Summary
我们描述了一个协议, 执行一个在子宫内移植 (IUT) 通过静脉注射和羊膜内注射途径的小鼠模型。该协议可用于将细胞、病毒载体和其他物质引入到独特的免疫耐受性胎儿环境中。
Abstract
在子宫移植 (IUT) 是一种独特的和多才多艺的治疗模式, 可用于引进干细胞, 病毒载体, 或任何其他物质早在妊娠期。IUT 治疗目的背后的基本原理是基于胎儿的小尺寸、胎儿的免疫不成熟、胎儿茎或祖细胞的可及性和增殖性, 以及治疗疾病或症状发作的可能性。出生前。利用胎儿的这些正常发育特性,通过IUT 提供造血干细胞 (HSC) 有可能治疗先天性血液病, 如镰状细胞疾病, 而不需要清髓性或免疫抑制的适应需要的产后 HSC 移植。同样, 在发育过程中, 多器官中祖细胞的可获得性可能允许在基因治疗或基因组编辑的病毒载体 IUT 后更有效地靶向茎/祖细胞。此外, IUT 可用于研究正常的发育过程, 包括但不限于免疫耐受的发展。小鼠模型提供了一个有价值和负担得起的手段, 以了解 IUT 的潜力和局限性之前, 临床大动物研究和最终的临床应用。在这里, 我们描述了一个协议, 以执行 IUT 在小鼠胎儿通过静脉和羊膜内路线。该协议已成功地用于阐明宫内造血干细胞移植、耐受诱导和宫内基因治疗的必要条件和机制。
Introduction
最近在产前筛查和诊断方面的进展, 使人有可能治疗胎儿的一些先天性疾病, 没有足够的产后治疗选择, 并导致严重的发病率和死亡率。具体地说,在子宫内造血干细胞移植 (IUHCT) 和基因治疗/基因组编辑有潜力利用胎儿正常发育特性, 以治疗先天性血液, 免疫和遗传障碍比产后 HSC 移植和基因治疗/基因组编辑可以做1,2。具体来说, 由于胎儿的体积小, 捐献者细胞或病毒载体剂量可以被最大化的每一个受体的重量。此外, 胎儿的免疫不成熟允许捐献者 HSCs 注射, 而不需要清髓性和免疫抑制的条件下, 产后移植协议。同样, 携带治疗性转基因或基因组编辑技术的病毒载体也可以在不受转基因产品或病毒载体的限制免疫反应的情况下注射。最后, 胎儿茎/祖细胞的可得性和增殖性为目标祖细胞提供了更有效的转导的可能性, 以及基因组编辑的某些模式 (同源定向修复), 需要循环细胞有效地发生。小鼠模型是一个有洞察力和负担得起的方法, 以解决干细胞生物学和免疫学的重要问题之前, 实验前的大型动物模型, 并因此, 作为一个主要的模式, 其中 IUHCT 和在子宫内基因治疗已经探索了1,2,3。
虽然许多变量在 IUHCT 的成功和在小鼠和大动物模型中的子宫基因治疗/基因组编辑中起着重要作用, 但关键变量是 HSCs 或病毒载体的传递方法。大剂量的捐献者 HSCs 在胎儿肝脏 (IUHCT 时的造血器官) 中发生的第一次效应, 已被证明有助于在小鼠和大型动物模型中实现植入 macrochimeric 水平4 ,5。这是通过在老鼠模型中通过卵黄静脉注入供体细胞和通过心脏内注射的犬模型来实现的。注射途径在发育过程中对不同器官的祖细胞有重要的靶向作用。例如,通过卵黄静脉静脉注射已证明有效地传感器心肌细胞和肝细胞后, 后期妊娠注射6,7。另外, 羊膜内注射病毒载体允许靶向身体暴露的器官根据胚胎折叠/发展在注射8的时候。这是最好的例证, 通过羊膜腔内注射在妊娠晚期, 以利用正常的胎儿 "呼吸" 运动, 这暴露呼吸道的病毒载体的羊水上皮流体9。这两种模式的 IUT, 静脉注射通过卵黄静脉和羊膜内, 已成为过去和正在进行的实验在我们的实验室的基础。在本议定书中, 我们详细描述了在小鼠模型中执行静脉和羊膜内 IUT 的方法。
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Protocol
实验性的议定书得到了费城儿童医院的机构动物护理和使用委员会的批准。
1. 注射吸管的创建
