Summary
אנו מתארים פרוטוקול לביצוע בתוך הרחם השתלת (דליה) דרך מסלולים תוך ורידי, אינטרה-שפיר של הזרקת במודל מאתר. פרוטוקול זה ניתן להציג תאים וקטורים ויראלי, חומרים אחרים לתוך לסביבה הייחודית של העובר החיסון-סובלנית.
Abstract
השתלת בתוך הרחם (דליה) הוא מצב ייחודי ופסיביות של טיפול זה יכול לשמש כדי להציג את תאי גזע, וקטורים ויראלי או חומרים אחרים בשלב מוקדם ההיריון. הרציונל מאחורי דליה למטרות טיפוליות מבוססת על גודל קטן של העובר, חוסר בגרות אוטואימונית עוברית, נגישות הטבע שגשוג של תאי גזע או קדמון עוברית, ואת הפוטנציאל לטיפול במחלה או הופעת התסמינים לפני הלידה. ניצול של מאפיינים התפתחותיים רגילים אלה של העובר, המסירה של תאי גזע hematopoietic (HSC) דרך של דליה יש פוטנציאל לטיפול בהפרעות המטולוגיות מולדות כגון מחלה חרמשית, בלי הדרוש myeloablative או מיזוג לדיכוי המערכת החיסונית הדרושים עבור מועדון הכדורגל מונפלייה כמחנכת השתלת. באופן דומה, הנגישות של ובתאים באיברים רבים במהלך התפתחות פוטנציאל מאפשר מיקוד יעיל יותר של גזע/ובתאים בעקבות של דליה של וקטורים ויראלי ריפוי גנטי או גנום לעריכה. בנוסף, דליה יכול להיות המשמשות ללימוד תהליכים התפתחותיים נורמליים, לרבות, אך מבלי להגביל, הפיתוח של סובלנות אוטואימונית. המודל מאתר מספק אמצעים יקר ומשתלם כדי להבין את הפוטנציאל ואת המגבלות של דליה לפני ניסויים פרה-קליניים מחקרים שנעשו בבעלי חיים גדולים, יישום קליני בסופו של דבר. כאן, אנו מתארים את פרוטוקול לביצוע של דליה העובר מאתר דרך מסלולים תוך ורידי, אינטרה-שפיר. פרוטוקול זה שימש בהצלחה התירי את התנאים הנדרשים ואת מנגנוני מאחורי בתוך הרחם השתלת תא גזע hematopoietic, סובלנות אינדוקציה, ריפוי גנטי בתוך הרחם .
Introduction
התפתחויות אחרונות ההקרנה קדם-לידתית ואבחון הביאו כדי להאיר את האפשרות לטיפול העובר במשך מספר הפרעות מולדות אשר לא קיימות אפשרויות טיפול הולם כמחנכת ולגרום לזיהום משמעותי. באופן ספציפי, בתוך הרחם השתלת תא גזע hematopoietic (IUHCT) ועריכה טיפול/הגנום ג'ין יש את היכולת לנצל נורמלי מאפיינים התפתחותיים של העובר כדי לטפל מולדת המטולוגיות, המערכת החיסונית, גנטי והפרעות ביעילות רבה יותר מאשר השתלת HSC כמחנכת ועריכה טיפול/הגנום ג'ין יכול לעשות1,2. באופן ספציפי, בשל גודלו הקטן של העובר, התורם בתא או מינון וקטור ויראלי יכול להיות מוגדלים לפי המשקל של הנמען. בנוסף, מאפשרת חוסר בגרות אוטואימונית של העובר התורם HSCs כדי להיות מוזרק ללא myeloablative, לדיכוי המערכת החיסונית מיזוג זה נדרשת השתלת כמחנכת בפרוטוקולים. באופן דומה, וקטורים ויראלי נושאת transgene טיפולית או טכנולוגיה העריכה הגנום של יכול להיות מוזרק ללא לתגובה החיסונית המגביל את המוצר transgene או וקטור ויראלי. סוף סוף, הנגישות והטבע המקדימות של גזע עוברי/ובתאים לממן את האפשרות של התמרה חושית יעילה יותר של היעד ובתאים, וכן מסוימים מצבים של הגנום העריכה (מכוון הומולוגיה תיקון) הדורשים רכיבה על אופניים תאים כדי שתתבצע ביעילות. המודל מאתר משמש כאמצעי תובנה ובמחיר להפנות שאלות חשובות של ביולוגיית תאי הגזע ואימונולוגיה לפני ניסויים במודלים של בעלי חיים גדולים ניסויים פרה-קליניים, ככזה, שימש מאמצת את IUHCT, ברחם ריפוי גנטי כבר בחנו1,2,3.
