Summary
Det här protokollet beskriver en teknik som använder musen splenocytes för att upptäcka patogen-associerade molekylära mönster som förändrar molekylära klockan genuttryck.
Abstract
Från beteende till genuttryck reglera dygnsrytmen nästan alla aspekter av fysiologi. Här presenterar vi en metod för att utmana mus splenocytes med patogen-associerade molekylära mönster (PAMPs) lipopolysackarid (LPS), ODN1826 och värmeavdödade Listeria monocytogenes och bedöma deras inverkan på molekylära dygnsrytm klockan. Tidigare har studier fokuserat på att undersöka påverkan av LPS på molekylära klockan med hjälp av en mängd in-vivo och ex vivo metoder från ett sortiment av modeller (t.ex. mus, råtta och mänskliga). Det här protokollet beskriver isolering och utmaningen att splenocytes, liksom metoden att bedöma gen uttryck efter utmaningen klocka via kvantitativ PCR. Detta tillvägagångssätt kan användas för att bedöma inte bara påverkan av mikrobiella komponenter på den molekylära klockan men andra molekyler såväl som kan förändra uttrycket av klockan. Detta synsätt skulle kunna utnyttjas för att retas isär den molekylära mekanismen för hur PAMP-Toll-like receptor interaktionen påverkar klocka uttryck.
Introduction
Masterklockan hos däggdjur som orkestrerar 24 h svängningar för nästan alla aspekter av fysiologi och beteende, är beläget inom suprachiasmatiska kärnan (SCN) av hypotalamus1,2. Förutom att reglera biologiska processer på organismers nivå, synkroniserar masterklockan även perifera cellulära klockor i hela kroppen3,4,5. Medan den molekylära klockan maskinen består av minst tre samverkande transkriptionell-translationell återkopplingar, består kärnan av Period (Per1-3), Cryptochrome (Cry1-2), Bmal1, och klockan gener6,7. Förutom att upprätthålla perfekt timing av core molekylära klockan, vissa accessoriska klocka genprodukter (t.ex. Rev-erbα och Dbp) reglerar också icke-klocka genuttryck, klockan dvs kontrollerade gener (CCGs)6 , 7.
Funktionella molekylära klockor har beskrivits i olika immun vävnader (t.ex., mjälten och lymfkörtlarna)8 och celler (t.ex., B-celler, dendritiska celler, makrofager)8,9. Dessa celler upptäcka och svara på patogen-associerade molekylära mönster (PAMPs), bevarade mikrobiella komponenter, via medfödd immun erkännande receptorer såsom Toll-liknande receptorer (TLR)10. Hittills har har 13 funktionella TLRs beskrivits, som känner igen mikrobiella beståndsdelar såsom bakteriella cellväggen komponenter, flagellar protein och mikrobiell nukleinsyra10. PAMP, lipopolysackarid (LPS), beståndsdel cellväggen i gramnegativa bakterier igen av TLR4, har visat sig förändra dygnsrytmen på både organismer och molekylär nivå. Exempelvis i vivo utmaning av LPS inducerad photic-liknande fas förseningar mätt som aktivitet i möss11 och ledde till minskad klocka genuttryck i SCN och lever enligt fastställt i situ hybridisering och kvantitativ PCR, respektive i råttor12. Efter en i vivo utmaning med LPS avslöjade analys av människans perifera leukocyter13 och subkutan fettvävnad14 förändrat uttryck av flera klocka gener mätt via qPCR. Slutligen, ex vivo LPS utmaningar av mänskliga makrofager och mus peritoneal makrofager, ledde också till förändrad klocka uttryck mätt med qPCR14.