- 使用垂直微拉拔器, 拉出100µL microcapillary 吸管 (图 1A -1C)。校准微拉拔器, 使锥形端 > 1 厘米长。
注意: 最初, 拉拔器的设置应调整为最佳长度。较高的热设置将使尖端更长, 更高的拉动设置将使尖端的直径更窄。 - 切锥形端, 使它是≥1厘米长。确保针尖处的内径介于70µm 和100µm 之间, 并且与锥形端的长度成反比。
注: 内径也取决于微拉拔器的校准。请参阅立式微拉拔器或任何首选微拉拔型的制造商的说明。 - 在确保针有正确的内径, 创建 15-20 度的斜角, 通过锐化尖端使用微 beveller 与钻石磨刀轮 (图 2A -2C)。确保在车轮上轻轻地休息, 没有太大的压力, 以减少打破或破解小费的机会。
注: 画笔可以用来擦去任何在针尖上堆积的碎片。 - 在显微镜下评估尖端, 并确保尖端是圆的, 没有任何芯片或裂纹。重新评估内径, 确保它介于70µm 和100µm 之间 (图 2D -2H)。
- 在针的其余部分绘制线条, 以指定5µL 的体积 (例如, 直径为1.3 毫米的针, 应以3.77 毫米的增量绘制线条)。
- 在手术前用高压釜针, 用无菌手套处理。
2.在子宫内注射
- 提前热处理, 准备必要的仪器。包括必要的仪器, 如 microinjector 针持有人, 外科针驱动程序, 一对 Adson 钳, 一对弯曲的正规组织剪刀, 1 毫升胰岛素注射器, 一对夫妇的棉花尖端喷头, 转移吸管, 一个50毫升圆锥管, 和包 4-0 polyglactin 910 缝合。
- 使用无菌技术, 将针头贴在针架上, 并将其插入 microinjector。
注: 所用压缩氮气的设置如下: 注入 4-6 psi, 平衡 0 psi。根据所注入的东西, 特别是 injectate 的粘度, 以及微的大小, 注射时间变化在 0.3-1.5 s 之间。 - 通过绘制 5-10 µL 的无菌1x 磷酸盐缓冲盐水 (PBS), 清理出任何可能的碎片的针尖, 然后清除它。重复这 2-3x。
- 准备怀孕2至6月大的雌性小鼠进行手术, 用剪刀剃掉他们的腹部。小心不要损坏奶头。管理口服止痛药 (例如, 每只老鼠100µL 1.5 毫克/毫升 meloxicam 口服悬浮液)。
- 开始填充针与所需的材料 (细胞/载体/药物) 在所需的体积。注针时要小心不要折断针尖。
注: 每个胎儿的注射量因具体的实验设计而异。20µL 在注入大量细胞 (即多达 107细胞进入卵黄静脉) 中工作良好。例如, 我们提供了 1 x 107整个骨髓细胞从 C57BL/6 tgn (act EGFP) OsbY01 ["B6 绿色荧光蛋白 (GFP)"] 小鼠通过卵黄静脉到妊娠 day-14 Balb/c 胎儿。对于病毒载体注射, 单一注射10µL 1:1 稀释载体与 PBS 工作良好。 - 要校准注塑时间, 请执行以下步骤。
- 按下 microinjector 上的模式按钮3x 以到达注射校准屏幕。通过添加10或100毫秒的间隔并按下模式按钮2x 来调整注入时间。
- 按下平衡键, 再推一次脚踏踏板。现在再次推踏板, 并评估多少体积是空出的针每推。如果没有校准到所需的体积 5-20 µL 每踏板推, 重复步骤2.6.1 和2.6.2。
注意: 通常情况下, 校准每个推送以一次提供总目标卷的一半是好的。虽然可以注射超过30µL 甚至40µL 的总体积, 我们一般不超过20µL 每胎, 静脉注射或羊膜内。
- 将针头填充到所需的水平。
- 通过调整氧气流量计到1升/分和异氟醚蒸发器到3% 开始向鼠标提供麻醉。
- 通过检查踏板反射是否存在, 确认鼠标是否被麻醉。将鼠标转移到一个仰卧位置的加热垫上。
- 应用润滑剂眼凝胶, 避免角膜干燥。通过将上下四肢贴在垫子上, 将鼠标固定到位。
