Summary
マウス モデルにおける注射の静脈内投与と胎嚢内のルートを通して子宮内移植 (IUT) を実行するためのプロトコルについて述べる。このプロトコルを使用するユニークな免疫トレラント胎児環境に細胞、ウイルスのベクトル、およびその他の物質を導入することができます。
Abstract
子宮内移植 (IUT) は、妊娠の早い段階で他の物質やウイルスベクター、幹細胞を導入するための療法のユニークで多彩なモードです。治療目的のための IUT の背後にある理論的根拠は胎児、胎児の免疫学的未熟さ、アクセシビリティおよび増殖性胎児の幹または前駆細胞、病気を治療するために潜在的なまたは症状の発症の小さなサイズに基づいています前に誕生。必要ななく、鎌状赤血球症など先天性の血液疾患を治療するために可能性を秘めて、IUT 胎児、造血幹細胞 (HSC)経由での配信のこれらの通常発達特性の活用破壊的または生後 HSC の移植に必要な免疫抑制をご利用いただけます。同様に、開発中に複数の臓器における前駆細胞のアクセシビリティ潜在的またはゲノム編集する遺伝子治療用ウイルスベクターの IUT 幹/前駆細胞の効率的ターゲティングできます。また、IUT を含む、通常の発達過程を研究するために使用できますが、免疫学的寛容の開発に限定されません。マウスのモデルは、可能性と前臨床試験の大規模な動物実験および最終的な臨床応用の前に IUT の限界を理解するための貴重なかつ手頃な手段を提供します。ここでは、静脈内投与と胎嚢内のルートをマウスの胎児で、IUT を実行するためのプロトコルについて述べる。このプロトコルは、必要な条件と造血幹細胞移植子宮内、寛容誘導、遺伝子治療への子宮内の背後にあるメカニズムを解明する正常に使用されています。
Introduction
出生前スクリーニングと診断の最近の進歩は、光の十分な出生後の治療法の選択肢を持っていないと重大な罹患率と死亡率は、先天性疾患の数の胎児の治療の可能性に持ち込んでいます。具体的には、子宮内で造血幹細胞移植 (IUHCT) と遺伝子治療・ ゲノム編集血液疾患、免疫、および遺伝的、先天性の治療に胎児の正常発達特性を活用する可能性があります。産後の HSC 移植と遺伝子治療・ ゲノム編集1,2を行うことができますよりもより効率的に障害します。具体的には、胎児のサイズが小さいため、ドナー細胞またはウイルスのベクトル量を最大化できる受信者の重量あたり。さらに、胎児の免疫学的未熟さは、生後移植プロトコルでドナー造血骨髄破壊的と免疫調節せずに注入することが必要なことができます。同様に、遺伝子プロダクトまたはウイルスのベクトルに対する制限免疫応答せず治療遺伝子やゲノム編集技術を運ぶウイルスベクターに注入することができます。最後に、アクセシビリティと胎児幹細胞/前駆細胞の増殖の性質余裕サイクリングを必要とするゲノム編集 (ホモロジー監督修理) モードと同様、ターゲットの前駆細胞のより効率的な情報伝達の可能性効率的に発生する細胞。マウスのモデルは前臨床試験の大規模な動物モデルでみる前に免疫・幹細胞生物学の重要な問題に対処するための洞察力と手頃な手段として提供していますなど、IUHCT と子宮内で主要なモデルを務めて遺伝子治療の検討1,2,3をされています。
多くの変数は、IUHCT と子宮内遺伝子治療・ ゲノムの編集のマウスと大型の動物モデルで成功に重要な役割を果たす、重要な変数は HSCs またはウイルスのベクトルの配信方法。マウスおよび大動物モデル4 の生着の macrochimeric レベルの達成に尽力する胎児の肝臓、IUHCT の時に造血臓器で発生する初回通過効果を持つドナー造血の大量投与の配信が示されています。 ,5。これは達成を介してのドナー細胞を介してマウス モデルにおける卵黄の静脈を介して心臓内注射犬のモデルでインジェクションだった。注射経路開発中に別の臓器の前駆細胞をターゲットの基本的な役割を果たします。たとえば、静脈注射を介して効率的にヘッジホッグ心筋細胞と肝細胞の遅い妊娠注入6、7の後卵黄の静脈を示されています。また、ウイルスベクターの胎嚢内注射により注入8時胚折りたたみ/開発に基づいて物理的にさらされている臓器のターゲットします。これは羊水のウイルスのベクトルする気道を公開する通常の胎児""呼吸動きの活用に妊娠後期の胎嚢内注射を介して呼吸上皮のターゲットによって例証される最高流体9。静脈を介して膜の静脈の IUT のこれらの 2 つのモードとイントラ羊水、私たちの研究室で複数の過去および継続的な実験のための基礎をされています。このプロトコル マウス モデルにおける静脈内投与と胎嚢内の IUT の実行方法について詳細に述べる.
