Summary
يمكننا وصف بروتوكول لأداء في الرحم زرع (الجامعة الإسلامية للتكنولوجيا) عن طريق الحقن الوريدي وداخل السلي طرق الحقن في نموذج مورين. يمكن استخدام هذا البروتوكول لإدخال الخلايا والنواقل الفيروسية، وغيرها من المواد في البيئة الجنينية المناعي متسامح فريدة من نوعها.
Abstract
الزرع في الرحم (الجامعة الإسلامية للتكنولوجيا) هو وضع فريد وتنوعاً للعلاج التي يمكن استخدامها لإدخال الخلايا الجذعية، والنواقل الفيروسية، أو أي مواد أخرى في أوائل الحمل. ويستند الأساس المنطقي وراء الجامعة الإسلامية للتكنولوجيا لأغراض علاجية صغر حجم الجنين والنضج المناعية الجنين، وإمكانية الوصول وطبيعة التكاثري للخلايا الجنينية الجذعية أو السلف، وإمكانات لعلاج مرض أو ظهور الأعراض قبل الولادة. الاستفادة من هذه الخصائص الإنمائية الطبيعي للجنين، إيصال الخلايا الجذعية المكونة للدم (HSC) عن طريق الجامعة الإسلامية للتكنولوجيا لديها القدرة على علاج الاضطرابات الدموية الخلقية مثل مرض الخلية المنجلية، دون المطلوب ميلوابلاتيفي أو كآبته التكييف اللازمة لعمليات زرع الأعضاء HSC بعد الولادة. وبالمثل، يحتمل أن تكون إمكانية الحصول على خلايا السلف في الأجهزة متعددة أثناء تطوير يسمح لاستهداف أكثر كفاءة للخلايا الجذعية/السلف بعد الجامعة الإسلامية للتكنولوجيا نواقل الفيروسية للعلاج بالجينات أو الجينوم تحرير. بالإضافة إلى ذلك، الجامعة الإسلامية للتكنولوجيا يمكن استخدامها لدراسة العمليات التنموية العادية بما في ذلك، لكن ليس على سبيل الحصر، تنمية التسامح المناعية. ويوفر الطراز مورين وسيلة قيمة وأسعار معقولة لفهم إمكانيات وحدود الجامعة الإسلامية للتكنولوجيا قبل الدراسات الحيوانية الكبيرة قبل الإكلينيكية وتطبيق السريري في نهاية المطاف. هنا، يمكننا وصف بروتوكول للمنفذ الجامعة الإسلامية للتكنولوجيا في الجنين مورين من خلال طرق الحقن الوريدي وداخل السلي. هذا البروتوكول قد استخدمت بنجاح توضيح الشروط اللازمة والآليات وراء زرع الخلايا الجذعية المكونة للدم في الرحم والحث على التسامح في الرحم العلاج الجيني.
Introduction
التقدم الذي أحرز مؤخرا في الفحص قبل الولادة والتشخيص قد سلطت الضوء على إمكانية علاج الجنين لعدد من الاضطرابات الخلقية التي ليس لديها خيارات العلاج الملائم بعد الولادة وينتج كبيرة في معدلات الاعتلال والوفيات. على وجه التحديد، في الرحم زرع الخلايا الجذعية المكونة للدم (ايوهكت) وتحرير العلاج/الجينوم الجينات لديها القدرة على الاستفادة من خصائص الإنمائية الطبيعي للجنين لعلاج الخلقية الدموية والمناعية والوراثية اضطرابات أكثر كفاءة مما زرع HSC بعد الولادة وتحرير العلاج/الجينوم الجينات يمكن أن تفعل1،2. على وجه التحديد، نظراً لصغر حجم الجنين، الخلية المانحة أو الجرعة النواقل الفيروسية يمكن تعظيم كل وزن المستلم. بالإضافة إلى ذلك، يسمح عدم النضج المناعية للجنين المانحة هسكس بالحقن دون ميلوابلاتيفي وتكييف كآبته التي مطلوب في البروتوكولات زرع بعد الولادة. وبالمثل، يمكن حقن النواقل الفيروسية يحمل على التحوير العلاجية أو تكنولوجيا الجينوم التحرير دون استجابة المناعة تحد للمنتج التحوير أو ناقلات الأمراض الفيروسية. وأخيراً، إمكانية الوصول وطبيعة التكاثري للخلايا الجذعية الجنينية/السلف تتيح إمكانية توصيل أكثر كفاءة للخلايا الهدف السلف، فضلا عن أوضاع معينة للجينوم التحرير (الموجه من التماثل إصلاح) التي تتطلب ركوب الدراجات الخلايا إلى حدوث كفاءة. نموذج مورين بمثابة وسيلة الثاقبة وميسورة التكلفة لمعالجة المسائل الهامة في بيولوجيا الخلايا الجذعية وعلم المناعة قبل التجريب في نماذج حيوانية كبيرة قبل الإكلينيكية، وعلى هذا النحو، كانت بمثابة النموذج الأساسي ايوهكت و في الرحم العلاج الجيني قد استكشفت1،،من23.
