבר, מחקרים התמקדו בחינת השפעתה של LPS על השעון המולקולרי באמצעות מגוון של גישות ויוו ו- ex-vivo מבחר דגמים (למשל, עכבר, חולדה, האדם). פרוטוקול זה מתאר את הבידוד ואת האתגר של splenocytes, כמו גם את המתודולוגיה כדי להעריך את השעון ג'ין ביטוי האתגר שלאחר באמצעות PCR כמותי. גישה זו ניתן להעריך לא רק את ההשפעה של רכיבים חיידקים על השעון המולקולרי אבל מולקולות אחרות כמו גם זה עשוי לשנות את הביטוי של השעון. גישה זו יכול להיות מנוצל כדי לקנטר לגזרים את המנגנון המולקולרי של כיצד משפיע על האינטראקציה קולטן PAMP-אגרה-כמו שעון הביטוי.
Introduction
שעון אב ביונקים, אשר האחראית תנודות 24 שעות ביממה עבור כמעט כל ההיבטים של פיזיולוגיה והתנהגות, הינו ממוקם במרחק העל-תצלובתי (SCN) של ההיפותלמוס1,2. בנוסף, ויסות תהליכים ביולוגיים ברמת organismal מסנכרנת שעון אב היקפיים שעונים הסלולר ברחבי הגוף3,4,5. בעוד המנגנון שעון מולקולרי מורכבת לפחות 3 לולאות משוב תעתיק translational שלובים, הליבה מורכבת של התקופה (Per1-3), קריפטוכרום (Cry1-2), Bmal1, ואת השעון גנים6,7. מלבד שמירה על התזמון מדויק של השעון המולקולרי הליבה, כמה מוצרים ג'ין שעון נלווים (למשל, Rev-erbα , Dbp) גם לווסת את הביטוי של גנים שאינם שעון, קרי, שעון מבוקר גנים (CCGs)6 , 7.
הפונקציונליים שעונים מולקולרית תוארו שונים ברקמות מערכת החיסון (למשל, הטחול ובלוטות הלימפה)8 , תאים (למשל, B תאים, תאים דנדריטים, מקרופאגים)8,9. תאים אלה לזהות ולהגיב פתוגן-הקשורים מולקולרית דפוסים (PAMPs), שנשמרת הרכיבים מיקרוביאלי, באמצעות קולטנים זיהוי מערכת החיסון מולדים כגון אגרה דמוי קולטנים (TLRs)10. עד כה, 13 TLRs תפקודית תוארו, אשר מזהה את המרכיבים חיידקים כגון רכיבי הקיר תא החיידק, השוטוניים חלבון מיקרוביאלי חומצות גרעין10. PAMP, ליפופוליסכריד (LPS), מרכיב דופן התא של חיידקים גראם שליליים מזוהה על-ידי TLR4, הוכח לשנות מקצבים השעון הביולוגי ברמות organismal והן מולקולרית. לדוגמה, ויוו האתגר של LPS מושרה עיכובים photic כמו שלב כפי שנמדד על-ידי פעילות עכברים11 והוביל לביטוי גנים שעון מופחת ב SCN ו הכבד כפי שנקבע על ידי הכלאה בחיי עיר ו- PCR כמותי, בהתאמה, בעוד עכברושים12. לאחר ויוו אתגר עם התקליטים, ניתוח של דם היקפיים אנושי לויקוציטים13 ו רקמת השומן התת עורית14 גילה ביטוי שונה של מספר גנים השעון כפי שנמדדה באמצעות qPCR. לבסוף, שמחוץ LPS באתגרים של מקרופאגים האנושי מקרופאגים הצפק העכבר, הוביל גם שינו שעון ביטוי כפי שהיא נמדדת qPCR14.