Här beskriver vi ett protokoll för att bedöma påverkan av PAMPs LPS, ODN1826 (syntetiska oligonukleotider som innehåller unmethylated CpG motiv), och värmeavdödade Listeria monocytogenes (HKLM), erkänd av TLR4, TLR9 och TLR2, respektive, på molekylära klockan genuttryck i mus splenocytes. Protokollet innehåller mus splenektomi, splenocyte isolering och utmaning, RNA extraktion, cDNA syntes och qPCR för att bedöma flera klocka genuttryck. Detta protokoll tillåter lägligt förvärvet av ett stort antal immunceller med mycket lite djur eller cellulära manipulation, som sedan kan utmanas ex vivo med olika PAMPs. Den molekylära klockan har visat att modulera olika aspekter av immunsvar8,15,16, därför störningar av molekylära klockan sannolikt skulle försämra korrekt tidsberoende variationen av den immunsvar. Dessutom, eftersom störningar av dygnsrytmen kan leda till allvarliga patologier17,18,19,20, kan det vara av intresse för forskare att utmana splenocytes med ett brett utbud av molekyler och bedöma deras inflytande på klockan.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Under studien, djurens vård och behandling med National Institutes of Health policy, var enligt institutionella riktlinjer och godkändes av universitet i Hartford institutionella djur djurvård och användning kommittén.
1. ångan av djur
Obs: Tjugo veckor gamla B6129SF2/J hanmöss används i studien.
- Dra in möss till en 12 h ljus (standard overhead vitt ljus) / 12 h mörka cykel i 2 veckor innan experimentet.
Obs: Här zeitgeber tid (ZT) 0 motsvarar att lamporna på och ZT12 släckt, samtidigt som alla andra miljöfaktorer (dvs, mat, vatten och rumstemperatur) konstant 21.
2. beredning av instrument, odlingsmedium och utmaning Medium
- Autoklav pincett och dissekera saxen. Wrap par frostat objektglas i aluminiumfolie och autoklav.
- Förbereda odlingsmedium genom att lägga till fostrets bovint serum (FBS) RPMI 1640 till en slutlig koncentration på 10%. Förbereda 10 mL utmaning medium i 50 mL rör genom att lägga till de följande PAMPs odlingssubstratet (RPMI med 10% FBS); LPS (5 µg/mL), ODN1826 (5 µg/mL), värmeavdödade Listeria monocytogenes (108 HKLM/mL), eller en annan PAMP i dess föreslagna koncentrationen.
- Varma odlingsmedium och utmaning medium till 37 ° C i ett vattenbad, och hålla ca 70 mL steril fosfatbuffrad saltlösning (PBS, pH 7,2) vid rumstemperatur.
- Tillsätt 10 mL odlingsmedium med en 10 mL pipett och pipett stöd till en 50 mL tub och plats på isen.
- Lägga till cirka 30 mL 70% etanol i en 100 mL-bägare och plats ändar dissekera sax och pincett i bägaren att förhindra mikrobiell kontamination.
- Förbereda lyseringsbuffert för RNA isolering genom att lägga till 10 µL β-merkaptoetanol (under ett dragskåp) varje 1 ml buffert RLT i en 50 mL tub. Gör endast det belopp som kommer att vara nödvändiga (600 µL per prov, som består av cirka 1 x 106 celler).
Obs: Den buffert RLT är en komponent av RNA extraktion kit som stöder bindningen av RNA till kiseldioxid membranet.
3. Splenocyte isolering och utmaning
- Euthanize möss i taget särskilt zeitgeber via narkos genom att hålla dem i deras ursprungliga bur och lägga till CO2 till buren med en flödeshastighet på 3 L/min. Fortsätt leverera CO2 för 1 min efter andningen stannar.
- Bekräfta död via cervikal dislokation genom att placera tummen och pekfingret på vardera sidan av halsen på basen av skallen. Alternativt kan du trycka en stång vid basen av skallen samtidigt snabbt dra (med den andra handen) med bas i svansen eller bakbenen att orsaka separation av halskotor av skalle22.
- Spray mus stammen med 70% etanol och torka med hushållspapper. Placera musen på dess rygg och något lutande på dess högra sida. Klippa bort päls, använder dissekera sax, längs musens vänstra sida, om halvvägs mellan fram- och bakben.
- Med pincett, greppa bukhinnan och noggrant gör ett snitt så att inte skada mjälten. Ta bort mjälten med pincett och placera i en steril 50 mL tub som innehåller cirka 10 mL av kultur media på is. Upprepa för de återstående djuren.
Obs: Mjälte är färgen på en kidneyböna, och det är längre och flackare än njurarna. -
Överföra en mjälte med 2 mL odlingsmedium till en liten steril petriskål.
- Homogenisera mjälte genom slipning det mellan frostat portion av två sterila frostat bilder. Om möjligt, hålla frågan och celler i mediet under processen homogenisering.