على الرغم من أن العديد من المتغيرات دوراً هاما في نجاح ايوهكت و في الرحم الجينات العلاج/الجينوم التحرير في نماذج حيوانية موريني وكبير، هو متغير رئيسي طريقة تسليم هسكس أو النواقل الفيروسية. تقديم جرعات كبيرة من المانحين هسكس مع تأثير تمرير الأولى التي تحدث في الكبد الجنين، وهو الجهاز المكونة للدم في وقت ايوهكت، قد ثبت أن تكون أداة فعالة في تحقيق مستويات ماكروتشيميريك engraftment في الماوس ونماذج حيوانية كبيرة4 ،5. وكان هذا يتحقق عن طريق حقنه من المانحين الخلايا عن طريق الوريد فيتيلين في طراز الماوس و عن طريق حقن داخل القلب في نموذج الكلاب البوليسية. طريق الحقن أيضا دوراً أساسيا في استهداف الخلايا السلف من مختلف الأجهزة أثناء التطوير. على سبيل المثال، قد ثبت حقن عن طريق الوريد فيتيلين كفاءة ترانسدوسي كارديوميوسيتيس وخلايا الكبد بعد6،حقن7الحمل متأخر. بدلاً من ذلك، يسمح حقن داخل السلي من النواقل الفيروسية استهداف الأجهزة التي يتعرض لها فعلياً على أساس الجنينية قابلة للطي/تطوير وقت الحقن8. هذا هو أفضل مثال على باستهداف من الظهارة التنفسية عن طريق حقنه داخل السلي في أواخر الحمل للاستفادة من حركات طبيعية الجنين "التنفس"، الذي يعرض الجهاز التنفسي لناقلات الأمراض الفيروسية في السلوى 9من السوائل. هذين الوضعين من الجامعة الإسلامية للتكنولوجيا، عن طريق الحقن عبر الوريد فيتيلين وداخل السلي، وكانت أساسا للعديد من التجارب الماضية والجارية في المختبر. في هذا البروتوكول، يصف لنا بالتفصيل الأساليب لأداء الجامعة الإسلامية للتكنولوجيا عن طريق الحقن الوريدي وداخل السلي في نموذج مورين.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
تمت الموافقة على البروتوكولات التجريبية "لجنة الاستخدام" في مستشفى فيلادلفيا "الأطفال" و "رعاية الحيوان المؤسسية".
1-إنشاء الماصات حقن
- استخدام ساحبة ميكروبيبيتي رأسي، سحب ماصة ميكروكابيلاري 100 ميليلتر (الشكل 1A -ج 1). معايرة ساحبة ميكروبيبيتي حيث يكون نهاية مدبب > 1 سم طويلة.
ملاحظة: في البداية، إعدادات ساحبة ينبغي أن تعدل لفترة أمثل. سوف تجعل إعداد حرارة أعلى تلميح أطول، وإعداد سحب أعلى سيجعل قطر الطرف أضيق. - قطع نهاية مدبب حيث أنها ≥ 1 سم طويلة. ضمان أن قطرها الداخلي في طرف الإبرة ما بين 70 ميكرومتر و 100 ميكرومتر، وأن يتناسب عكسيا مع طول نهاية مدبب.
ملاحظة: قطرها الداخلي يعتمد أيضا على معايرة ساحبة ميكروبيبيتي. راجع الإرشادات من الشركة المصنعة ساحبة ميكروبيبيتي العمودي أو أي نوع من أنواع ساحبة ميكروبيبيتي المفضل. - بعد التأكد من أن الإبرة قطرها الداخلي الصحيح، إنشاء المجسم مشطوف الحواف من 15-20 درجة بشحذ تلميح استخدام ببلير ميكروبيبيتي مع الماس شحذ عجلة (الشكل 2 ألف -2 (ج)). تأكد من بقية تلميح بلطف على عجلة القيادة دون الكثير من الضغوط، لتقليل فرص كسر أو تكسير التلميح.
ملاحظة: يمكن استخدام الرسام مسح أي حطام يتراكم على طرف إبرة بعيداً. - تقييم تلميح تحت مجهر والتأكد من أن التلميح جولة دون أي شقوق أو رقائق. إعادة تقييم القطر الداخلي للتأكد من أنه من بين 70 ميكرومتر و 100 ميكرومتر (الشكل 2D -ح 2).