כאן, אנו מתארים את פרוטוקול כדי להעריך את השפעת התקליטים PAMPs, ODN1826 (oligonucleotides סינטטי המכיל unmethylated מוטיבים CpG), וחום-נהרג ליסטריה (HKLM), מזוהה על-ידי TLR4, TLR9 ו- TLR2, בהתאמה, על שעון מולקולרי ביטוי גנים ב העכבר splenocytes. הפרוטוקול כולל העכבר ספלנקטומיה, בידוד splenocyte, אתגר, RNA החילוץ, סינתזה cDNA qPCR להעריך ביטוי של מספר גנים שעון. פרוטוקול זה מאפשר רכישת מספר גדול של תאים חיסוניים עם מעט מאוד חיים בזמן או מניפולציה הסלולר, אז מה שיכול להיות מאותגרת שמחוץ עם PAMPs שונים. השעון המולקולרי הוכח לווסת את ההיבטים השונים של ה8,15,של התגובה החיסונית16, לכן, שיבוש של השעון המולקולרי סביר לפגום את הווריאציה תלויי-זמן נאות של התגובה החיסונית. בנוסף, מאז שיבושים של השעון הביולוגי יכול להוביל מבעיות17,18,19,20, זה עשוי להיות עניין לחוקרים לאתגר את splenocytes עם מגוון רחב של מולקולות ולהעריך את השפעתם על השעון.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
במהלך המחקר, טיפול בבעלי חיים וטיפול תאמו מדיניות מכוני הבריאות הלאומיים, היו על פי הנחיות מוסדיים, אושרו על ידי אוניברסיטת הרטפורד טיפול בבעלי חיים מוסדיים בעלי חיים ועל שימוש הוועדה.
1. entrainment של בעלי חיים
הערה: עשרים בת שבוע זכר B6129SF2/J עכברים משמשים במחקר.
- Entrain עכברים 12 שעות אור (סטנדרט עילי אור לבן) / כהה 12 h מחזור 2 שבועות לפני הניסוי.
הערה: כאן זמן zeitgeber (ZT) 0 מקביל אורות, ZT12 אורות, תוך שמירה על איכות הסביבה גורמים אחרים (קרי, מזון ומים בטמפרטורת החדר) קבוע 21.
2. הכנת כלי נגינה תרבות בינוני, בינוני אתגר
- אוטוקלב מלקחיים ומספריים ויבתר לעטוף זוגות של שקופיות מיקרוסקופ עמומה רדיד אלומיניום, החיטוי.
- היכונו בינוני תרבות על-ידי הוספת סרום שור עוברית (FBS) כדי RPMI 1640 ריכוז סופי של 10%. הכינו 10 מ"ל של אתגר בינונית 50 מ ל צינורות על-ידי הוספת PAMPs הבאים את המדיום תרבות (RPMI עם 10% FBS); LPS (5 µg/mL), ODN1826 (5 µg/mL), חום-נהרג ליסטריה (108 HKLM/mL), או PAMP אחר בריכוז המוצע שלה.
- לחמם תרבות בינונית, אתגר בינוני עד 37 ° C באמבט מים, ולשמור כ 70 מ ל תמיסת סטרילית פוספט buffered (PBS, pH 7.2) בטמפרטורת החדר.
- להוסיף 10 מ של תרבות מדיום באמצעות פיפטה של 10 מ"ל פיפטה סיוע שפופרת 50 מ ל, המקום על קרח.
- להוסיף כ- 30 מ של 70% אתנול 100 מ ל גביע ומקום הקצוות של לנתח מלקחיים ומספריים לתוך כשהספל למניעת זיהום מיקרוביאלי.
- היכונו מאגר פירוק RNA בידוד על-ידי הוספת 10 µL β-Mercaptoethanol (תחת ברדס fume) לכל 1 מ"ל של מאגר RLT בשפופרת 50 מ. לעשות רק את הסכום יהיה צורך (600 µL עבור דגימה, אשר מורכב של 1 x 106 תאים).
הערה: RLT מאגר הוא רכיב של ערכת חילוץ RNA התומך הכריכה של RNA למוח סיליקה.
3. Splenocyte בידוד ואתגר
- המתת חסד עכברים במועד מסוים zeitgeber באמצעות הרדמה על-ידי שמירתן בכלוב המקורי שלהם והוספת CO2 לכלוב בספיקה של 3 L לדקה המשך אספקת CO2 ב 1 דקות לאחר עוצר נשימה.
- אשר מת דרך נקע בצוואר הרחם על ידי הצבת באגודל ובאצבע משני צדי הצוואר בבסיס הגולגולת. לחלופין, הקש על מוט בבסיס הגולגולת תוך משיכת במהירות (באמצעות היד השנייה) בבסיס הזנב או הגפיים האחוריות כדי לגרום ההפרדה של חוליות צוואר הרחם של הגולגולת22.