- En gång grundligt homogeniserad, överför med pipett 2 mL av odlingsmedium som innehåller splenocytes genom en 40 µm nylon cell SIL i en 50 mL tub.
- Upprepa stegen ovan för de återstående mjälte med nya par av frostat diabilder, 50 mL rör med odlingsmedium och cell silar.
- Tillsätt 8 mL kall odlingsmedium till var och en av de 50 mL rör som innehåller splenocytes för en total volym på 10 mL/tub. Bestämma antalet celler per milliliter som använder en hemocytometer.
- Lägga till cirka 1 x 106 celler per brunn 6-väl kultur plattor. Lägga till celler till antalet brunnar som motsvarar antalet olika PAMPs som används för experiment och inkluderar en kontroll väl. Lägga till 3 mL odlingsmedium eller 3 mL av utmaning medium respektive brunnarna.
- Inkubera plattorna vid 37 ° C i 5% CO2 för 3 h.
- Skrapa cellerna från botten av den väl med en 1000 µL Pipettera spets bifogas en P1000 mikropipett. Överföra det medium som innehåller celler med samma 1000 µL Pipettera tips till en 15 mL tub.
- Pellet cellerna via centrifugering vid 167 x g under 5 minuter i rumstemperatur. Avlägsna supernatanten och tvätta cellpelleten med 5 mL PBS.
- Pellet cellerna en andra gång vid 167 x g under 5 minuter, avlägsna supernatanten och lägga till 600 μl lyseringsbuffert cellpelleten för att lysera celler. Fortsätt sedan till RNA isolering.
4. RNA isolering och cDNA syntes
- Isolera RNA från splenocytes med hjälp av RNA extraktion kit enligt tillverkarens instruktioner och utföra 'valfria' på-kolumn DNA matsmältningen.
- Innan cDNA syntes, bestämma RNA-koncentrationen med microvolume spektrofotometer för att kontrollera att koncentrationen är inom intervallet för optimal RNA (upp till 2 µg) av cDNA syntes kit.
- Synthesize cDNA för varje prov med hjälp av omvänd Transkription kit enligt tillverkarens anvisningar. Använd 10 µL av RNA för varje prov i en totalt 20 µL reaktionsvolym. Vid slutförandet av den omvänd transkriptionen (termocyklern kör) Tillsätt 20 μL H2O till varje reaktion.
- Konstruera den standard svängda använder en P10 eller P20 mikropipett till pool mRNA från några kontrollprover (t.ex. 5 µL från 2 prover för sammanlagt 10 µL) till en 0,5 mL rör att förbereda cDNA.
- Tillsätt 10 µL 2 x omvänt transkriptas huvudmixen.
- Vid slutförandet av den omvänd transkriptionen, tillsätt 10 µL H2O i reaktionsröret, som fungerar som start koncentrationen (”1”) i spädningsserien för standardkurvan.
- Utföra en 10-faldig utspädning serie (1 till 10-4) genom att lägga till 45 µL av vatten med hjälp av en P100 eller P200 mikropipett i fyra 0,5 mL rör utsett 10-1, 10-2, 10-3och 10-4.
- Tillsätt 5 µL start koncentrationen ”1” i första tuben (10-1) använder en P20 micropipettor, mix av pipettering upp och ner flera gånger, sedan överföra 5 µL från 10-1 röret till röret designerat 10-2 och blanda.
- Överför 5 µL med en P20 mikropipett från 10-2 röret till röret designerat 10-3 och blanda. Överför 5 µL med en P20 micropipettor från 10-3 röret till röret designerat 10-4 och blanda.
5. kvantitativa Polymerase Chain Reaction (qPCR)
- Bestämma relativ kvantifiering av mRNA nivåer av qPCR. Inom den experimentella uppsättningen upp, Välj ”kvantitering – relativa standardkurvan” och ”TaqMan” kemi. Ändra volymen reaktion till 10 µL. Ange relevant information i plattan layouten (t.ex., målgenen, standardkurvan, reporter, etc.).
- Förbereda reaktionen så att den innehåller 0,5 µL primer/sond analysens, 5 µL av gen uttryck master mix, H2O 2 µL och 2,5 µL av cDNA (10 – 100 ng).