למרות משתנים רבים לשחק תפקיד חשוב להצלחת IUHCT ועריכה בתוך הרחם ג'ין טיפול/הגנום במודלים של בעלי חיים מאתר וגדולים, משתנה מפתח היא שיטת מסירה של HSCs או וקטור ויראלי. המסירה של כמויות גדולות של התורם HSCs עם אפקט כניסה ראשונה המתרחשים בכבד העובר, האיבר hematopoietic בזמן IUHCT, הוכח להיות אינסטרומנטלי להשגת רמות macrochimeric engraftment עכבר, מודלים בעלי חיים גדולים4 ,5. הייתה זו מושגת באמצעות הזרקה של התורם התאים דרך הווריד vitelline במודל עכבר, באמצעות זריקה אינטרה-הלב במודל הכלביים. התוואי של הזרקת גם ממלא תפקיד מהותי המיקוד ובתאים של איברים שונים במהלך הפיתוח. לדוגמה, לעירוי הזרקה דרך הווריד vitelline של הוכח ביעילות מגלי cardiomyocytes, hepatocytes בעקבות בסוף ההיריון הזרקת6,7. לחלופין, זריקה אינטרה-שפיר של וקטורים ויראלי מאפשרת התמקדות האיברים החשופים פיזית המבוססת על עובריים הקיפול/פיתוח בזמנו של הזרקת8. דוגמה לכך הוא הטוב ביותר על ידי מיקוד של אפיתל בדרכי הנשימה באמצעות זריקה אינטרה-שפיר בסוף ההיריון לנצל נורמלי "נשימה" תנועות. עובריות, החושפת את מערכת הנשימה כדי וקטור ויראלי ב- מי השפיר נוזל9. שני מצבים אלה של דליה, תוך ורידי דרך הווריד של vitelline ו- "אינטרה"-מי השפיר, היו הבסיס לניסויים קודמים ומתמשכים מרובים במעבדה שלנו. ב פרוטוקול זה, נתאר בפירוט את השיטות לביצוע תוך ורידי, אינטרה-שפיר דליה במודל מאתר.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
הפרוטוקולים ניסיוני אושרו על ידי טיפול בעלי חיים מוסדיים ועל שימוש הוועדה בבית החולים לילדים של פילדלפיה.
1. יצירה של הזרקת סיליקון
- שימוש של פולר micropipette אנכי, משוך על פיפטה microcapillary 100 µL (איור 1 א' - ג' 1). כיילו את פולר micropipette כך הסוף מחודדות > 1 ס"מ.
הערה: בתחילה, ההגדרות של פולר צריך להיות מותאם לכל אורך האופטימלית. הגדרת חום גבוהה יותר תגרום קצה ארוך יותר, הגדרת משיכה גבוהה יותר תגרום הקוטר של הקצה צר יותר. - חותכים את הקצה מחודדות כך שזה ≥ 1 ס"מ. ודא כי הקוטר הפנימי בקצה המחט הוא בין 70 מיקרומטר 100 מיקרומטר כי היא ביחס הפוך לאורך הקצה מחודדות.
הערה: קוטר פנימי תלויה גם הכיול של פולר micropipette. עיין בהוראות יצרן של פולר micropipette אנכי או כל סוג של פולר micropipette מועדף. - אחרי שתוודא כי המחט יש בקוטר פנימי הנכון, ליצור שיפוע של 15-20 מעלות על ידי חידוד קצה באמצעות beveller micropipette עם יהלום החידוד גלגל (איור 2 א - ג 2). ודא לנוח בעדינות על הגלגל ללא לחץ רב מדי, כדי להקטין את הסיכויים של שבירת או פיצוח הטיפ העצה.
פתק: ניתן להשתמש במכחול לנגב נפולת שנוצרים על קצה המחט. - להעריך את הטיפ תחת מיקרוסקופ ולהבטיח כי הטיפ הוא עגול בלי צ'יפס או סדקים. להעריך מחדש את קוטר פנימי כדי לוודא שזה בין מיקרומטר 70 100 מיקרומטר (איור דו-ממדי - 2 H).
- לצייר קווים על שאר המחט כדי לייעד µL 5 אמצעי ביניהם (למשל, מחטים בקוטר הפנימי 1.3 מ מ צריך קווים שצוירו בבית בהפרשים קבועים של 3.77 מ מ).