- 准备腹部与洗必泰擦洗然后酒精和注射局部麻醉剂 (例如, 100 µL 0.25% 布比卡因) 皮下 (图 3a)。
- 用剪刀, 做一个 1-2 厘米皮肤切口, 以便下边界不接近于 1 cm 到 introitus;下面的筋膜很薄, 半透明。
- 识别比周围区域更透明的筋膜中线。小心不要伤害位于中线两侧的上腹血管。如果上腹血管受伤, 请用棉尖喷头按压止血。
- 使用 Adson 钳, 捏筋膜, 而不抓住任何基础器官, 如肠道, 膀胱, 或胎儿。用剪刀打开筋膜, 小心不要损坏任何器官。一旦安全地在腹部, 延长筋膜切口。使它不再比皮肤切口。
- 使用棉尖喷头将肠道移入腹部上部, 从而暴露妊娠子宫。将子宫从切口中取出, 仔细辨认右、左卵巢以确保所有胎儿都被计数 (图 3B)。
- 将左子宫放回腹部, 以便只暴露右侧子宫;这样可以防止子宫的干燥, 使未注射的胎儿保持温暖。
- 在操作者非显性手的拇指和食指之间保持最侧面的胎儿/羊膜囊 (图 3C)。不要对胎儿造成任何伤害, 总是要温柔。
- 定位解剖显微镜 (10X 放大是理想的), 并调整焦点, 使胎儿的看法。调整照明以更好地可视化。
- 确定将注射的部分 (卵黄静脉, 羊膜)。对于静脉注射, 首先可视化卵黄静脉及其吻合术。对于羊膜内注射, 将胎儿定向到右侧。
- 用针到达目标空间, 如下所述。
- 如要静脉注射, 请按如下所示进行。
- 旋转子宫, 使被注射的卵黄静脉与针尖平行;请记住, 注射必须对两个静脉吻合。
- 用5°的角度把针放在子宫上, 刺穿子宫壁。现在, 尖端是在子宫壁和羊膜囊之间, 把尖端直接放在卵黄静脉上方。
- 在近切角上, 将针滑向静脉, 直到斜面刺穿并推进到容器中;这是显而易见的一闪的血液中看到的针尖 (图 3D)。
注: 进入静脉可能需要一些尝试, 因为针可能不会刺穿静脉与第一次滑翔在静脉。
- 对于羊膜内注射, 请按如下所示进行。
- 旋转羊膜囊, 找到一个没有血管刺穿的位置。
- 点针垂直于子宫壁, 刺穿子宫, 蛋黄囊, 然后羊膜囊。小心不要刺穿任何胎儿组织。确保针已经通过四肢之间, 因为这证实了针在羊膜囊。然后继续注射。
- 如要静脉注射, 请按如下所示进行。
- 通过推脚踏板注入适当的材料体积 (通常为 10-20 µL)。
注: 由于喷油器必须始终通过显微镜保持针尖的可视性, 第二人称必须阅读针上的标记, 以量化注入量, 并告知喷油器有多少容积要注射。在注射器和助手之间注入之前的讨论对于避免任何混淆和延迟是很重要的。这是特别重要的静脉注射, 因为延迟切除针将使静脉血液回流到针, 并导致不准确的剂量。 - 一旦所需的体积交付, 从注射部位取出针头。由于血管穿刺部位可能会有一些出血, 静脉注射, 在 10-十五年代保持压力与针一侧止血。
- 继续下一个胎儿继续, 直到所有的胎儿的右子宫角已经注射。
- 从腹部取出左子宫角, 并将右子宫角替换为腹腔内腔。
注: 偶尔, 针需要重新灌装与 injectant。 - 一旦所有胎儿被注射, 将子宫替换成腹部 (图 3E)。确保避免子宫或肠扭转。
- 用一次性转移吸管, 放置大约2毫升 1x PBS 到腹部, 以取代任何昏迷的损失。
- 用 4-0 polyglactin 910 缝合线将筋膜和腹部封闭在一个连续的层中, 以避免在闭合过程中损伤底层器官 (图 3F -3G)。
- 卸下磁带并将鼠标转移到散热灯下面的笼子里。小心不要把热灯太靠近鼠标。确保笼子里有被褥、食物和水。
注意: 还可以使用恒温控制的暖腔。当老鼠直立行走时, 它是清醒的。 - 每天观察鼠标, 并根据需要提供止痛药。
注意: 我们通常在术后1和2天给 meloxicam, 有时在3天, 如果老鼠显示疼痛的迹象。 - 如果用相同的注射材料做分批手术, 用无菌 PBS 清洗注射针。如果用不同的材料注射, 将针放在锋利的容器中, 再用一根新针。