- תרסיס המטען עכבר עם 70% אתנול ולנגב במגבת נייר. הנח את העכבר על הגב ועל מוטה מעט על הצד השמאלי שלו. לחתוך את הפרווה, באמצעות לנתח מספריים, לאורך הצד השמאלי של העכבר, על באמצע הדרך בין הכניסה לבין האחוריות.
- באמצעות מלקחיים, לתפוס את הצפק ולהפוך בזהירות חתך כדי לא לפגוע בטחול. להסיר את הטחול עם מלקחיים ומניחים לתוך צינור סטרילי 50 מ ל המכיל כ- 10 מ"ל של תרבות התקשורת על קרח. חזור על החיות הנותרים.
הערה: הטחול הוא הצבע של שעועית כליה, זה ארוך ושטוח יותר הכליה. -
העברה הטחול אחת עם 2 מ של תרבות בינוני צלחת פטרי סטריליות קטן.
- Homogenize הטחול על ידי שפשוף זה בין החלק עמומה של שתי שקופיות עמומה סטרילי. במידת האפשר, לשמור את הנושא ואת התאים בטווח הבינוני במהלך תהליך המגון.
- פעם ביסודיות הומוגני, pipet mL 2 של תרבות בינוני המכיל את splenocytes דרך מסננת תא 40 µm ניילון לתוך צינור 50 מ.
- חזור על השלבים שלעיל טחולים הנותר באמצעות זוגות חדשים של שקופיות עמומה, צינורות 50 מ עם תרבות בינוני, תא strainers.
- להוסיף כל אחד הצינורות 50 מ ל המכיל את splenocytes עבור הנפח הכולל של 10 מ"ל/צינור 8 מ של מדיום קר תרבות. לקבוע את מספר תאים למיליליטר באמצעות של hemocytometer.
- להוסיף כ עונה 1 פרק 106 תאים/טוב 6-ובכן תרבות צלחות. הוסף תאים מספר בארות אשר תואמים מספר PAMPs שונים בשימוש עבור הניסוי, כוללים פקד טוב. להוסיף 3 מ"ל של תרבות מדיום או 3 מ"ל של אתגר בינוני הבארות בהתאמה.
- דגירה הצלחות ב- 37 מעלות צלזיוס ב 5% CO2 ב-3 שעות.
- לגרד את התאים מתחתית היטב באמצעות טיפ pipet µL 1,000 קשורה micropipette P1000. להעביר את המדיום המכילות את התאים באמצעות אותו 1,000 µL pipet העצה לרכבת התחתית 15 מ"ל.
- גלולה התאים באמצעות צנטריפוגה ב x 167 g למשך 5 דקות בטמפרטורת החדר. הסר את תגובת שיקוע ולשטוף בגדר תא עם 5 מ של PBS.
- גלולה התאים בפעם השנייה ב 167 x g למשך 5 דקות, להסיר את תגובת שיקוע, ומוסיפים µL 600 פירוק מאגר בגדר תא כדי lyse התאים. לאחר מכן המשך בידוד ה-RNA.
4. RNA בידוד ו- cDNA סינתזה
- לבודד את הרנ א מ- splenocytes באמצעות ערכת חילוץ RNA לפי הנחיות היצרן ולבצע את העיכול הדנ א על עמודות 'אופציונלי'.
- לפני cDNA סינתזה, לקבוע ריכוז ה-RNA באמצעות ספקטרופוטומטרים microvolume כדי לוודא הריכוז בטווח ה-RNA אופטימלית (עד 2 µg) של cDNA סינתזה הערכה.
- CDNA Synthesize עבור כל אחת הדגימות באמצעות ערכת שעתוק במהופך על פי הוראות היצרן. השתמש µL 10 של RNA לכל אחת הדגימות באמצעי אחסון התגובה הכולל 20 µL. בסיום שעתוק לאחור (thermocycler לרוץ) להוסיף 20 μL H2O על כל תגובה.
- לבנות עיקול רגיל באמצעות micropipette P10 או P20 אספנו את ה-mRNA של שליטה כמה דוגמאות (למשל, 5 µL מדגימות 2 על סך של 10 µL) לתוך צינור 0.5 mL כדי להכין את cDNA.