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Protocol
実験プロトコルは、機関動物ケアおよびフィラデルヒィアの小児病院で使用委員会によって承認されました。
1. インジェクション ピペットの創造
- 垂直マイクロ ピペット引き手を使って 100 μ L マイクロキャピ ラリー ピペット (図 1 a ・ 1 C) を引き出します。> 1 cm 長いテーパー エンドがあるのでマイクロ ピペットの引き手を調整します。
注: 当初、引き手の設定を最適な長さに調整する必要があります。高い熱設定は長く、先端になるし、プルを高く設定、先端の直径を幅を狭くします。 - それは ≥ 1 cm 長いテーパー エンドをカットします。保障、針の先端の内径が 70 μ m ~ 100 μ m、テーパー エンドの長さに反比例します。
注: 内部の直径は、ピペットの引き手の校正によっても異なります。垂直マイクロ ピペットの引き手や最寄りのピペットの引き手タイプの製造元からの指示を参照してください。 - 針が正しい内部直径を有することを確認した後に、ピペット beveller を用いたシャープ ホイール (図 2 a ・ 2 C) ダイヤモンド チップを研ぐことにより 15-20 度の傾斜面を作成します。速報や先端の割れの可能性を減らすため、あまりにも多くの圧力なしホイールの上に優しくヒントを休ませることを確認します。
注: ペイント ブラシを使用針の先端にたまるごみを拭き取りますとできます。 - 顕微鏡下で先端を評価し、先端がチップやクラックなしでのラウンドであることを確認します。70 μ m、100 μ m (図 2 D - 2 時間) の間にあるかどうかを確認する内部の直径を再評価します。
- それらの間の体積の 5 μ L を指定する針の残りの部分に線を描画 (例えば、内径 1.3 mm の針は 3.77 mm 刻みで描画される線とはず)。
- オートクレーブ針前に手術で使用し、滅菌手袋で処理します。
2子宮内注射。
- 準備必要は事前にそれらをオートクレーブに入れることによって楽器します。マイクロインジェクター針ホルダー、手術針ドライバー、アドソン鑷子、湾曲した正規の組織用のハサミ、1 mL インスリン注射器、綿の先端アプリケータのカップル、転送ピペット、50 mL の円錐管のペアのペアなど必須の楽器を含めると4-0 polyglactin 910 縫合糸のパック。
- 生殖不能の技術を使用して、持針器に針を添付、ガラスシリンジに差し込みます。
注: 圧縮された窒素の使用の設定が続いて、: 4-6 psi を注入、0 psi のバランスをとる。何が注入される、具体的には、注入液は、粘度だけでなく、マイクロ ピペットのサイズに応じて噴射時間によって異なります 0.3 - 1.5 s。 - 滅菌 1 リン酸緩衝生理食塩水 (PBS) x の 5-10 μ L を描画し、それを消去可能な破片の針の先端をきれいに。この 2 〜 3 倍を繰り返します。
- 手術のため、クリッパーで腹部を削って妊娠 2-6 ヶ月齢の雌マウスを準備します。乳首を傷つけないように注意します。経口鎮痛薬 (例えば、マウスあたり 1.5 mg/mL メロキシカム経口懸濁液を 100 μ l 添加) を管理します。
- 希望の音量で必要な材料 (セル/ベクトル/薬) と針を充填を開始します。針を充填しながら針先を壊さないように注意してください。
注: 胎児あたりの注入量は、特定の実験的なデザインによって異なります。20 μ L に適して注入多数のセル (つまり、卵黄の静脈に 10 の7セルまで。例えば、納品は 1 x 107全骨髄細胞由来の C57BL/6TgN(act-EGFP) OsbY01 ["B6 緑色蛍光タンパク質 (GFP)"] マウスを介して妊娠 14 日 Balb/c 胎児に卵黄の静脈。ウイルスのベクトル注射用 10 μ L の PBS で 1:1 希釈ベクトルの単一の注入に適しています。 - 射出時間を調整するには、以下の手順を実行します。