- אוטוקלב המנזר מחטים להשתמש בניתוח, להתמודד איתם בכפפות סטריליות.
2. בתוך הרחם זריקות
- להכין הצורך כלים על-ידי autoclaving אותם מבעוד מועד. כוללים כלים חיוניים כגון microinjector המחט, נהג מחט כירורגית, זוג מלקחיים לאדאמסון, זוג מספריים רקמה רגילה מעוקל, מזרק אינסולין 1 מ"ל, זוג applicators כותנה-עצה, פיפטה העברה, צינור חרוטי 50 מ ל, ו- a חבילת 4-0 polyglactin 910 התפרים.
- באמצעות טכניקה סטרילי, לצרף את המחט למחזיק המחט וחבר אותו לתוך microinjector.
הערה: ההגדרות של החנקן דחוס המשמש הן כדלהלן: להזריק 4-6 psi, איזון 0 psi. תלוי מה להיות מוזרק, באופן ספציפי, צמיגות injectate, כמו גם גודל micropipette, הזרקת הזמנים משתנים בין 0.3 - 1.5 s. - לנקות את קצה המחט נפולת אפשרי על ידי ממלאים 5-10 µL עקר 1 x באגירה פוספט תמיסת מלח (PBS) ולאחר מכן ניקויו. חזור על זה x 2-3.
- הכן עכברים נקבה בהריון של 2 עד 6-בן חודש לניתוח על ידי גילוח הבטן שלהם עם בטלוויזיה. להיזהר לא לפגוע הפטמות. לנהל משכחי כאבים אוראלי (למשל, 100 µL של 1.5 mg/mL meloxicam השעיה אוראלי לכל העכבר).
- להתחיל למלא את המחט עם החומר הרצוי (תאים וקטור סמים)-לנפח הרצוי. יש להיזהר לא לשבור את מחט בעודם מתדלקים את המחט.
הערה: הנפח של הזרקת לכל העובר משתנה בהתאם לעיצוב ניסויים ספציפיים. 20 µL זו פועלת היטב עבור הזרקת מספר רב של תאים (קרי, עד 107 תאים לווריד vitelline. למשל, נמסר לנו עונה 1 פרק 107 תאים במח העצם כולו מבודד OsbY01 C57BL/6TgN(act-EGFP) ["B6 ירוק ניאון חלבון (GFP)"] עכברים דרך הווריד של vitelline לתוך הריונית העוברים Balb/c יום-14. לזריקות וקטור ויראלי, זריקה אחת של 10 µL של הווקטור מדולל 1:1 עם PBS עובד היטב. - כדי לכייל את הזמן הזרקה, לנקוט בצעדים הבאים.
- לדחוף מצב לחצן x 3 ב- microinjector כדי להגיע למסך כיול הזרקה. שינוי משך הזמן הזרקת על-ידי הוספת במרווחים של 10 או 100 ms ולדחוף מצב לחצן 2 x.
- לחצו על הכפתור איזון ודחף את דוושת רגל פעם אחת. עכשיו תדחפי את דוושת שוב ואני להעריך כמה נפח ריקון החוצה המחט לכל דחיפה. אם לא מכויל כדי לנפח הרצוי של 5-20 µL לכל לדחוף פדלים, חזור על שלבים 2.6.1 ו 2.6.2.
הערה: בדרך כלל, זה טוב לכייל כל דחיפה לספק לחצי מנפח היעד הכולל בכל פעם. אמנם זה ניתן להזריק µL יותר מ- 30 או 40 אפילו µL מהנפח הכולל, בדרך כלל נשאר מעל 20 µL לכל העובר, תוך ורידי או מי השפיר-"אינטרה".
- למלא את המחט עד הרמה הרצויה.
- להתחיל במתן הרדמה העכבר על-ידי כוונון של זרימה חמצן כדי 1 ליטר/דקה, מאדה את איזופלוריין ל-3%.
- לאשר אם העכבר הוא ומורדמת באמצעות בדיקת היעדר רפלקס פדלים. להעביר את העכבר כרית החימום במצב פרקדן.
- החל ג'ל סיכה העין כדי למנוע לייבוש הקרנית. אבטח את העכבר במקום על ידי מקליטה את הגפיים העליונים והתחתונים כדי לרפד.
- . תכינו את הבטן עם שיחים chlorhexidine ואחריו אלכוהול ולהזריק הרדמה מקומית (למשל, µL 100 של 0.25% נמשך) subcutaneously (איור 3א).