- להוסיף 10 µL 2 x מיקס מאסטר רוורס טרנסקריפטאז.
- בסיום שעתוק לאחור, להוסיף 10 µL של H2O ברכבת התחתית התגובה, אשר ישמש הריכוז ההתחלתי ("1") בסדרת דילול של העקומה סטנדרטי.
- לבצע סדרה 10-fold דילול (1 עד 10-4) על-ידי הוספת 45 µL של מים באמצעות של micropipette P100 או P200 לתוך ארבעה צינורות 0.5 mL המיועד 10-1, 10-2, 10-3, 10-4.
- להוסיף 5 µL הריכוז ההתחלתי "1" לתוך הצינור הראשון (10-1) באמצעות micropipettor P20, מיקס על ידי pipetting למעלה ולמטה מספר פעמים, ואז העברת 5 µL מהצינור 10-1 לתוך הצינור המיועד 10-2 ומיקס.
- להעביר 5 µL באמצעות micropipette P20 מהצינור 10-2 לתוך הצינור המיועד 10-3 ומערבבים. להעביר 5 µL באמצעות micropipettor P20 מהצינור 10-3 לתוך הצינור המיועד 10-4 ומערבבים.
5. כמותיים תגובת שרשרת פולימראזית (qPCR)
- לקבוע כימות היחסי של mRNA רמות על ידי qPCR. במסגרת ניסיוני הגדר, בחר כימיה "כימות – יחסית סטנדרטי עיקול" ו- "TaqMan". שינוי האחסון תגובה ל- 10 µL. להזין את המידע הרלוונטי הפריסה צלחת (למשל, יעד ג'ין, עיקול רגיל, כתב, וכו ').
- הכנת התגובה כך שהוא מכיל 0.5 µL של וזמינותו פריימר/בדיקה, 5 µL של גנים ביטוי מיקס מאסטר, µL 2 H2O ו- 2.5 µL של cDNA (10 – 100 ng).
- להכין תערובת בסיס על-ידי הכפלת כל אחד ריאגנטים הקודם (למעט cDNA) לפי מספר תגובות, וודאו שכללתם את אלה של העקומה סטנדרטי, פקדים שלילי, ביצוע כל התגובה כפילויות, ו 2 תגובות נוספות יעבור לחשבון וריאציה pipetting.
- Pipet 7.5 µL של המיקס מאסטר מוכן לתוך בארות שנקבע מראש בצלחת 96-ובכן התגובה של micropipette או של פיפטה רב-ערוצי. Pipet µL 2.5 של cDNA לתוך הבאר המתאים אלמונים ותקני ולאחר 2.5 µL של H2O לתוך הבארות שליטה שלילי.
- כוללים מבחני פריימר/בדיקה עבור גנים שעון מולקולרי שונים, וכוללים גם של assay עבור פקד אנדוגני (למשל, β-אקטין).
- כדי לקבוע ערכי הביטוי יחסי, לחשב את הכמות היחסית רעה עבור כל שכפול ולאחר מכן, עבור כל דגימה, לחלק את הכמות היחסית רעה עבור הגן היעד על ידי הכמות היחסית רעה עבור β-אקטין.
6. ניתוח סטטיסטי
- באמצעות תוכנת ניתוח סטטיסטי, להזין נתונים לתוכנית תחת האפשרות סטטיסטיקה בעמודה. בחר חד-כיווני אנובה עם הבדיקה לאחר הוק של Dunnett כדי להעריך את ההבדלים בין ערכים רשע שעון גנים לאחר אתגר PAMP לעומת הפקד.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
עכברים הוקרבו ב ZT13, splenocytes היו מבודדים והזמנו שמחוץ עם PAMPs LPS, ODN1826, או HKLM. לאחר 3 שעות, RNA היה מבודד, qPCR שימש להערכת רמות הביטוי היחסי של הגנים שעון מולקולרי השעון, Per2, Dbp, ו- Rev-erbα לעומת תאים שליטה לאתגר. לאחר PAMP אתגר, רמות הביטוי השעון לא היו שונים באופן משמעותי מאשר הביטוי בתאים שליטה (איור 1א'). רמות הביטוי Per2 היו גבוהות משמעותית בתאים הם אתגר LPS ו ODN1826 בהשוואה לאתגר פקדים (איור 1B). LPS היה PAMP רק כדי לשנות את הביטוי Rev-erbα , רמות ה-mRNA היו נמוכים משמעותית מאשר בפקדים לאתגר (איור 1C). לבסוף, משמעותית רמות נמוכות יותר של ה-mRNA נצפו עבור Dbp לאחר אתגר עם כל אחד PAMPs בהשוואה הפקדים (איור 1D). בקנה אחד עם מה בעבר הוכח, כל הגנים שעון הקשורים בחן, Dbp ביטוי נוטה להיות המושפעים ביותר על ידי אתגר PAMP23.