- プッシュモードボタン注入調整画面を取得するマイクロインジェクターの 3 倍です。100 ms とプッシュモードボタンを 2 倍または 10 の間隔を追加することで射出時間を調整します。
- バランスボタンを押して、一度足のペダルをプッシュします。今もう一度ペダルをプッシュし、プッシュあたり針から空にどのくらいの量を評価します。ペダル プッシュあたり 5-20 μ L の音量に、校正されていない場合は、手順 2.6.1 と 2.6.2 を繰り返します。
注: 一般に、一度に半分の合計ターゲット ・ ボリュームに配信する各プッシュを調整する良いです。以上 30 μ L または合計台数も 40 μ L 注入することが可能ですが、我々 一般的に行っていない静脈または内羊水、胎児ごと 20 μ L 以上。
- 目的のレベルまで針をご記入ください。
- 1 L/分に酸素流量計と 3% にイソフルラン気化器を調整することによってマウスに麻酔を提供することを開始します。
- ペダルの反射の有無をチェックしてマウスを麻酔するかどうかを確認します。仰臥位で加熱パッドにマウスを転送します。
- 角膜の乾燥を避けるために潤滑ゲルを適用します。場所でマウスを固定するには、パッドに上肢および下肢のテーピングします。
- アルコールによって従ったクロルヘキシジン スクラブで腹部を準備し、(例えば0.25% ブピバカインの 100 μ L) 局所麻酔薬を皮下注入 (図 3A)。
- ハサミでは、1-2 cm の皮膚切開を作るし、下の境界線が; 腟口は 1 cm よりも近い下にある筋膜が非常に薄く、半透明です。
- 周囲よりもより透明な筋膜の正中線を識別します。正中線の両側にある腹部の血管を傷つけないように注意してください。必要があります腹部血管が傷つけられて得る、出血を止めるための綿の先端アプリケータで圧力を保持します。
- アドソン鑷子を使用すると、腸、膀胱、胎児など基になる臓器のいずれかをつかむことがなく筋をつまみます。器官の損傷を与えないように注意しながら、ハサミで筋膜を開きます。一度安全に腹部の筋膜切開を延長します。皮膚切開よりも、それはもはやを作る。
- 綿の先端アプリケータを使用すると、妊娠子宮を公開するので、腹部の上部に腸内を移動します。切開、慎重に識別するすべての胎児が (図 3B) を数えられるように右と左の卵巣から子宮を提供します。
- 腹部に戻って左の子宮を置き、右の子宮だけが公開されています。これは子宮の乾燥を防止し、非注入胎児を暖かく保ちます。
- 親指と人差し指の演算子の非支配的な手 (図 3C) 最も外側の胎児/羊膜嚢を保持します。胎児に損害を引き起こさないため穏やかな、常に。
- 解剖顕微鏡 (10 倍が理想的です) を置き、胎児がビューでフォーカスを調整します。良い視覚化のための照明を調整します。
- 注入する部分を識別 (卵黄静脈、羊膜)。静脈注射は、まず卵黄の静脈との吻合を視覚化します。胎嚢内注射方向右側に胎児を表示します。
- 下記のとおり、針でターゲット領域に到達します。
- 静脈注射をした手順に従います。
- 挿入される卵黄静脈が; 針の先端に平行になるので、子宮を回転します。2 つの静脈の吻合部へ注射を行う必要があります覚えておいてください。
- 5 ° の角度で子宮に針を置き、子宮の壁に穴を開けます。先端が子宮の壁から羊膜嚢、卵黄の静脈の上に直接先端を配置します。
- ほぼ接線の角度で傾斜面を貫き、船の進出まで静脈に針を滑空します。これは、針の先端 (図 3D) に見られる血液のフラッシュによって明らかです。
メモ: 針が静脈に最初のグライドと静脈を貫通可能性がありますないと数回の試行をかけて静脈にアクセスします。
- 胎嚢内注射、手順に従います。
- 羊膜の嚢を回転させ、貫通する血管に欠けている場所を見つけます。
- 子宮の壁に垂直の針をポイントし、子宮、卵黄嚢し羊膜の嚢を貫通します。任意の胎児組織を貫通しないように注意します。としてこれは羊膜の嚢に針がある確認する手足間で針が渡されることを確認します。注射に進みます。
- 静脈注射をした手順に従います。
- 足のペダルを押すことによって必要な材料 (通常 10-20 μ L) の適切なボリュームを挿入します。