注: 我们建议在出生后立即用替代水坝培育幼崽, 以防大坝对 injectant 免疫反应, 并通过母乳将抗体转移到幼崽身上。
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Representative Results
生存和植入是 IUHCT 实验成功的重要措施。根据实验的特定端点, 接受 IUHCT 的胎儿可以通过 C 节或后天产前分析。平均来说, 静脉注射后的存活率从 75-100% 不等。羊膜内注射后的存活率比静脉注射的效果好, 约为 85-100%。
在我们的实验室里, 达到这些技术熟练程度的训练过程大约需要 8-12 月。为了评估获得以可重现的方式执行这些注射所需的技能, 受训者在 IUT 后的短时间点监测胎儿存活率和供体细胞植入。下面的质量控制实验证明了这一点。具体地说, 1 x 107全骨髓细胞从 C57BL/6 tgn (act EGFP) OsbY01 ("B6 GFP") 小鼠, 如前所述5 , 并通过卵黄静脉注入妊娠 day-14 Balb/c 胎儿。在一个小组中, IUT 是由一位经验丰富的讲师, 在另一组由一名受训者进行了4月的训练。在图 4A中, IUT 24 小时后所收获的胎儿肝脏的代表性荧光显微图像。接受实习生 IUT 的胎儿的肝脏荧光较少, 因为移植的 GFP 细胞植入较低。然后用流式细胞仪对荧光蛋白+供体细胞进行分析, 以量化植入水平。两个注射器的平均植入水平的差异与荧光显微镜下看到的图像相关 (图 4B)。
在羊膜腔内注射 Ad GFP (腺病毒载体) 后,通过羊膜腔内通路向传感器细胞传递的病毒载体的能力由48小时的上皮细胞转导为例。携带 GFP 转基因10) 在妊娠 day-12.5 胎儿 (图 5A和5B)。
图 1.用微拉拔器制作玻璃吸管针的过程.(A) 安装玻璃吸管并通过拧紧拉拔器两侧的表盘来确保其安全。(B) 一旦安全, 拉动开关就会激活热量。显示的设置是热 #1: 985 和拉:27。在这个过程中, 应关闭暗盖玻璃的安全。它为拍摄目的被打开了。(C) 微分开。丢弃底部部分, 并将分离的微的顶部部分用于下一个步骤。请单击此处查看此图的较大版本.
图 2.磨削微的过程, 以形成针的尖端.(A) 此面板显示磨削的一般设置。需要光源在显微镜下可视化尖端。(B和C) 以15的角度安装微。(D) 在整个磨削过程中, 预计会有碎片堆积。使用画笔清除尖端, 以获得更好的可视化磨削过程。(E) 在4X 放大倍数下显示没有任何可识别芯片或锯齿边缘的井地针尖。(F、 G和H)在10X 放大倍数下对地针进行重新检查, 显示了一根有尖尖和尖端周围光滑边缘的井地针。一定要用不同的角度检查针。请单击此处查看此图的较大版本.
图 3.剖腹手术和宫内移植.(a) 刮胡子, 麻醉, 贴上怀孕的水坝, 准备她的腹部。(B) 在剖腹手术后, 将子宫外的全部全部提供给所有胎儿。(C) 用外科医生的非显性食指和拇指定位胎儿, 同时保持与第三手指的张力。在显微镜下识别与胎儿有关的针尖。(D) 在卵黄静脉插管时, 必须看到微针流出的血液闪光。(E) 所有注射完成后, 将所有胎儿放回腹部。(F) 用 4-0 polygalactin 910 缝线缝合单层连续缝合腹部。(G) 一旦腹部完全闭合, 让大坝在热灯下恢复。请单击此处查看此图的较大版本.
图 4.卵黄静脉注射后供体全骨髓单个核细胞植入.(A) 植入的程度与 (受训者) 和没有 (讲师) 的区别在荧光显微镜下清楚地显示细胞的渗漏。(B) 嵌合体的百分比也反映了流式细胞术分析显示的相同发现。每个数据点都代表来自不同注射胎儿的肝脏。实验由一名实习生和一名讲师进行。误差线表示标准偏差 (SD)。请单击此处查看此图的较大版本.