- Förbereda en huvudmixen genom att multiplicera vart och ett av de föregående reagenserna (utom cDNA) med antalet reaktioner, se till att inkludera de från standardkurvan, negativa kontroller, utför varje reaktion i dubblett och 2 extra reaktioner som tar hänsyn för pipettering variation.
- Pipettera 7,5 µL av beredda huvudmixen i förutbestämda brunnar i en 96 brunnar reaktion tallrik med en mikropipett eller en flerkanalspipett. Pipettera 2,5 µL cDNA i lämpliga brunnen för de okända och standarder, och 2,5 µL av H2O i negativ kontrollbrunnar.
- Inkluderar primer/sond analyser för olika molekylära klockan gener, och även ett test för en endogen kontroll (t.ex. β-aktin).
- För att bestämma relativa uttryckets värden, beräkna genomsnittlig relativ kvantiteten för varje replikat, sedan, för varje prov, dela upp den genomsnittliga relativa kvantiteten för målgenen av den genomsnittliga relativa kvantiteten för β-aktin.
6. statistisk analys
- Med hjälp av statistisk analysprogramvara, ange data i programmet under alternativet kolumn statistik. Välj en envägs ANOVA med den Dunnetts post hoc-test för att bedöma skillnader mellan medelvärdena för klocka genuttryck efter PAMP utmaning kontra kontroll.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Möss offrades på ZT13, splenocytes isolerades och utmanade ex vivo med PAMPs LPS, ODN1826 eller HKLM. Efter 3 h, RNA isolerades och qPCR användes för att bedöma relativa uttrycksnivåerna för de molekylära klocka gener klocka, Per2, Dbp, och Rev-erbα jämfört med oemotsagda kontroll celler. Efter PAMP utmaning var klocka uttryck inte väsentligt annorlunda än uttryck i kontroll cellerna (figur 1A). Per2 uttrycksnivåerna var signifikant förhöjda i celler utmanas med LPS och ODN1826 jämfört med ohotad kontroller (figur 1B). LPS var den enda PAMP att ändra Rev-erbα uttryck, som mRNA nivåer var betydligt lägre än i kontrollerna ohotad (figur 1C). Slutligen, betydligt lägre mRNA nivåer observerades för Dbp efter utmaning med var och en av PAMPs jämfört med kontroller (figur 1D). Överensstämmer med vad har tidigare visat, av alla de klocka associerade gener undersökas, Dbp uttryck tenderar att påverkas mest av PAMP utmaning23.
Figur 1 : Förändrad klocka genuttryck i mus splenocytes efter ex vivo PAMP utmaning. Splenocytes isolerades på ZT13 och utmanade med LPS, ODN1826 eller HKLM. Relativa klocka mRNA nivåer (normaliserad till β-aktin) bestämdes av qPCR 3 h efter utmaning. Varje datapunkt representerar uttrycket nivå för 1 djur. Experimentella mean + SEM ges. p < 0,05, **p < 0,01, ***p < 0,001. Indikerade utmaningarna var signifikant från kontrollen (ohotad celler) enligt one-way ANOVA med den Dunnetts post hoc-test. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Inom detta protokoll, kan en microvolume spektrofotometer användas för att kvantifiera och utvärdera renheten av RNA som används vid fastställandet av genuttryck. Nukleinsyror absorbera UV-ljus på 260 nm, proteiner normalt absorberar ljus vid 280 nm, medan andra potentiella föroreningar som används under en RNA extraktionsmetod (exempelvis fenol) är detekterbara 230 nm. Därför, genom att bedöma absorbans (A) baserat på 260/280 nm (RNA till protein) och 260/230 nm (RNA till icke-protein föroreningar) kvaliteten på RNA kan bedömas. Hög kvalitet RNA har A260/280-förhållandet mellan 1,8-2,1, som lägre nyckeltal visar protein kontaminering. En ren RNA-prov kommer att ha en A260/230 förhållandet 2.0.