注: インジェクターを針先の可視化を維持しなければならないので、顕微鏡を用いたすべての回、2 番目の人では注入量を定量化し、どのくらいの量を注入する残っているインジェクターを知らせる針のマーキングを読む必要があります。インジェクターとアシスタントの間注入する前に議論は、混乱と遅延を避けるために重要です。これは、遅延抜針は針と不正確な投与の結果に静脈血が逆流することを許可するために静脈注射に特に重要です。 - 適切なボリュームを配信したら、注射部位から針を撤回します。いくつかの出血することがある容器は静脈内注射でサイトを穿刺、出血を止めるための 10-15 秒の針の側に圧力を保持します。
- 次の胎児に進みます。右子宮角のすべての胎児が注入されているまで続行します。
- 腹部から左子宮角を削除し、腹膜腔の内部に戻って右子宮角を置き換えます。
注: 時折、針、注射液と補充される必要です。 - すべての胎児が注入されている一度腹部 (図 3E) に子宮を交換してください。子宮や腸軸捻転症を避けるためにことを確認します。
- 使い捨て可能な移動のピペットと無意識の損害を交換する腹部に約 2 mL の 1x PBS を配置します。
- 筋膜および閉鎖 (図 3F - 3 G) の中に基になる器官が負傷を避けるために 4-0 polyglactin 910 縫合糸を使用して 1 つの連続的な層で腹部を閉じます。
- テープを取り外し、熱ランプの下にケージにマウス。マウスに余りに近く熱のランプを配置しないように注意してください。ケージには、寝具、食糧および水を確認します。
メモ: サーモスタットに制御された暖かい部屋を使っても可能性があります。マウスは、それは直立歩行し、目を覚ましです。 - マウスを毎日観察し、必要に応じて鎮痛薬を与えます。
注: 我々 日常的に与えるメロキシカム術後日 1、2 と 3 日目の時にマウスの痛みの兆候を示している場合。 - 同じ注入材料とバッチの手術を行う場合は、滅菌 PBS で注射針を一掃します。異なる材料を注射、シャープス コンテナー内の針の処分、新しい針を使用してください。
注: ダムが母乳を介して子犬へと転送抗体に対する免疫応答をマウントの場合、出生後すぐにサロゲート ダムと子犬を育成をお勧めします。
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Representative Results
生存率と生着 IUHCT 実験の成功の重要な措置であります。帝王切開または後天的実験の特定のエンドポイントによって、IUHCT を受けた胎児出生前分析があります。平均では、静脈内注射後の生存率は 75-100% から及ぶ。胎嚢内注射後の生存率は、約 85-100% での静脈注射をより公正な傾向があります。
当研究室では、これらの技術の能力を達成するためにトレーニング プロセスは、約 8-12 ヶ月をかかります。再現性のある方法でこれらの注射を実行するために必要な技能の習得を評価するために研修生は胎児の生存とドナー生セル着、IUT、次短時間の点で監視されます。これは、次の品質管理実験により示しています。具体的には、1 × 107全骨髄細胞は C57BL/6TgN(act-EGFP) OsbY01 から分離されます (「B6 GFP」) マウスは前述5の説明し、妊娠 14 日 Balb/c 胎児卵黄静脈は、注入を介して。1 つのグループで、IUT、経験豊富な講師による、他のグループで行った手法を実践している研修生 〜 4 ヶ月。収穫された胎児肝臓、IUT 後 24 h の代表的な蛍光顕微鏡像を図 4Aのとおりです。研修生が IUT を受けた胎児の肝臓移植の GFP の細胞の低い生着のため少ない蛍光を発する。次にこれらの肝臓 GFP+ドナー細胞の生着のレベルを定量化するためのフローサイトメトリーによる行った。蛍光顕微鏡 (図 4B) の下で見られる画像と 2 つのインジェクター相関の平均生着レベルの差。
配信ルートを経由でイントラ羊水羊水細胞を変換する上皮の伝達によって例証されるウイルスのベクトルの機能細胞広告 GFP (のアデノ ウイルスのベクトルの胎嚢内注射 48 時間GFP 遺伝子10を運ぶ) 妊娠 12.5 日胎仔 (図 5 aと5 b)。