איור 1 : שעון שינו ביטוי גנים ב splenocytes העכבר לאחר שמחוץ PAMP אתגר. Splenocytes היו מבודדים ב ZT13, הם אתגר LPS, ODN1826 או HKLM. רמות ה-mRNA שעון היחסי (מנורמל ל β-אקטין) נקבעו על ידי qPCR 3 h לאחר אתגר. כל נקודת נתונים מייצג את רמת הביטוי של חיה 1. אומר ניסיוני + SEM ניתנת. p < 0.05, * *p < 0.01, * * *p < 0.001. האתגרים המצוין היו שונים באופן משמעותי מהפקד (תאים לאתגר) לפי חד-כיווני אנובה עם הבדיקה לאחר הוק של Dunnett. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
בתוך פרוטוקול זה, ספקטרופוטומטרים microvolume יכול לשמש כדי לכמת ולהעריך את טוהר הרנ א בשימוש בקביעת ביטוי גנים. חומצות גרעין לספוג אולטרא סגול-260 ננומטר, חלבונים בדרך כלל סופגים אור-280 ננומטר, ואילו אחרים מזהמים פוטנציאליים בשימוש במהלך שגרת החילוץ RNA (למשל, פנול) לזיהוי ב- 230 ננומטר. לכן, על-ידי הערכת את ספיגת יחס (א)-260/280 ננומטר (RNA לחלבון) ו- 260/230 nm (RNA לחלבון מזהמים) איכות הרנ א יכול להיות מוערך. RNA באיכות גבוהה יש יחס A260/280 בין 1.8 – 2.1, כמו יחסי נמוך יותר להצביע על זיהום חלבון. דוגמה RNA טהורה יהיה יחס A260/230 של 2.0.
כשתקבע את הביטוי היחסי של גנים היעד (קרי, Per2, שעון, Rev-erbα, ושל Dbp) ג'ין שליטה אנדוגני גם להיות מסומנת (גן בביטוי אילו רמות לא שונות בין דוגמאות). ביטוי היחסי של הגן היעד ואז מנורמל כביטוי של הגן בקרה אנדוגני. הבדלים חומר המוצא (מספר splenocytes), וריאציה של יעילות טרנסקריפטאז, המחירים שונים של RNA השפלה, וכדומה, יתוקנו על ידי הגן בקרה אנדוגני (β-אקטין ב פרוטוקול זה). עם זאת, רצוי לוודא כי הטיפול נבחנות לא תשנה את ביטוי הגן בקרה אנדוגני. זה יכול להתבצע על-ידי הערכת רמות β-אקטין משכפל מספר של מספר שווה של תאים ( לעומת אי-טיפול טיפול). בתיאוריה, רמות β-אקטין שלהם צריכים להיות זהים. גישה אחרת כדי להתגונן מפני שליטה אנדוגני וריאציה יהיה להשתמש פאנל של פקדים אנדוגני (גןלמשל, β-אקטין, Gapdh, ו- 18S rRNA).