- رسم خطوط على بقية الإبرة لتعيين 5 ميليلتر من حجم بينهما (مثلاً، ينبغي أن يكون الإبر مع قطرها داخلي مم 1.3 الخطوط المرسومة في زيادات 3.77 ملم).
- اﻷوتوكﻻف مسبقة الإبر لاستخدامها في الجراحة والتعامل معها بقفازات معقمة.
2-الحقن في الرحم
- إعداد الصكوك اللازمة بالتعقيم لهم قبل الموعد المحدد. وتشمل الأدوات الأساسية مثل حامل إبرة ميكروينجيكتور، سائق إبرة جراحية، وزوج من الملقط أدزون، زوج من مقص منحنى الأنسجة العادية، وحقنه الأنسولين 1 مل، زوجين من القطن-نصيحة قضيب تطبيق، ماصة نقل، أنبوب مخروطي 50 مل، حزمة من خيوط بوليجلاكتين 910 4-0.
- باستخدام تقنية معقمة، إرفاق الإبرة لحامل الإبرة وتوصيله ميكروينجيكتور.
ملاحظة: إعدادات النيتروجين مضغوط يستخدم كما يتبع: حقن هذه المبادرة 4-6، وموازنة 0 رطل/بوصة مربعة. اعتماداً على ما يتم حقنها، على وجه التحديد، لزوجة إينجيكتاتي، وكذلك حجم ميكروبيبيتي، وقد تختلف أوقات الحقنة بين 0.3-1.5 s. - تنظيف تلميح إبرة أي حطام ممكن برسم 5-10 ميكروليتر معقمة 1 × مخزنة الفوسفات المالحة (PBS) وثم مسحه من. كرر هذا x 2-3.
- إعداد الفئران الإناث 2-6 شهرا حاملا للجراحة بحلق على البطن مع المقص. أن الحرص على عدم الأضرار الحلمات. إدارة الدواء الألم عن طريق الفم (مثلاً، 100 ميليلتر 1.5 ملغ/مل ميلوكسيكام تعليق الشفوي للماوس).
- بدء شغل الإبرة مع المواد المطلوب (الخلايا ناقلات/مدمني المخدرات) على وحدة التخزين المطلوبة. أن يكون حريصا على عدم كسر طرف الإبرة بينما شغل الإبرة.
ملاحظة: يختلف حجم الحقنة الواحدة الجنين استناداً إلى تصميم تجريبية محددة. 20 ميليلتر تعمل بشكل جيد عن طريق الحقن عدد كبير من الخلايا (أيما يصل إلى 107 الخلايا الوريد فيتيلين. على سبيل المثال، أننا خلصنا 1 × 107 كله نخاع العظم خلايا معزولة من OsbY01 C57BL/6TgN(act-EGFP) ["B6 أخضر نيون البروتين (بروتينات فلورية خضراء)"] الفئران عن طريق الوريد فيتيلين إلى الحملي الأجنة بالب/ج 14 يوم. لحقن النواقل الفيروسية، حقنه واحدة من 10 ميليلتر من ناقل المخفف 1:1 مع برنامج تلفزيوني يعمل بشكل جيد. - لمعايرة الوقت الحقن، اتخاذ الخطوات التالية.
- الدفع واسطة الزر x 3 في ميكروينجيكتور الحصول على حقن معايرة الشاشة. ضبط وقت الحقن عن طريق إضافة فترات 10 أو 100 مللي ثانية ودفع وضع زر 2 x.
- الضغط على زر التوازن ودفع دواسة القدم مرة واحدة. الآن دفع الدواسة مرة أخرى وتقييم يتم إفراغ كم حجم من الإبرة الواحدة والدفع. إذا كان عدم معايرة لوحدة التخزين المطلوبة من 5-20 ميليلتر لدفع دواسة، كرر الخطوتين 2.6.1 و 2.6.2.
ملاحظة: عموما، أنها جيدة لمعايرة كل دفعة لتسليم نصف وحدة التخزين الهدف الكلي في وقت واحد. وفي حين أنه من الممكن لحقن ميليلتر أكثر من 30 أو حتى 40 ميليلتر من الحجم الإجمالي، لا عموما نذهب أكثر من 20 ميليلتر للجنين، عن طريق الحقن الوريدي أو داخل السلي.
- شغل الإبرة تصل إلى المستوى المطلوب.
- بدء تسليم التخدير للماوس عن طريق ضبط مقياس الأكسجين في التدفق إلى 1 لتر في الدقيقة والمبخر isoflurane إلى 3%.
- تأكيد ما إذا كان الماوس هو تخديره قبل التحقق من غياب منعكس الدواسة. نقل الماوس إلى وسادة تدفئة في موقف ضعيف.