- עם מספריים, עושים חתך בעור 1-2 ס מ כך לגבול התחתון היא לא קרובה יותר 1 ס מ introitus; fascia מתחת הוא דק מאוד שקוף.
- לזהות האמצע של fascia אשר הוא שקוף יותר מאשר האזור הסובב. להיזהר לא לפגוע בכלי הדם הצפק הסובלת משני צדי הקו האמצעי. צריך כלי הצפק נפצע, תחזיק את הלחץ עם כותנה-טיפ applicators כדי לעצור את הדימום.
- בעזרת מלקחיים לאדאמסון, צבוט fascia מבלי להיעזר באחד האברים המשמשים כבסיס כגון המעיים, שלפוחית השתן, או העוברים. פתח fascia במספריים נזהר שלא לפגוע באחד האברים. פעם בבטחה בבטן, להרחיב את החתך fascial. . לעשות את זה עוד יותר החתך בעור.
- השתמש applicators כותנה-טיפ כדי להעביר את המעיים אל החלק העליון של הבטן, ובכך לחשוף את הרחם gravid. לספק את הרחם מתוך החתך, זיהוי בקפידה את השחלות ימינה ושמאלה כדי להבטיח שכל העוברים ייספרו (איור 3ב).
- המקום הרחם שמאלה בחזרה לתוך הבטן, כך נחשף רק הרחם נכון; זה מונע לייבוש של הרחם, מחממת את העוברים שאינו המוזרק.
- החזק ביותר לרוחב העובר/השפרה בין האגודל לבין האצבע של היד האחרת של המפעיל (איור 3ג'). תמיד להיות עדין כדי לא לגרום נזק העוברים.
- מקם המיקרוסקופ לנתיחה (10 X הגדלה הוא אידיאלי) והתאימו את המוקד כך שהעובר נמצא בתצוגה. להתאים את התאורה עבור פריט חזותי טוב יותר.
- לזהות את זה להיות מוזרק (וריד vitelline, השפיר). לזריקות תוך ורידי, דמיינו את הוורידים vitelline והן השקה שלהם קודם. לזריקות אינטרה-שפיר, אוריינט העובר עם צד ימין בתצוגה.
- להגיע אל המרחב היעד עם מחט כמתואר להלן.
- הזרקה תוך ורידי, לעשות כדלקמן.
- לסובב את הרחם כך הווריד vitelline זה להיות מוזרק, הוא מקביל קצה המחט; זכור כי הזריקות חייבת להתבצע לקראת ההשקה של שני הורידים.
- להניח את המחט על הרחם בזווית של 5°, לחדור את החומה הרחם. העצה היא בין הקיר הרחם השפרה, מקם את הטיפ ישירות על גבי הווריד vitelline.
- בזווית כמעט משיקי, להחליק את המחט על הווריד של עד השיקוע מפלח ומקדמות לתוך הכלי; זו ניכרת על ידי הבזק של דם לראות בקצה המחט (איור 3ד').
הערה: הגישה את הווריד עלול לקחת כמה ניסיונות כפי המחט עשוי לא לנקב את הווריד עם הגלישה הראשונה מעל הווריד.
- הזרקת אינטרה-שפיר, לעשות כדלקמן.
- לסובב את שק מי השפיר, מצא את מיקום ללא כלי כדי לחדור.
- הצבע המחט מאונך לדופן הרחם ולאחר לחדור מבעד הרחם, שק החלמון, ולאחר מכן את שק מי השפיר. יש להיזהר לא לחדור מבעד לכל רקמה עוברית. ודא שהמחט עבר בין הגפיים כמו זה מאשר כי המחט נמצא השפרה. לאחר מכן המשך עם הזריקה.
- הזרקה תוך ורידי, לעשות כדלקמן.
- להזריק הנפח המתאים של החומר הרצוי (בדרך כלל 10-20 µL) על-ידי לחיצה על דוושת רגל.
הערה: כי מזרק חייב לשמור על הפריט החזותי של קצה המחט דרך המיקרוסקופ-בכל עת, אדם השני חייב לקרוא הסימנים על המחט לכמת את כמות מוזרק וליידע מזרק כמה נפח שנשאר להזריק. דיון לפני הזריקה בין מזרק עוזר חשוב למנוע כל בלבול ועיכוב. זה חשוב במיוחד לזריקות תוך ורידי כי הסרה מושהית של המחט יאפשר זרם של אחורי של דם ורידי לתוך מחט ואת התוצאה מינון לא מדויק. - למשוך את המחט ההזרקה ברגע מועבר לנפח הרצוי. כי ייתכן דימום מן הספינה לנקב אתר עם זריקות תוך ורידי, החזק לחץ עם הצד של המחט עבור 10-15 s לעצור את הדימום.