כאשר בוחנים את השפעת PAMPs על השעון המולקולרי, שעת היום כאשר עכברים מורדמים, splenocytes לאחר מכן מאותגרים חייב להילקח בחשבון. הביטוי Tlr והיענות שהוצג בעבר כדי להדגים וריאציה תלויות זמן-של-יום8,15, לכן, בשעה של היום, כאשר התגובה TLR הוא בשיאו, העלול לגרום השפעה גדולה יותר על שעון. יתר על כן, ביטוי של גנים שעון מולקולרי גם משתנים לאורך היום splenocytes, לכן, הפחתה של השעון ביטוי גנים בשל PAMP האתגר יהיה המשמעותי ביותר אם בחן במהלך תקופת שיא הביטוי9. מאז Dbp , Rev-erbα הוכחו להפגין ביטוי משמעותי פסגות ב- splenocytes, תאים חיסוניים הטחול בסביבה בהירה-כהה לאטמוספרה 8,9,23, 24 (ZT12), בשיטה הנוכחית, התאים היו מבודדים והזמנו -ZT13 על מנת שיהיה סיכוי גדול יותר על גילוי הפחתה של גנים אלו. לעומת זאת, PAMP זה יכול להגביר את הביטוי שעון, קרוב לוודאי תיענה אם מסתכלים בשעה של היום, כאשר השעון הביטוי הוא הנמוך ביותר.
מאז עכברים הם בעלי חיים ליליים, שלב המנוחה שלהם הוא במהלך תקופת אור, אשר מתאים לפעילות האנושית. לכן, באופן אידיאלי, עכברים להיות בבניין חדר עם תנועה מינימלית, המכילה מכונה רעש לבן כדי להפחית הפרעות בשעות היום כמו זה יכול לשבש את המקצבים השעון הביולוגי של העכברים. יתר על כן, שינויים הכלוב צריך להיעשות הרבה לפני התאריך הניסוי. עבודה בחדר בעלי חיים (כולל המתת חסד של בעלי החיים) במהלך תקופת כהה, וצריך להתנהל תחת אור אדום על מנת למנוע שיבוש המקצבים של העכברים.
מקצבים ההשתנות היומית נחשפים לגירויים סביבתיים (למשל, קל או מזון), אשר מכונים zeitgebers. במקרה של אור/12 h 12 h כהה מחזור, zeitgeber (דהיינו, אור) מאפס את השעון כדי תקופה של 24 שעות. אמנם רוב המקצבים ההשתנות היומית היממה (קרי, יומי מקצבים המתרחשות בהיעדר הסימן החיצוני), הם אינם אמת מקצבים השעון הביולוגי עד הם הוכחו נעים בעלי תקופת משוער 24 שעות בתנאים סביבתיים קבוע . לכן, לבצע הליך זה יכול להיות שימוש בעכברים בתנאים קבועים, אשר יהיה כרוך עכברים entraining למעגל בהירה-כהה, כמתואר לעיל, אבל אז מחזיק החיות בחשכה קבוע כבר 3 ימים לפני דגימה. סוג זה של הניסוי נקרא הניסוי כהה-כהה (DD), נקודת הזמן של דיגום יהיה להתייחס אליו כאל CT (שעון היממה), לא ZT.
אמנם שיטה זו ניתן לזהות PAMPs אשר משנים את השעון ביטוי גנים בתוך splenocytes, זה לא לוקח בחשבון כיצד PAMPs אלה משפיעים על שעון אמן או שעונים היקפי בכל הגוף. מאז הטחול מורכב של אוכלוסיה הטרוגנית של תאים, PAMPs הפרט יכול להשפיע כל סוג התא באופן שונה. לדוגמה, Tlr9 מקצבים ביטוי של הטחול העכבר שונים בין splenocytes, מקרופאגים, תאי B ו- DCs15. בנוסף, Tlr1, Tlr3, Tlr4, Tlr6, Tlr7,ו Tlr8 מוצגים משמעותית תנודות יומיות אוכלוסיה splenocyte חסיד אבל רק Tlr2 ולא Tlr6 חווים מדי יום תנודות מקרופאגים הטחול מועשר24. לכן, על מנת לחקור את התוצאה של אתגר על סוגי תאים בודדים, תאים יכול להיות מבודדים באמצעות מיון תא מגנטי, כפי שתואר קודם לכן9,15 , ואז לאחר מכן תיגר. בנוסף, האוכלוסייה תא הטחול תנודות של מעל מחזור יומי, אשר יכול גם לשחק תפקיד רגישות PAMP מסוים, ההשפעה הבאים על השעון8.