- تطبيق هلام العين زيوت التشحيم لتجنب جفاف القرنية. تأمين الماوس في المكان بتسجيل أطرافه العلوية والسفلية اللوحة.
- الإعدادية في البطن مع فرك الكلورهيكسيدين متبوعاً بالكحول وحقن مخدر موضعي (مثلاً، 100 ميليلتر من 0.25% bupivacaine) تحت الجلد (الشكل 3أ).
- مع مقص، جعل شق جلد 1-2 سم حيث أن الحدود الدنيا ليس أقرب من 1 سم إلى إينترويتوس؛ فآسيا تحت رقيقة جداً وشفافة.
- تحديد خط الوسط لفافة وأكثر شفافية من المنطقة المحيطة بها. احرص على عدم إيذاء شرسوفي السفن التي تقع على جانبي خط الوسط. وينبغي الحصول على إصابة سفن شرسوفي، عقد الضغط مع قضيب تطبيق القطن-نصيحة وقف النزيف.
- استخدام الملقط أدسون، قرصه اللفافة دون الاستيلاء على أي من الأجهزة الأساسية مثل الأمعاء أو المثانة، أو الأجنة. فتح اللفافة مع مقص، مع الحرص على عدم إتلاف أي من الأجهزة. مرة واحدة بأمان في البطن، تمديد شق اللفافي. أن لم يعد من شق الجلد.
- استخدم قضيب تطبيق القطن-نصيحة لتحريك الأمعاء في الجزء العلوي من البطن، مما يعرض الرحم جرابيد. تسليم الرحم من الشق، بعناية تحديد المبيضين الأيمن والأيسر لضمان يتم عد جميع الأجنة (الشكل 3ب).
- وضع الرحم الأيسر مرة أخرى في البطن حيث يتعرض لها فقط حق الرحم؛ وهذا يمنع جفاف الرحم وتبقى الأجنة غير حقن الحارة.
- أمسك الكيس الجنين/السلي آخر الأفقي بين الإبهام ومؤشر أصابع اليد غير المهيمنة للمشغل (الشكل 3ج). دائماً يكون لطيف حيث لا تسبب أي ضرر للأجنة.
- ضع المجهر تشريح (تكبير X 10 مثالي) وضبط التركيز حيث يكون الجنين في طريقة العرض. ضبط الإضاءة لتصور أفضل.
- تحديد الجزء الذي سوف تحقن (الوريد فيتيلين، amnion). للحقن الوريدي، تصور الأوردة فيتيلين وملامسة بهم أولاً. للحقن داخل السلي، توجيه الجنين مع الجانب الأيمن في طريقة العرض.
- تصل المساحة المستهدفة مع الإبرة كما هو موضح أدناه.
- الحقن الوريدي، القيام بما يلي.
- استدارة الرحم حيث يكون على المنوال فيتيلين التي يتم حقنها موازية لطرف الإبرة؛ نأخذ في الاعتبار أنه يجب إجراء الحقن نحو ملامسة الأوردة اثنين.
- وضع الإبرة في الرحم بزاوية 5 درجات واختراق جدار الرحم. الآن بعد أن الحافة بين جدار الرحم والكيس الذي يحيط بالجنين، ضع نصيحة مباشرة فوق الوريد فيتيلين.
- زاوية عرضية تقريبا، تنزلق الإبرة على هذا السياق حتى يثقب المجسم مشطوف الحواف والسلف إلى السفينة؛ وهذا واضح بومضة من الدم ينظر في تلميح إبرة (الشكل 3د).
ملاحظة: الوصول إلى هذا السياق قد يستغرق بضعة يحاول كما الإبرة قد لا بيرس الوريد مع الانزلاق الأول عبر الوريد.
- الحقن داخل السلي، القيام بما يلي.
- استدارة الكيس السلوى والعثور على مكان خال من السفن بيرس.
- نقطة إبرة عمودي على جدار الرحم واختراق عن طريق الرحم وكيس ألمح، ومن ثم الكيس الذي يحيط بالجنين. كن حذراً لا لاختراق عن طريق أي الأنسجة الجنينية. تأكد من أن الإبرة اجتاز بين أطرافه، وهذا يؤكد أن الإبرة في الكيس الذي يحيط بالجنين. ثم المضي قدما الحقن.
- الحقن الوريدي، القيام بما يلي.
- حقن ملائمة حجم المواد المطلوب (عادة 10-20 ميليلتر) عن طريق دفع دواسة القدم.