图 5.羊膜内注射 Ad GFP 后48小时内绿色荧光蛋白在胎儿胚胎中的表达模式.(A) 本小组在 E12.5 (E12.5/E14.5) 内注射 Ad gfp 后, 在 E14.5 中显示角膜 (红色箭头) 和与 gfp 染色的皮肤。(B) 在更高的放大倍数下, 胚胎背面的 cryosection (在面板a中用浅蓝色框表示) 表明病毒转导仅限于表面 peridermal 细胞层 (红色箭头) 而非表皮 (epi)。请单击此处查看此图的较大版本.
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Discussion
在子宫移植是一个潜在的治疗许多先天性疾病, 可以诊断早期在妊娠期。IUT 的小鼠模型允许研究人员探索胎儿环境或尝试不同的治疗方法。根据正在注射的东西和被靶向的,在子宫内移植中静脉注射或羊膜腔可以提供可靠的 injectant 到所需的空间。
当靶向特定器官时, 选择合适的胎儿胚胎年龄以及注射技术是很重要的。虽然静脉注射细胞在 E14 是理想的靶向血液的利基, 和羊膜内注射在 E16 是理想的肺靶向, 这些不是唯一的选择可用。例如, 早在 E8 超声引导8的情况下, 就可以对胎儿进行羊膜内注射。在 E9-E1011E14 超声引导心脏内注射之前, 也有可能进行全身分娩。在胎儿发育的各个阶段进行注射的可行性, 为研究基因转移和细胞移植的安全性和效率, 以及调查发育的基本问题提供了巨大的潜力。生物学。
此外, 除了静脉注射和羊膜内分娩外, 还可根据治疗的目的或正在进行的科学问题, 为目标提供其他地点。子宫内肌法已用于肌肉白斑12的基因转移, 脊髓运动神经元转导的椎管内方法13, 和颅内方法的基因转移到目标中枢神经系统疾病14。在子宫内造血细胞移植中, 肝内和腹腔的路线是额外可行的选择, 因为每一个分娩路线最终目标的造血利基15。然而, 静脉移植的途径允许更有效地将供体细胞归入造血小生境, 并对捐献细胞进行更大剂量的治疗, 从而导致整体更高水平稳定的长期供体细胞植入, 而不增加了胎儿死亡率1。
我们在上面为执行 IUT 详细的协议是强有力和多才多艺的工具, 允许一个独特的体内方法研究干细胞生物学, 发展免疫学和免疫耐受诱导, 发育生物学, 和产前基因治疗/基因组编辑。这些分娩方法也有相关的临床意义, 并已成为研究的基础上 IUHCT 和在子宫内基因治疗的前临床大动物模型, 如犬和绵羊模型4,16。他们将继续作为一个宝贵的工具来测试发展生物学中的新想法, 并探索新的治疗方法, 破坏性先天遗传, 血液, 免疫和代谢紊乱。
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Disclosures
作者没有什么可透露的。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Gloves | Cardinal Health | 2D73DP65 | |
| Adson Forceps w/ teeth | Fine Science Tools | 11027-12 | |
| Adson Forceps w/o teeth | Fine Science Tools | 11006-12 | |
| Curved scissors | Fine Science Tools | 14075-11 | |
| Heavy Scissors | Fine Science Tools | 14002-13 | |
| Needle Driver | Fine Science Tools | 12005-15 | |
| Vicryl 2.0 | Ethicon | JB945 | |
| Transfer Pipette | Medline | GSI135010 | |
| Cotton Tipped Applicators | Medline | MDS202000 | |
| 50 mL Conical tube | Fischer Scientific | 14-432-22 | |
| Tape | 3M | 1527-1 | |
| Eye lubricant | Major LubriFresh | 0904-6488 | |
| Heating Pad | K&H | 3060 | |
| Stereomicroscope | Leica | MZ16 | |
| Injector | Narishige | HI01PK01 | |
| Glass Capillary tubes | Kimble | 71900-100 | |
| Vertical Micropipette Puller | Sutter Instruments | P-30 | |
| Microelectrode Beveler | Sutter Instruments | BV-10 | |
| IM-300 Pneumatic Microinjector | Narishige | IM-300 | |
| Insulin Syringe | BD | 305935 | |
| Filter | Genesee Scientific | 25-244 | |
| Compac5 Anesthesia Machine | VetEquip Compac5 | 901812 | |
| Isoflurane | Piramal Critical Care | NDC 66794-017-25 | |
| N2 gas | Airgas | NI 125 | |
| O2 gas | Airgas | OX 125 | |
| Ad-GFP viral vector | Penn Vector Core | H5'.040.CMV.eGFP |
References
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