שיטה זו מאפשרת ניתוקה של מספר גדול של תאים חיסוניים המורכבים יוכפל לאחר המרתו של B תאים (~ 58%), T תאים (~ 21%), תאים דנדריטים (~ 5%) ו מקרופאגים (~ 4%)25. מספר גדול של תאים מספק הזדמנות לאתגר את splenocytes עם מגוון של PAMPs בניסוי יחיד. ההליך בידוד splenocyte קל מאוד לביצוע, יכולה להסתיים בתוך דקות (בהתאם מספר בעלי חיים), ועם מינימלית מניפולציה בעלי חיים או סלולרי, אשר חיוני כאשר בוחנים את השעון המולקולרי כי כאמור לעיל, פעולות אלה יכול לשבש את התזמון של השעון, כמו גם גנים שבשליטת שעון. התוצאות עבור הליך זה היו מאוד, כמו לשחזור משמעות בין תיגר תאים לאתגר הושגה עם חיות רק שלושה, התוצאות היו בקנה אחד עם העבודה שפורסמו בעבר23 (איור 1). יצוין, כי הגדלת מספר בעלי חיים לכל קבוצה שאולי חשפו הבדלים משמעותיים סטטיסטית בין קבוצת אתגר לבין שליטה (למשל, ODN 1826, Rev-erbα).
לנוע קדימה, בעוד פרוטוקול זה מטפל רק האפקטים חריפה על ביטוי גנים השעון לאחר אתגר PAMP, זה יכול לספק הוכחת העיקרון לחקירה נוספת. לדוגמה, וזמינותו הזה יכול לשמש כמודל לפענח את המנגנונים המולקולריים בנוגע TLR - PAMP אינטראקציה, כיצד זה משפיע על השעון המולקולרי. זה יכול לשמש גם כדי לקבוע את משך הזמן שלוקח את השעון המולקולרי להתאושש לאחר אתגר PAMP, אשר יכול להיקבע על-ידי עריכת ניסוי זמן-קורס (קרי, הערכת ביטוי לאחר פעמים שונות להציב אתגר). כפי שהוזכר לעיל, הניסויים הבאים יכול להתבצע לבחון את האתגר PAMP על אוכלוסיות תא splenocyte ספציפיים. מאז מספר פתוגנים לעורר TLRs מרובים על הזיהום, זה יהיה מעניין להשתמש בפרוטוקול זה לחקור אם מאתגר עם PAMPs מרובות יש אפקט סינרגיסטי על ביטוי גנים שעון.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
המחבר אין לחשוף.
Acknowledgments
עבודה זו נתמכה על ידי סגל המחקר מעניק מתפקידה המכללה לאמנויות ודין מדעי באוניברסיטת הארטפורד.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Frosted slides | Fisher | 12-550-343 | |
| Cell strainers | Fisher | 22363547 | |
| Lipopolysaccharide | InvivoGen | ltrl-eklps | |
| ODN1826 | InvivoGen | Tlrl-1826-1 | |
| HKLM | InvivoGen | Tlrl-hklm | |
| RPMI 1640 | Gibco | 11875-093 | |
| PBS | Gibco | 20012-043 | |
| RNeasy Mini Kit | Qiagen | 74104 or 74106 | |
| RNase-Free DNase Set | Qiagen | 79254 | |
| 6-well cell culture plate | Denville | T1006 | |
| 50 mL tubes | Corning | 352070 | |
| 15 mL tubes | Corning | 352097 | |
| High Capacity cDNA Reverse Transcription Kit | ThermoFisher | 4368814 | |
| TaqMan Gene Expression Assays b-actin | ThermoFisher | Mm00607939_s1 | |
| TaqMan Gene Expression Assays Per2 | ThermoFisher | Mm00478113_m1 | |
| TaqMan Gene Expression Assays Rev-erba | ThermoFisher | Mm00520708_m1 | |
| TaqMan Gene Expression Assays Bmal1 | ThermoFisher | Mm00500226_m1 | |
| TaqMan Gene Expression Assays Dbp | ThermoFisher | Mm00497539_m1 | |
| qPCR machine StepOnePlus | ThermoFisher | ||
| TaqMan Gene Expression Master Mix | ThermoFisher | 4369016 | |
| MicroAmp Fast 96-well reaction plate (0.1 mL) | ThermoFisher | 4346907 | |
| Statistical Analysis Software | Prism 7.0a |
References
- Bell-Pedersen, D., et al. Circadian rhythms from multiple oscillators: lessons from diverse organisms. Nat. Rev. Genet. 6, 544-556 (2005).