- המשך העובר הבא. המשך עד מכל העוברים של הקרן נכון הרחם היה להזריק.
- להסיר הקרן הרחם השמאלי של הבטן ולהחליף הקרן הרחם ממש חזרה בתוך חלל הצפק.
הערה: לעיתים, המחט זקוק בכמה זמן עם injectant. - ברגע שיש הוזרק, כל העוברים, החלף את הרחם לתוך. חלל הבטן (איור 3E). הקפד להימנע של הרחם או מעיים התפתלות המעים.
- עם פיפטה העברה חד פעמיות, מקום בערך 2 מ ל 1 x PBS לתוך. חלל הבטן כדי להחליף את ההפסדים בעלפון חושים.
- סגור את fascia והבטן בשכבת רציף אחד, בעזרת תפרים 910 polyglactin 4-0 כדי להימנע ופצעו את האיברים כבסיס במהלך הסגר (איור 3F - דור 3).
- הוצא את הקלטת, להעביר את העכבר אל כלוב מתחת למנורת חום. להיזהר לא להציב מנורת החימום קרוב מדי העכבר. ודא שהכלוב יש מצעים, מזון ומים.
הערה: תא חם thermostatically מבוקרת עשוי גם לשמש. העכבר הוא ער כאשר הוא זקופה והליכה. - להתבונן העכבר מדי יום ותן משכחי כאבים לפי הצורך.
הערה: אנחנו באופן שגרתי לתת meloxicam בימים שלאחר הניתוח 1 ו- 2, לפעמים ביום 3 אם העכבר מראה סימנים של כאב. - אם עושים ניתוח אצווה עם אותו חומר הזרקה, לנקות את המחט הזרקה עם PBS סטרילי. אם מזריק חומר שונים, תשליך המחט בתוך מיכל שרפ ולהשתמש מחט חדשה.
הערה: מומלץ וטיפוח הגורים עם הפונדקאית סכרים מיד לאחר הלידה, למקרה הסכר mounts של התגובה החיסונית נוגדנים injectant והעברות הגורים דרך חלב האם.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
הישרדות engraftment חשוב מדדי הצלחה לניסויים IUHCT בקרב אנשי עסקים ותיירים כאחד. בהתאם נקודות הקצה מסוימת של ניסוי, העוברים שקיבלו IUHCT יכול להיות מנותח prenatally על-ידי ניתוח קיסרי או נוצרו אחרי הלידה. בממוצע, שיעורי ההישרדות לאחר זריקות תוך ורידי בטווח של 75-100%. שיעורי ההישרדות לאחר זריקות אינטרה-שפיר נוטים הוגן יותר זריקות תוך ורידי, בסביבות 85-100%.
במעבדה שלנו, תהליך ההכשרה להשגת מיומנות בטכניקות אלו לוקח כ- 8-12 חודשים. כדי להעריך רכישת הכישורים הדרושים כדי לבצע זריקות אלה באופנה לשחזור, המתלמדים מנוטרים עבור העובר הישרדות, תורם תא engraftment בנקודות זמן קצר לאחר את דליה. זה מומחש הניסויים הבאים בקרת איכות. באופן ספציפי, תאים במח העצם כל7 עונה 1 פרק 10 מבודדים מן OsbY01 C57BL/6TgN(act-EGFP) ("B6 GFP") כפי שצוין בעבר תיאר5 ועכברים הם מוזרק דרך הווריד של vitelline לתוך הריונית העוברים Balb/c יום-14. בקבוצה אחת, בוצע את דליה על ידי מדריך מנוסה, ועל בקבוצה השנייה על ידי מתלמד מי מתאמן הטכניקה עבור ~ 4 חודשים. תמונות מיקרוסקופ פלואורסצנטי נציג של כבדי עוברית שנקטפו 24 שעות לאחר דליה מוצגים באיור 4א. הכבדים של העוברים שקיבלו את דליה על ידי המתאמן לזרוח פחות בשל engraftment התחתון של התאים המושתלים GFP. כבדים אלה נותחו ואז עבור תאי התורם GFP+ על ידי cytometry זרימה כדי לכמת את רמות engraftment. ההבדל ברמות engraftment רעה בין שני מזרקי בקורלציה עם תמונות ראיתי תחת מיקרוסקופ פלואורסצנטי (איור 4B).