Vid fastställande av det relativa uttrycket för en målgenen (dvs, Per2, klocka, Rev-erbα, och Dbp), en endogen kontroll gen (en gen i vilka uttryck nivåer inte skiljer sig mellan prover) måste också markeras. Relativa uttryck av målgenen är sedan normaliserat att uttrycket av genen endogen kontroll. Skillnader i utgångsmaterialet (antal splenocytes), variation i transkriptas effektivitet, varierande priser av RNA nedbrytning, etc., kommer att korrigeras för av endogen kontroll genen (β-aktin i detta protokoll). Det är dock klokt att kontrollera att den behandling som undersöks inte ändrar uttrycket av genen endogen kontroll. Detta kan åstadkommas genom att bedöma β-aktin nivåer från flera replikat av ett lika stort antal celler (behandling vs. icke-behandling). I teorin, bör deras β-aktin nivåer vara identiska. En annan metod att skydda mot endogen kontroll variant skulle vara att använda en panel av endogena kontroller (t.ex. β-aktin, Gapdh, och 18S rRNA genen).
När granskningen av PAMPs inverkan på molekylära klockan, måste tiden på dagen när möss är euthanized och splenocytes utmanas därefter beaktas. TLR uttryck och lyhördhet har tidigare visats att demonstrera tid-för-dag beroende variation8,15, därför en tid på dagen när TLR lyhördhet är på topp, kan resultera i ett större inflytande på den klockan. Dessutom molekylära klockan genuttryck varierar också hela dagen i splenocytes, en minskning av klocka genuttryck på grund av PAMP utmaning skulle därför vara mest betydande om granskas under tiden av peak uttryck9. Eftersom Dbp och Rev-erbα har visat att påvisa betydande uttryck toppar i splenocytes och mjälten immunceller runt ljus-mörker interphase 8,9,23, 24 (ZT12), i den nuvarande metoden, celler var isolerade och utmanade vid ZT13 för att ha större chans att upptäcka en minskning i dessa gener. Omvänt, en PAMP som kan öka klocka uttryck, troligen skulle observeras om tittar på en tidpunkt på dagen när klockan uttryck är som lägst.
Eftersom möss är nattdjur, är deras resten fasen under perioden ljus, vilket motsvarar mänsklig aktivitet. Därför helst kommer att möss inrymmas i ett rum med minimal trafik och en som innehåller en vitt brus-maskin för att minska dagtid störningar som detta kunde störa dygnsrytmen av möss. Dessutom bör bur ändringar göras i god tid före den experiment. Något arbete i djur rummet (inklusive avlivning av djuren) under den mörka perioden skall utföras under rött ljus för att inte störa rytmer av möss.
Dagaktiva rytmer utsätts för stimuli från omgivningen (t.ex. ljus eller mat), som kallas zeitgebers. När det gäller en 12 h ljus/12 h mörka cykel, zeitgeber (dvs ljus) återställer klockan till en 24 h period. Medan de flesta dagaktiva rytmer är dygnsrytm (dvs dagliga rytmer som uppstå i avsaknad av en extern cue), de är inte sant dygnsrytmen tills de har visat att svänga med en ungefärlig 24 h period under konstanta miljöförhållanden . Därför kunde proceduren utföras med möss under konstanta förhållanden, som skulle medföra Training möss till ljus-mörker cykeln som beskrivs ovan, men sedan hålla djuren i konstant mörker i 3 dagar före provtagning. Denna typ av experiment kallas en mörk-mörk (DD) experimentera och tidpunkten för provtagning skulle betecknas som CT (dygnsrytm tid), inte ZT.
Medan denna metod kan identifiera PAMPs som förändrar klocka genuttryck inom splenocytes, tar det inte hänsyn till hur dessa PAMPs påverka huvudur eller perifera klockor i hela kroppen. Eftersom mjälten består av en heterogen population av celler, kan enskilda PAMPs påverka varje celltyp annorlunda. Till exempel Tlr9 uttryck rytmer i mus mjälten skiljer sig mellan splenocytes, makrofager, B-celler och DCs15. Dessutom Tlr1, Tlr3, Tlr4, Tlr6, Tlr7,och Tlr8 visas betydande dagliga svängningar i en vidhäftande splenocyte befolkning men bara Tlr2 och Tlr6 uppleva dagligen svängningar i berikade mjälten makrofager24. Därför, för att undersöka resultatet av en utmaning på enskilda celltyper, celler kunde isoleras via magnetiska cell sortering, som tidigare beskrivits9,15 och sedan därefter utmanade. Mjälten cell befolkningen varierar dessutom över dagliga cykeln, vilket skulle också kunna spela en roll i känslighet till en viss PAMP och efterföljande inverkan på klockan8.