- Mohawk, J. A., Green, C. B., Takahashi, J. S. Central and Peripheral Circadian Clocks in Mammals. Annu. Rev. Neurosci. 35, 445-462 (2012).
- Balsalobre, A., Damiola, F., Schibler, U. A serum shock induces circadian gene expression in mammalian tissue culture cells. Cell. 93, 929-937 (1998).
- Yoo, S. -H., et al. PERIOD2::LUCIFERASE real-time reporting of circadian dynamics reveals persistent circadian oscillations in mouse peripheral tissues. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 101, 5339-5346 (2004).
- Yamazaki, S. Resetting Central and Peripheral Circadian Oscillators in Transgenic Rats. Science. 288, 682-685 (2000).
- Lowrey, P. L., Takahashi, J. S. Genetics of circadian rhythms in mammalian model organisms. Adv. Genet. 74, 175-230 (2011).
- Curtis, A. M., Bellet, M. M., Sassone-Corsi, P., O'Neill, L. A. J. Circadian Clock Proteins and Immunity. Immunity. 40, 178-186 (2014).
- Keller, M., et al. A circadian clock in macrophages controls inflammatory immune responses. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 106, 21407-21412 (2009).
- Silver, A. C., Arjona, A., Hughes, M. E., Nitabach, M. N., Fikrig, E. Circadian expression of clock genes in mouse macrophages, dendritic cells, and B cells. Brain. Behav. Immun. 26, 407-413 (2012).
- Kawai, T., Akira, S. The role of pattern-recognition receptors in innate immunity update on Toll-like receptors. Nat. Publ. Gr. 11, 373-384 (2010).
- Marpegán, L., Bekinschtein, T. A., Costas, M. A., Golombek, D. A. Circadian responses to endotoxin treatment in mice. J. Neuroimmunol. 160, 102-109 (2005).
- Okada, K., et al. Injection of LPS Causes Transient Suppression of Biological Clock Genes in Rats. J. Surg. Res. 145, 5-12 (2008).
- Haimovich, B., et al. In vivo endotoxin synchronizes and suppresses clock gene expression in human peripheral blood leukocytes. Crit. Care Med. 38, 751-758 (2010).
- Curtis, A. M., et al. Circadian control of innate immunity in macrophages by miR-155 targeting Bmal1. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 112, 7231-7236 (2015).
- Silver, A. C., Arjona, A., Walker, W. E., Fikrig, E. The Circadian Clock Controls Toll-like Receptor 9-Mediated Innate and Adaptive Immunity. Immunity. , (2012).
- Gibbs, J. E., et al. The nuclear receptor REV-ERB α mediates circadian regulation of innate immunity through selective regulation of inflammatory cytokines. PNAS. 109, 582-587 (2012).
- Zee, P. C., Attarian, H., Videnovic, A. Circadian rhythm abnormalities. Contin. Lifelong Learn. Neurol. 19, 132-147 (2013).
- Bovbjerg, D. H. Circadian disruption and cancer: sleep and immune regulation. Brain. Behav. Immun. 17, 48-50 (2003).
- Fu, L., Lee, C. C. The circadian clock: pacemaker and tumour suppressor. Nat. Rev. Cancer. 3, 350-361 (2003).
- Germain, A., Kupfer, D. J. CIRCADIAN RHYTHM DISTURBANCES IN DEPRESSION. Hum. Psychopharmacol. 23, 571-585 (2008).
- Basic Mouse Care and Maintenance. JoVE. , Cambridge, MA. JoVE Science Education Database (2018).
- Leary, S., et al. AVMA Guidelines for the Euthanasia of Animals : 2013 Edition. AVMA. , (2013).
- Silver, A. C. Pathogen-associated molecular patterns alter molecular clock gene expression in mouse splenocytes. PLoS One. , 12-15 (2017).
- Silver, A. C., et al. Daily oscillations in expression and responsiveness of Toll-like receptors in splenic immune cells. Heliyon. , 00579 (2018).
- Flow-cytometric Anal. 11 strains mice. MPDJaxpheno6. Mouse Phenome Database web Resour. (RRIDSCR_003212). Jackson Lab. , Bar Harb. Maine USA. Available from: https//phenome.jax.org (2018).