היכולת של וקטורים ויראלי מועברות דרך תוואי אינטרה-שפיר מגלי תאים במגע עם נוזל מי השפיר הוא כשניסחתי את התמרה חושית של אפיתל תאי 48 שעות לאחר זריקה אינטרה-מי השפיר של מודעה-GFP (אדנו וקטור נושא ה-GFP transgene10) ההתעסקות היום-12.5 הריונית (איור 5 א ו- 5B).
איור 1 . התהליך של ביצוע מחט פיפטה מזכוכית עם פולר micropipette. (א) הר על פיפטה מזכוכית ואבטח אותו על ידי הידוק את החוגה בכל אחד מהקצוות של פולר. (B), ברגע מאובטח, הבורר מושך מפעילה את החום. ההגדרות המוצגות הן חום #1: 985 ולמשוך: 27. כיסוי זכוכית כהה צריך להיסגר במהלך תהליך זה למען הבטיחות. נפתח למטרות פוטושוט. (ג) micropipette מופרדים זה מזה. למחוק את החלק התחתון ולקחת את החלק העליון של micropipette מופרדים על השלבים הבאים. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 2 . התהליך של שחיקה את micropipette לעצב את קצה המחט. (א) לוח זה מציג את ההגדרה הכללית של שחיקה. מקור אור יש צורך לדמיין את הקצה מתחת למיקרוסקופ. (B ו- C) לטעון את micropipette בזווית של 15-20 מעלות. (ד) A הצטברות של פסולת צפוי לאורך כל תהליך שחיקה. להשתמש במכחול כדי לנקות את הטיפ להשיג פריט חזותי טוב יותר של תהליך שחיקה. (E) A היטב לאדמה מחט ללא שבבי זיהוי או קצוות משוננים מוצג תחת 4 X הגדלה. (F, Gו- H) בדיקה מחדש של המחט הקרקע תחת הגדלה X 10 מציג מחט היטב לאדמה עם קצה חד, קצוות חלקים סביב הקצה. הקפד לבדוק את המחט בזוויות שונות. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 3 . השתלת פתיחת בטן, בתוך הרחם . גילוח (A), עזים ומתנגד, ואת קלטת סכר בהריון ולהכין את הבטן שלה. (B) לאחר פתיחת בטן, לספק מכלול של הרחם מחוץ בבטן עבור זיהוי של כל העוברים. (ג) מיקום העובר עם המנתח-הדומיננטי האצבע והאגודל תוך שמירה על מתח עם האצבע השלישית. לזהות את קצה המחט תחת המיקרוסקופ ביחס לעובר. (ד) A הבזק של דם לזרום בחזרה לתוך המחט micropipette חייבים להיבדק על תעלות של הווריד vitelline. (E) לאחר גמירה של זריקות כל, למקם כל העוברים חזרה לתוך. חלל הבטן. (F) סגור הבטן עם תפר פועל שכבה אחת בעזרת תפרים polygalactin 910 4-0. (G) ברגע הבטן סגורה לחלוטין, תן את הסכר לשחזר תחת מנורת חימום. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 4 . Engraftment תאי תאי מח עצם כל תורם לאחר זריקה לווריד vitelline. (א) ההבדל בין מידת engraftment עם (המתאמן) ללא (מדריכה) לדליפת תאים מוצג בבירור תחת מיקרוסקופ פלואורסצנטי. Chimerism אחוז (B) משתקף גם מציאת אותו שמוצג על ידי הניתוח cytometry זרימה. כל נקודת נתונים מייצג את הכבד של העובר מוזרק שונים. הניסוי בוצע על ידי אחד חניך ומדריך אחד. קווי השגיאה לייצג סטיית תקן (SD). אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 5 . הדפוס ביטוי של חלבון פלואורסצנטי ירוק ב העובר העובר 48 שעות לאחר זריקה אינטרה-מי השפיר של מודעה-GFP. (א) לוח זה מראה הקרנית (חץ אדום) ואת העור מוכתם GFP ב E14.5 לאחר זריקה אינטרה-מי השפיר של מודעה-GFP-E12.5 (E12.5/E14.5). (B) A cryosection האחורי של העובר (המצוין עם תיבה כחולה אור בלוח ) בהגדלה גדולה יותר גבוה מראה כי התמרה חושית ויראלי מוגבל שכבת תאים peridermal שטחיים (חצים אדומים), לא האפידרמיס (epi). אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
השתלת בתוך הרחם הוא טיפול פוטנציאלי עבור רבים הפרעות מולדות אשר יכול להיות מאובחנים בשלב מוקדם של ההיריון. המודל מאתר דליה מאפשר לחוקרים לחקור את הסביבה עוברית או להתנסות עם טיפולים שונים. תלוי מה להיות מוזרק, מה הוא על הכוונת, השתלת תוך ורידי או אינטרה-שפיר בתוך הרחם יכול לספק משלוח אמין של injectant אל החלל הרצוי.