Denna metod tillåter för isolering av ett stort antal immunceller som består huvudsakligen av B-celler (~ 58%), T-celler (~ 21%), dendritiska celler (~ 5%) och makrofager (~ 4%)25. Det stora antalet celler ger möjlighet att utmana splenocytes med en mängd PAMPs i ett enda experiment. Splenocyte isolering förfarandet är mycket lätt för att utföra, kan slutföras inom några minuter (beroende på antalet djur), och med minimal djur eller cellulära manipulation, vilket är viktigt när man undersöker molekylära klockan eftersom som nämnts ovan, dessa åtgärder kan störa tidpunkten för såväl klockan som klocka-kontrollerade gener. Resultaten för detta förfarande var mycket reproducerbara, som betydelse mellan utmanas och ohotad celler uppnåddes med bara tre djur och resultaten överensstämde med tidigare publicerade arbete23 (figur 1). Det bör noteras att öka antalet djur per grupp kanske visat statistiskt signifikanta skillnader mellan en utmaningsgrupp och kontroll (t.ex. ODN 1826 och Rev-erbα).
Går framåt, medan detta protokoll endast tar upp de akuta effekterna på klocka genuttryck efter PAMP utmaning, kunde det bevisa principen för vidare utredning. Exempelvis denna analys skulle kunna användas som en modell för att dechiffrera de molekylära mekanismerna avseende TLR - PAMP interaktion och hur det påverkar den molekylära klockan. Det kunde också användas för att avgöra hur lång tid det tar för molekylära klockan för att återhämta sig efter en PAMP utmaning, vilket kan avgöras genom att bedriva en tid-kurs-experiment (dvs. att utvärdera uttryck efter olika tider efter utmaning). Som nämnts ovan, kunde efterföljande experiment utföras för att undersöka PAMP utmaning på specifika splenocyte cellpopulationer. Eftersom flera patogener stimulera flera TLRs vid infektion, vore det intressant att använda det här protokollet för att undersöka om utmanande med flera PAMPs har en synergistisk effekt på klocka genuttryck.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författaren har något att avslöja.
Acknowledgments
Detta arbete stöds av fakulteten forskningsanslag från de College of Arts och vetenskaper rektorns kontor på universitet i Hartford.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Frosted slides | Fisher | 12-550-343 | |
| Cell strainers | Fisher | 22363547 | |
| Lipopolysaccharide | InvivoGen | ltrl-eklps | |
| ODN1826 | InvivoGen | Tlrl-1826-1 | |
| HKLM | InvivoGen | Tlrl-hklm | |
| RPMI 1640 | Gibco | 11875-093 | |
| PBS | Gibco | 20012-043 | |
| RNeasy Mini Kit | Qiagen | 74104 or 74106 | |
| RNase-Free DNase Set | Qiagen | 79254 | |
| 6-well cell culture plate | Denville | T1006 | |
| 50 mL tubes | Corning | 352070 | |
| 15 mL tubes | Corning | 352097 | |
| High Capacity cDNA Reverse Transcription Kit | ThermoFisher | 4368814 | |
| TaqMan Gene Expression Assays b-actin | ThermoFisher | Mm00607939_s1 | |
| TaqMan Gene Expression Assays Per2 | ThermoFisher | Mm00478113_m1 | |
| TaqMan Gene Expression Assays Rev-erba | ThermoFisher | Mm00520708_m1 | |
| TaqMan Gene Expression Assays Bmal1 | ThermoFisher | Mm00500226_m1 | |
| TaqMan Gene Expression Assays Dbp | ThermoFisher | Mm00497539_m1 | |
| qPCR machine StepOnePlus | ThermoFisher | ||
| TaqMan Gene Expression Master Mix | ThermoFisher | 4369016 | |
| MicroAmp Fast 96-well reaction plate (0.1 mL) | ThermoFisher | 4346907 | |
| Statistical Analysis Software | Prism 7.0a |
References
- Bell-Pedersen, D., et al. Circadian rhythms from multiple oscillators: lessons from diverse organisms. Nat. Rev. Genet. 6, 544-556 (2005).