図 1.マイクロ ピペットの引き手が付いているガラス ピペット針を作るプロセス。(A) ガラス ピペットをマウントし、引き手の両端のダイヤルを締め付けて固定します。(B) 保護、熱がアクティブ引きスイッチに。表示されている設定は、熱 #1: 985 とプル: 27。暗いカバー ガラスは、安全のためこのプロセス中に閉じる必要があります。写真撮影目的のため開かれました。(C) マイクロ ピペットが分離されています。下の部分を破棄し、次のステップに分けられたマイクロ ピペットの上部の部分を取る。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 2.針の先端の形にマイクロ ピペットを研削プロセス。(A) このパネルは、研削の一般的なセットアップを示しています。顕微鏡下で先端を視覚化する光源です。(BとC) は、15-20 ° の角度でピペットをマウントします。研削プロセス全体で破片の (D) の蓄積が期待されます。ペイント ブラシを使用すると、研削プロセスのより良い視覚化を得る先端をクリアします。個人チップやギザギザなし (E) はよく地面針先が 4 倍の倍率で表示されます。(F G、およびH)10 倍の倍率の下で地面の針の再検査では、先端の鋭利な先端のまわりの滑らかなエッジとよく地面針を示しています。別の角度で針をご確認ください。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 3.開腹し子宮内移植します。(A) にひげをそる、麻酔テープの妊娠中のダムと彼女の腹部を準備します。(B)、開腹後すべての胎児の識別のため腹部外子宮の全体を提供します。(C) 位置胎児外科医の非利き手の人差し指と薬指との張力を維持しながら親指で。胎児に関連して顕微鏡下で針の先端を識別します。マイクロ ピペット針に血のバックに流れるは (D) フラッシュは、卵黄の静脈カニュレーション時に見られなければなりません。(E) すべての注射が終了した後の配置すべて胎児の腹部に。(F) 4-0 polygalactin 910 縫合糸を用いた単層実行しているステッチと腹部に閉じる。(G)、腹部が完全に閉じて、一度は、ダムの熱ランプの下で回復をしましょう。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 4.卵黄の静脈注射後ドナー全体骨髄単核球細胞の生着します。(研修生) の生着の程度の違い (A) セルの漏れを蛍光顕微鏡下で明確に示す (インストラクター) なし。(B) パーセント キメリズムも流れフローサイトメトリー分析によって示されている同じ発見を反映されます。各データ ポイントは、別の注入胎児から肝臓を表します。実験は、1 つの研修と 1 つのインストラクターによって行われた.誤差範囲は、標準偏差 (SD) を表します。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 5.胎児の胚広告 GFP の胎嚢内注射後 48 時間で緑の蛍光蛋白質の表現パターンです。(A) このパネル広告 GFP E12.5 (E12.5/E14.5) での胎嚢内注射後に E14.5 で GFP ステンド グラス角膜 (赤矢印) と皮膚を示しています。高倍率で ( 、パネルに薄い青色のボックスで示される) 胚の背面の (B) A cryosection は、ウイルスの伝達は、浅 peridermal 細胞層 (赤矢印) とない表皮 (epi) に限られることを示しています。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
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Discussion
子宮内移植は、妊娠の早い段階で診断することができます多くの先天性疾患に対する潜在的な療法です。IUT のマウスモデルでは、研究者胎児環境を探索するか、別の治療法を実験することができます。挿入されると何が目標とされている、に応じて静脈または内羊膜の子宮内移植は望ましい領域に、乳液の信頼できる配信を提供できます。