ملاحظة: سبب محقن يجب الحفاظ على تصور طرف الإبرة من خلال المجهر في جميع الأوقات، شخص ثاني يجب قراءة علامات على الإبرة لتحديد مقدار المبلغ الذي تم ضخه وإبلاغ محقن كم حجم متروك لحقن. نقاش قبل الحقن بين حاقن ومساعد أمر هام لتجنب أي التباس والتأخير. هذا مهم خاصة للحقن الوريدي نظراً لتأخر إزالة الإبرة سيسمح الدفق الوريدية الدم في الإبرة وينتج جرعات غير دقيقة. - سحب الإبرة من موقع الحقن حالما يتم تسليم وحدة التخزين المطلوبة. كما قد يكون هناك بعض نزيف من السفينة ثقب الموقع مع الحقن الوريدي، عقد الضغط مع الجانب من الإبرة ل 10-15 ثانية وقف النزيف.
- المضي قدما للجنين القادم. أن يستمر وقد تم حقن جميع الأجنة القرن الأفريقي حق الرحم.
- إزالة القرن الرحم الأيسر من البطن واستبدال القرن الرحم حق العودة داخل التجويف البريتوني.
ملاحظة: في بعض الأحيان، يحتاج إلى تعبئتها مع إينجيكتانت الإبرة. - بمجرد قد تم حقن جميع الأجنة، تحل محل الرحم في البطن (الشكل 3ه). تأكد من تجنب انفتال الرحم أو الأمعاء.
- مع ماصة نقل المتاح، مكان تقريبا 2 مل من 1 x برنامج تلفزيوني في البطن ليحل محل أي خسائر أول.
- إغلاق فآسيا والبطن في طبقة واحدة مستمرة باستخدام خيوط 910 بوليجلاكتين 4-0 لتجنب إصابة الأجهزة الأساسية أثناء الإغلاق (الرقم 3F --الجيل الثالث 3g).
- قم بإزالة الشريط ونقل الماوس إلى قفص تحت مصباح حرارة. احرص على عدم وضع مصباح الحرارة قريبة جداً للماوس. تأكد من القفص الأسرة والغذاء والمياه.
ملاحظة: كما يمكن استخدام غرفة دافئة حرارياً التي تسيطر عليها. الفأر مستيقظا عندما يكون منتصبا وسيرا على الأقدام. - ملاحظة الماوس يوميا وإعطاء الدواء الألم حسب الحاجة.
ملاحظة: بشكل روتيني نعطي ميلوكسيكام في أيام بعد العملية الجراحية 1 و 2، وفي بعض الأحيان في اليوم 3 إذا كان الماوس يظهر علامات ألم. - في حالة القيام بعملية جراحية دفعة مع مواد حقن نفسه، تنظيف إبرة حقن مع PBS العقيمة. إذا كان الحقن بمادة مختلفة، التخلص من الإبرة في حاوية الأدوات الحادة واستخدام إبرة جديدة.
ملاحظة: نوصي بتعزيز الجراء مع السدود البديلات فورا بعد الولادة في حالة السد الذي يتصاعد استجابة المناعية للأجسام المضادة إينجيكتانت ونقل إلى الجراء عن طريق حليب الثدي.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
البقاء على قيد الحياة وانجرافتمينت تدابير هامة لنجاح تجارب ايوهكت. الأجنة التي تلقي ايوهكت تبعاً لنقاط النهاية المحددة للتجربة، قد يكون تحليل بريناتالي عملية قيصرية أو وأرزان ارتباط المستقبلات. وفي المتوسط، أن معدلات البقاء على قيد الحياة بعد الحقن الوريدي تتراوح بين 75-100%. معدلات البقاء على قيد الحياة بعد الحقن داخل السلي تميل إلى معرض أفضل من الحقن الوريدي، في حوالي 85-100%.
في المختبر، تستغرق عملية التدريب لتحقيق الكفاءة في هذه التقنيات ما يقرب من 8-12 شهرا. تقييم اكتساب المهارات المطلوبة لأداء هذه الحقن بشكل قابل لإعادة الإنتاج، يتم رصد المتدربين للجنين البقاء على قيد الحياة والمانحة engraftment الخلية عند نقطة زمنية قصيرة بعد الجامعة الإسلامية للتكنولوجيا. وهذا يتضح من التجارب التالية مراقبة الجودة. على وجه التحديد، 1 × 107 أسرة نخاع العظم خلايا معزولة من OsbY01 C57BL/6TgN(act-EGFP) الفئران ("B6 بروتينات فلورية خضراء") كما سبق وصف5 ويتم حقن عن طريق الوريد فيتيلين إلى الحملي الأجنة بالب/ج 14 يوم. في مجموعة واحدة، والجامعة الإسلامية للتكنولوجيا كان يؤديها قبل مدرس ذوي خبرة، وفي مجموعة أخرى متدرب الذي كان يمارس تقنية ل ~ 4 أشهر. تظهر الصور مجهر فلوري الممثل من كبد الجنين المقطوع 24 ساعة بعد الجامعة الإسلامية للتكنولوجيا في الشكل 4أ. كبد الأجنة الذين حصلوا الجامعة الإسلامية للتكنولوجيا بالمتدرب فلوريسسي أقل بسبب انجرافتمينت أقل من زرع الخلايا بروتينات فلورية خضراء. ثم حللت هذه الاكباد للتجارة والنقل+ المانحة الخلايا بالتدفق الخلوي لقياس مستويات انجرافتمينت. الاختلاف في مستويات انجرافتمينت يعني بين يرتبط عن طريق الحقن اثنين مع الصور مشاهدة تحت مجهر فلوري (الشكل 4ب).