- Mohawk, J. A., Green, C. B., Takahashi, J. S. Central and Peripheral Circadian Clocks in Mammals. Annu. Rev. Neurosci. 35, 445-462 (2012).
- Balsalobre, A., Damiola, F., Schibler, U. A serum shock induces circadian gene expression in mammalian tissue culture cells. Cell. 93, 929-937 (1998).
- Yoo, S. -H., et al. PERIOD2::LUCIFERASE real-time reporting of circadian dynamics reveals persistent circadian oscillations in mouse peripheral tissues. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 101, 5339-5346 (2004).
- Yamazaki, S. Resetting Central and Peripheral Circadian Oscillators in Transgenic Rats. Science. 288, 682-685 (2000).
- Lowrey, P. L., Takahashi, J. S. Genetics of circadian rhythms in mammalian model organisms. Adv. Genet. 74, 175-230 (2011).
- Curtis, A. M., Bellet, M. M., Sassone-Corsi, P., O'Neill, L. A. J. Circadian Clock Proteins and Immunity. Immunity. 40, 178-186 (2014).
- Keller, M., et al. A circadian clock in macrophages controls inflammatory immune responses. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 106, 21407-21412 (2009).
- Silver, A. C., Arjona, A., Hughes, M. E., Nitabach, M. N., Fikrig, E. Circadian expression of clock genes in mouse macrophages, dendritic cells, and B cells. Brain. Behav. Immun. 26, 407-413 (2012).
- Kawai, T., Akira, S. The role of pattern-recognition receptors in innate immunity update on Toll-like receptors. Nat. Publ. Gr. 11, 373-384 (2010).
- Marpegán, L., Bekinschtein, T. A., Costas, M. A., Golombek, D. A. Circadian responses to endotoxin treatment in mice. J. Neuroimmunol. 160, 102-109 (2005).
- Okada, K., et al. Injection of LPS Causes Transient Suppression of Biological Clock Genes in Rats. J. Surg. Res. 145, 5-12 (2008).
- Haimovich, B., et al. In vivo endotoxin synchronizes and suppresses clock gene expression in human peripheral blood leukocytes. Crit. Care Med. 38, 751-758 (2010).
- Curtis, A. M., et al. Circadian control of innate immunity in macrophages by miR-155 targeting Bmal1. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 112, 7231-7236 (2015).
- Silver, A. C., Arjona, A., Walker, W. E., Fikrig, E. The Circadian Clock Controls Toll-like Receptor 9-Mediated Innate and Adaptive Immunity. Immunity. , (2012).
- Gibbs, J. E., et al. The nuclear receptor REV-ERB α mediates circadian regulation of innate immunity through selective regulation of inflammatory cytokines. PNAS. 109, 582-587 (2012).
- Zee, P. C., Attarian, H., Videnovic, A. Circadian rhythm abnormalities. Contin. Lifelong Learn. Neurol. 19, 132-147 (2013).
- Bovbjerg, D. H. Circadian disruption and cancer: sleep and immune regulation. Brain. Behav. Immun. 17, 48-50 (2003).
- Fu, L., Lee, C. C. The circadian clock: pacemaker and tumour suppressor. Nat. Rev. Cancer. 3, 350-361 (2003).
- Germain, A., Kupfer, D. J. CIRCADIAN RHYTHM DISTURBANCES IN DEPRESSION. Hum. Psychopharmacol. 23, 571-585 (2008).
- Basic Mouse Care and Maintenance. JoVE. , Cambridge, MA. JoVE Science Education Database (2018).
- Leary, S., et al. AVMA Guidelines for the Euthanasia of Animals : 2013 Edition. AVMA. , (2013).
- Silver, A. C. Pathogen-associated molecular patterns alter molecular clock gene expression in mouse splenocytes. PLoS One. , 12-15 (2017).
- Silver, A. C., et al. Daily oscillations in expression and responsiveness of Toll-like receptors in splenic immune cells. Heliyon. , 00579 (2018).
- Flow-cytometric Anal. 11 strains mice. MPDJaxpheno6. Mouse Phenome Database web Resour. (RRIDSCR_003212). Jackson Lab. , Bar Harb. Maine USA. Available from: https//phenome.jax.org (2018).