כשמתכוונים איברים ספציפיים, חשוב לבחור העידן embryological המתאים של העובר, כמו גם את טכניקת ההזרקה. בעוד תוך ורידיות תאים בחלק E14 הינו אידיאלי עבור מיקוד הגומחה המטולוגיות, הזריקה אינטרה-שפיר-E16 הינו אידיאלי עבור ריאות מיקוד, אלה אינן האפשרויות היחידות הזמינות. לדוגמה, זריקות אינטרה-שפיר יכול להתבצע עבור העוברים מוקדם ככל E8 עם אולטרסאונד הדרכה8. משלוח מערכתית אפשרי גם לפני E14 עם זריקות אינטרה-לב מונחה אולטרה סאונד-E9 - E1011. היתכנות ביצוע זריקות שונות שלבי ההתפתחות של העובר מציע פוטנציאל גדול עבור ניסויים חוקרים את הבטיחות והיעילות של ג'ין העברות, השתלת תאים וכן חוקרים שאלות בסיסיות של התפתחותית ביולוגיה.
יתר על כן, בנוסף משלוח תוך ורידי, אינטרה-שפיר, אתרים אחרים זמינים גם עבור פילוח בהתאם למטרת הטיפול או השאלה המדעית נרדף. ה בתוך הרחם תוך שרירית הגישה שימש להעברת הגן dystrophies שרירים12, תוך גישה עבור התמרה חושית של חוט השדרה מוטורי לגלוקוז13, ומעביר גישה תוך-גולגולתי עבור ג'ין למטרה מחלות של מערכת העצבים המרכזית14. בתוך הרחם השתלת תא hematopoietic, מסלולים intrahepatic ו בקרום הבטן הן אפשרויות נוספות קיימא בכל תוואי משלוח בסופו של דבר מטרות ה נישה hematopoietic15. עם זאת, המסלול השתלת עירוי מאפשר של יונת יעיל יותר של תאי התורם לתוך הגומחה hematopoietic מינון גדול יותר של תאי התורם, ובכך וכתוצאה מכך רמות גבוהות באופן כללי של engraftment תא תורם ארוכת טווח יציב ללא נוספה תמותה עוברית1.
הפרוטוקולים שתוארו לעיל עבור ביצוע דליה הם כלי רב עוצמה, רב-תכליתי לאפשר גישה ייחודית ויוו ללמוד ביולוגיה של התא גזע, אימונולוגיה התפתחותית סובלנות אוטואימונית אינדוקציה, ביולוגיה התפתחותית, ו גנטי של עוברים טיפול/הגנום עריכה. שיטות משלוח אלה גם להיות רלוונטי השלכות קליניות, היו הבסיס ללימודי של טיפול גנטי IUHCT, בתוך הרחם במודלים של בעלי חיים פרה-קליניים גדולים כגון את הכלבים ואת ה-4,דגם ovine16. הם ימשיכו לשמש כלי חשוב לבדוק רעיונות חדשים בביולוגיה התפתחותית ולחקור טיפולים חדשים עבור הרסנית הפרעות מולדות גנטיות המטולוגיות, המערכת החיסונית, חילוף החומרים.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
המחברים אין לחשוף.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Gloves | Cardinal Health | 2D73DP65 | |
| Adson Forceps w/ teeth | Fine Science Tools | 11027-12 | |
| Adson Forceps w/o teeth | Fine Science Tools | 11006-12 | |
| Curved scissors | Fine Science Tools | 14075-11 | |
| Heavy Scissors | Fine Science Tools | 14002-13 | |
| Needle Driver | Fine Science Tools | 12005-15 | |
| Vicryl 2.0 | Ethicon | JB945 | |
| Transfer Pipette | Medline | GSI135010 | |
| Cotton Tipped Applicators | Medline | MDS202000 | |
| 50 mL Conical tube | Fischer Scientific | 14-432-22 | |
| Tape | 3M | 1527-1 | |
| Eye lubricant | Major LubriFresh | 0904-6488 | |
| Heating Pad | K&H | 3060 | |
| Stereomicroscope | Leica | MZ16 | |
| Injector | Narishige | HI01PK01 | |
| Glass Capillary tubes | Kimble | 71900-100 | |
| Vertical Micropipette Puller | Sutter Instruments | P-30 | |
| Microelectrode Beveler | Sutter Instruments | BV-10 | |
| IM-300 Pneumatic Microinjector | Narishige | IM-300 | |
| Insulin Syringe | BD | 305935 | |
| Filter | Genesee Scientific | 25-244 | |
| Compac5 Anesthesia Machine | VetEquip Compac5 | 901812 | |
| Isoflurane | Piramal Critical Care | NDC 66794-017-25 | |
| N2 gas | Airgas | NI 125 | |
| O2 gas | Airgas | OX 125 | |
| Ad-GFP viral vector | Penn Vector Core | H5'.040.CMV.eGFP |
References
- Loukogeorgakis, S., Flake, A. In utero stem cell and gene therapy: current status and future perspectives. European Journal of Pediatric Surgery. 24, 237-245 (2014).