قدرة النواقل الفيروسية تم تسليمها عن طريق داخل السلي الطريق ترانسدوسي الخلايا على اتصال مع السائل السلوى يتمثل بتوصيل من طلائي خلايا 48 ساعة بعد حقنه داخل السلي من الإعلان-التجارة والنقل (إتش متجه تحمل بروتينات فلورية خضراء التحوير10) في الحمل 12.5 يوم الأجنة (الشكل 5A و 5B).
الشكل 1 . عملية صنع إبرة ماصة زجاجية مع ساحبة ميكروبيبيتي. (أ) جبل ماصة زجاجية وتأمينه بتشديد الأوجه على طرفي ساحبة. (ب) بمجرد تأمين، التبديل سحب ينشط الحرارة. الإعدادات المعروضة هي الحرارة #1: 985 والسحب: 27. يجب إغلاق الزجاج غطاء الظلام أثناء هذه العملية للسلامة. وافتتح لأغراض التقطت الصور. يتم فصل (ج) ميكروبيبيتي. تجاهل الجزء السفلي والجزء العلوي من ميكروبيبيتي المنفصلين للخطوات المقبلة. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الشكل 2 . عملية طحن ميكروبيبيتي شكل غيض الإبرة. (أ) هذا الفريق يظهر الإعداد العام الطحن. مطلوب مصدر ضوء لتصور نصيحة تحت المجهر. (ب وج) جبل ميكروبيبيتي بزاوية 15-20 °. ومن المتوقع (د) تراكم الحطام في جميع مراحل عملية الطحن. استخدام الرسام لمسح تلميح للحصول على تصور أفضل لعملية الطحن. (ﻫ) إبرة الأرض جيدا تلميح دون أي حواف خشنة أو رقائق قابلة للتحديد يظهر إطار تكبير X 4. (Fو Gو H) ويبين إعادة تفتيش إبرة الأرض تحت تكبير X 10 إبرة أرض جيدا مع تلميح حاد وحواف ناعمة حول الحافة. تأكد من التحقق من الإبرة في زوايا مختلفة. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الشكل 3 . زرع فتح البطن و في الرحم . (A) للحلاقة، تخدير، والشريط سد حامل والإعدادية بطنها. (ب) بعد فتح البطن، تسليم بأكملها الرحم خارج البطن لتحديد جميع الأجنة. (ج) وضع الجنين مع الجراح غير المهيمنة السبابة والإبهام مع الحفاظ على التوتر مع الإصبع الثالث. تحديد تلميح الإبرة تحت المجهر بالنسبة للجنين. فلاش (د) لتدفق الدم مرة أخرى إلى الإبرة ميكروبيبيتي يجب أن ينظر عند cannulation فيتيلين الوريد. (ه) بعد انتهاء من جميع الحقن، ضع كل مرة أخرى الأجنة في البطن. (و) إغلاق البطن مع غرزة تشغيل طبقة واحدة باستخدام خيوط بوليجالاكتين 910 4-0. (ز) وبمجرد إغلاق البطن تماما، اسمحوا السد استرداد تحت مصباح حرارة. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الشكل 4 . انجرافتمينت المانحة نخاع العظام كل الخلايا وحيدات النوى بعد حقن الوريد فيتيلين. (أ) الفرق في درجة انجرافتمينت مع (المتدرب) ودون (مدرب) تسرب الخلايا هي أظهرت بوضوح تحت مجهر فلوري. (ب) النسبة المئوية تشيميريسم تنعكس أيضا الاستنتاج نفسه يتبين من تحليل التدفق الخلوي. وتمثل كل نقطة بيانات في الكبد من جنين حقن مختلفة. وكان يؤديها التجربة متدرب واحد ومدرس واحد. أشرطة الخطأ تمثل انحراف المعياري (SD). الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الشكل 5 . نمط تعبير البروتينات الفلورية الخضراء في جنينا الجنين 48 ساعة بعد حقنه داخل السلي من الإعلان-التجارة والنقل- (أ) هذا الفريق يظهر القرنية (السهم الأحمر) والجلد الملون مع التجارة والنقل في E14.5 بعد حقن داخل السلي م-التجارة والنقل في E12.5 (E12.5/E14.5). وتبين كريوسيكشن (ب) من الجزء الخلفي للجنين (المشار إليها مع مربع أزرق ضوء في لوحة ) في تكبير أعلى مقصورة على طبقة سطحية الخلية بيريديرمال (الأسهم الحمراء) ولا البشرة (epi) توصيل الفيروسية. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
الزرع في الرحم هو علاج محتملة للعديد من الاضطرابات الخلقية التي يمكن تشخيصها في وقت مبكر من الحمل. يسمح نموذج مورين للجامعة الإسلامية للتكنولوجيا الباحثين لاستكشاف البيئة الجنينية أو إلى تجريب مختلف أنواع العلاج. اعتماداً على ما يتم حقنها وما يجري استهداف، يمكن أن توفر عن طريق الحقن الوريدي أو داخل السلي في الرحم زرع تسليم موثوقة من إينجيكتانت إلى المساحة المطلوبة.