- Vrecenak, J., Flake, A. In utero hematopoietic cell transplantation: recent progress and the potential for clinical application. Cytotherapy. 15, 525-535 (2013).
- Peranteau, W., et al. Correction of murine hemoglobinopathies by prenatal tolerance induction and postnatal nonmyeloablative allogeneic BM transplants. Blood. 126 (10), 1245-1254 (2015).
- Vrecenak, J., et al. Stable Long-Term Mixed Chimerism Achieved in a Canine Model of Allogeneic in utero Hematopoietic Cell Transplantation. Blood. 124 (12), 1987-1995 (2014).
- Peranteau, W., et al. CD26 Inhibition Enhances Allogeneic Donor-Cell Homing and Engraftment after in utero Hematopoietic-Cell Transplantation. Blood. 108 (13), 4268-4274 (2006).
- Waddington, S., et al. In utero gene transfer of human factor IX to fetal mice can induce postnatal tolerance of the exogenous clotting factor. Blood. 101 (4), 1359-1366 (2003).
- Stitelman, D., et al. Developmental Stage Determines Efficiency of Gene Transfer to Muscle Satellite Cells by in utero Delivery of Adeno-Associated Virus Vector Serotype 2/9. Molecular Therapy - Methods & Clinical Development. 1, 14040 (2014).
- Endo, M., et al. Gene Transfer to Ocular Stem Cells by Early Gestational Intraamniotic Injection of Lentiviral Vector. Molecular Therapy. 15 (3), 579-587 (2007).
- Boelig, M., et al. The Intravenous Route of Injection Optimizes Engraftment and Survival in the Murine Model of In utero Hematopoietic Cell Transplantation. Biology of Blood and Marrow Transplantation. 22 (6), 991-999 (2016).
- Wu, C., et al. Intra-amniotic Transient Transduction of the Periderm with a Viral Vector Encoding TGFβ3 Prevents Cleft Palate in Tgfβ3-/-. Mouse Embryos. Molecular Therapy. 1, 8-17 (2013).
- Roybal, J., Endo, M., Radu, A., Zoltick, P., Flake, A. Early gestational gene transfer of IL-10 by systemic administration of lentiviral vector can prevent arthritis in a murine model. Gene Therapy. 18 (7), 719-726 (2011).
- Reay, D., et al. Full-Length Dystrophin Gene Transfer to the Mdx Mouse in utero. Gene Therapy. 15 (7), 531-536 (2008).
- Ahmed, S., Waddington, S., Boza-Morán, M., Yáñez-Muñoz, R. High-Efficiency Transduction of Spinal Cord Motor Neurons by Intrauterine Delivery of Integration-Deficient Lentiviral Vectors. Journal of Controlled Release. 273, 99-107 (2018).
- Haddad, M., Donsante, A., Zerfas, P., Kaler, S. Fetal Brain-Directed AAV Gene Therapy Results in Rapid, Robust, and Persistent Transduction of Mouse Choroid Plexus Epithelia. Molecular Therapy - Nucleic Acids. 2, 101 (2013).
- Nijagal, A., Le, T., Wegorzewska, M., MacKenzie, T. A mouse model of in utero transplantation. Journal of Visualized Experiments. (47), e2303 (2011).
- Davey, M., et al. Jaagsiekte Sheep Retrovirus Pseudotyped Lentiviral Vector-Mediated Gene Transfer to Fetal Ovine Lung. Gene Therapy. 19 (2), 201-209 (2011).