عند استهداف أجهزة محددة، من المهم اختيار السن المناسبة الجنينية للجنين، فضلا عن أسلوب الحقن. بينما الحقن الوريدي من الخلايا E14 مثالية لاستهداف مكانة الدموية، والحقن داخل السلي في E16 ومثالي لاستهداف الرئة، وهذه ليست الخيارات الوحيدة المتاحة. على سبيل المثال، حقن داخل السلي يمكن أن يؤديها للأجنة أقرب E8 مع التوجيه بالموجات فوق الصوتية8. تقديم المنهجية الممكن أيضا قبل E14 بالحقن داخل القلب موجهة بالموجات فوق الصوتية في E9-E1011. إمكانية إجراء الحقن في مراحل مختلفة من التنمية الجنين يوفر إمكانات كبيرة لإجراء التجارب على التحقيق في سلامة وكفاءة عمليات نقل الجينات وزرع الخلايا فضلا عن التحقيق في المسائل الأساسية للتنمية علم الأحياء.
وعلاوة على ذلك، بالإضافة إلى تسليم عن طريق الحقن الوريدي وداخل السلي، مواقع أخرى متاحة أيضا لاستهداف استناداً إلى الغرض من العلاج أو مسألة علمية يجري. في الرحم العضلي النهج قد استخدمت لنقل جينات لضمور العضلات12، نهج إينتراسبينال لتوصيل الخلايا العصبية الحركية في الحبل الشوكي13، ونقل نهج داخل الجمجمة للجينات للهدف أمراض الجهاز العصبي المركزي14. لزرع الخلايا المكونة للدم في الرحم ، الطرق أحياناً وداخل خيارات إضافية قابلة للتطبيق ككل طريق التسليم يستهدف في نهاية المطاف مكانة المكونة للدم15. بيد أن الطريق زرع الوريد يسمح صاروخ موجه أكثر كفاءة للخلايا المانحة إلى مكانة المكونة للدم والجرعات الكبيرة من الخلايا المانحة، مما أدى إلى مستويات أعلى عموما من انجرافتمينت الخلية المانحة طويلة الأجل مستقرة دون وأضاف وفيات الأجنة1.
البروتوكولات ونحن قد المفصلة أعلاه لأداء الجامعة الإسلامية للتكنولوجيا هي أدوات قوية ومرنة تسمح باتباع نهج فريد في فيفو لدراسة بيولوجيا الخلايا الجذعية، علم المناعة التنموية وتحريض التسامح المناعية، وعلم الأحياء التنموي، و تحرير العلاج/الجينوم الجينات قبل الولادة. هذه طرق التسليم أيضا الآثار السريرية ذات الصلة وكانت أساسا للدراسات المتعلقة بالعلاج الجيني ايوهكت و في الرحم في نماذج حيوانية كبيرة قبل الإكلينيكية مثل الكلاب البوليسية و نموذج الأغنام4،16. أنها سوف تستمر لتكون بمثابة أداة قيمة لاختبار الأفكار الجديدة في علم الأحياء التنموي واستكشاف العلاجات الجديدة للمدمرة الخلقية الوراثية والدموية والمناعة والايض.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
الكتاب ليس لها علاقة بالكشف عن.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Gloves | Cardinal Health | 2D73DP65 | |
| Adson Forceps w/ teeth | Fine Science Tools | 11027-12 | |
| Adson Forceps w/o teeth | Fine Science Tools | 11006-12 | |
| Curved scissors | Fine Science Tools | 14075-11 | |
| Heavy Scissors | Fine Science Tools | 14002-13 | |
| Needle Driver | Fine Science Tools | 12005-15 | |
| Vicryl 2.0 | Ethicon | JB945 | |
| Transfer Pipette | Medline | GSI135010 | |
| Cotton Tipped Applicators | Medline | MDS202000 | |
| 50 mL Conical tube | Fischer Scientific | 14-432-22 | |
| Tape | 3M | 1527-1 | |
| Eye lubricant | Major LubriFresh | 0904-6488 | |
| Heating Pad | K&H | 3060 | |
| Stereomicroscope | Leica | MZ16 | |
| Injector | Narishige | HI01PK01 | |
| Glass Capillary tubes | Kimble | 71900-100 | |
| Vertical Micropipette Puller | Sutter Instruments | P-30 | |
| Microelectrode Beveler | Sutter Instruments | BV-10 | |
| IM-300 Pneumatic Microinjector | Narishige | IM-300 | |
| Insulin Syringe | BD | 305935 | |
| Filter | Genesee Scientific | 25-244 | |
| Compac5 Anesthesia Machine | VetEquip Compac5 | 901812 | |
| Isoflurane | Piramal Critical Care | NDC 66794-017-25 | |
| N2 gas | Airgas | NI 125 | |
| O2 gas | Airgas | OX 125 | |
| Ad-GFP viral vector | Penn Vector Core | H5'.040.CMV.eGFP |
References
- Loukogeorgakis, S., Flake, A. In utero stem cell and gene therapy: current status and future perspectives. European Journal of Pediatric Surgery. 24, 237-245 (2014).
- Vrecenak, J., Flake, A. In utero hematopoietic cell transplantation: recent progress and the potential for clinical application. Cytotherapy. 15, 525-535 (2013).
- Peranteau, W., et al. Correction of murine hemoglobinopathies by prenatal tolerance induction and postnatal nonmyeloablative allogeneic BM transplants. Blood. 126 (10), 1245-1254 (2015).
- Vrecenak, J., et al. Stable Long-Term Mixed Chimerism Achieved in a Canine Model of Allogeneic in utero Hematopoietic Cell Transplantation. Blood. 124 (12), 1987-1995 (2014).
- Peranteau, W., et al. CD26 Inhibition Enhances Allogeneic Donor-Cell Homing and Engraftment after in utero Hematopoietic-Cell Transplantation. Blood. 108 (13), 4268-4274 (2006).
- Waddington, S., et al. In utero gene transfer of human factor IX to fetal mice can induce postnatal tolerance of the exogenous clotting factor. Blood. 101 (4), 1359-1366 (2003).
- Stitelman, D., et al. Developmental Stage Determines Efficiency of Gene Transfer to Muscle Satellite Cells by in utero Delivery of Adeno-Associated Virus Vector Serotype 2/9. Molecular Therapy - Methods & Clinical Development. 1, 14040 (2014).
- Endo, M., et al. Gene Transfer to Ocular Stem Cells by Early Gestational Intraamniotic Injection of Lentiviral Vector. Molecular Therapy. 15 (3), 579-587 (2007).
- Boelig, M., et al. The Intravenous Route of Injection Optimizes Engraftment and Survival in the Murine Model of In utero Hematopoietic Cell Transplantation. Biology of Blood and Marrow Transplantation. 22 (6), 991-999 (2016).
- Wu, C., et al. Intra-amniotic Transient Transduction of the Periderm with a Viral Vector Encoding TGFβ3 Prevents Cleft Palate in Tgfβ3-/-. Mouse Embryos. Molecular Therapy. 1, 8-17 (2013).
- Roybal, J., Endo, M., Radu, A., Zoltick, P., Flake, A. Early gestational gene transfer of IL-10 by systemic administration of lentiviral vector can prevent arthritis in a murine model. Gene Therapy. 18 (7), 719-726 (2011).
- Reay, D., et al. Full-Length Dystrophin Gene Transfer to the Mdx Mouse in utero. Gene Therapy. 15 (7), 531-536 (2008).
- Ahmed, S., Waddington, S., Boza-Morán, M., Yáñez-Muñoz, R. High-Efficiency Transduction of Spinal Cord Motor Neurons by Intrauterine Delivery of Integration-Deficient Lentiviral Vectors. Journal of Controlled Release. 273, 99-107 (2018).
- Haddad, M., Donsante, A., Zerfas, P., Kaler, S. Fetal Brain-Directed AAV Gene Therapy Results in Rapid, Robust, and Persistent Transduction of Mouse Choroid Plexus Epithelia. Molecular Therapy - Nucleic Acids. 2, 101 (2013).
- Nijagal, A., Le, T., Wegorzewska, M., MacKenzie, T. A mouse model of in utero transplantation. Journal of Visualized Experiments. (47), e2303 (2011).
- Davey, M., et al. Jaagsiekte Sheep Retrovirus Pseudotyped Lentiviral Vector-Mediated Gene Transfer to Fetal Ovine Lung. Gene Therapy. 19 (2), 201-209 (2011).