特定の臓器をターゲットにする場合は、注入の技術と同様、胎児の適切な発生学的年齢を選択することが重要です。E14 で細胞の静脈注射は血液のニッチをターゲットに最適、E16 で胎嚢内注入は肺をターゲットに最適です、これらのオプションだけではありません。たとえば、胎嚢内注射が行えます胎児 E8 早くも超音波ガイダンス8。全身配信も E9 - E1011で超音波ガイド下心臓内注射で E14 まで可能です。胎児の開発のさまざまな段階で注射を実行する可能性を提供しています安全性と遺伝子の転送の効率を調査実験の大きな可能性と発達の基本的な質問の調査だけでなく、細胞移植生物学。
さらに、静脈内投与と胎嚢内配信に加えて他のサイトも承ります療法または追求される科学的な質問の目的に応じて対象。子宮の筋肉筋ジストロフィー12、13脊髄運動ニューロンの伝達のための脊柱のアプローチのための遺伝子導入のアプローチが使用されているし、遺伝子の頭蓋内アプローチをターゲットに転送中枢神経系疾患14。配信の各ルートは最終的に15造血ニッチをターゲットとして、造血細胞移植子宮内は、肝内および腹腔内のルートは追加実行可能なオプションです。しかし、静脈移植ルートは造血ニッチにドナー細胞のより効率的なホーミングとなしの安定の長期的なドナー細胞生着の全体的に高いレベルの結果、ドナー細胞の大きい投与、します。胎児死亡率1を追加しました。
IUT の実行は、幹細胞生物学、免疫発生学と免疫学的寛容誘導、発生生物学を勉強するため生体内でユニークなアプローチを可能にする強力で汎用性の高いツールの上詳細しているプロトコルと出生前の遺伝子治療・ ゲノムを編集します。これらの送付方法はまた関連の臨床的意義があるし、犬と羊モデル4,16など前臨床試験の大規模な動物モデルで IUHCT と子宮内の遺伝子治療の研究のための基礎をされています。発生生物学の新しいアイデアをテストし、先天性の遺伝的、血液、免疫、代謝の異常を壊滅的な新しい療法を探る貴重なツールとして続けます。
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Disclosures
著者が明らかに何もありません。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Gloves | Cardinal Health | 2D73DP65 | |
| Adson Forceps w/ teeth | Fine Science Tools | 11027-12 | |
| Adson Forceps w/o teeth | Fine Science Tools | 11006-12 | |
| Curved scissors | Fine Science Tools | 14075-11 | |
| Heavy Scissors | Fine Science Tools | 14002-13 | |
| Needle Driver | Fine Science Tools | 12005-15 | |
| Vicryl 2.0 | Ethicon | JB945 | |
| Transfer Pipette | Medline | GSI135010 | |
| Cotton Tipped Applicators | Medline | MDS202000 | |
| 50 mL Conical tube | Fischer Scientific | 14-432-22 | |
| Tape | 3M | 1527-1 | |
| Eye lubricant | Major LubriFresh | 0904-6488 | |
| Heating Pad | K&H | 3060 | |
| Stereomicroscope | Leica | MZ16 | |
| Injector | Narishige | HI01PK01 | |
| Glass Capillary tubes | Kimble | 71900-100 | |
| Vertical Micropipette Puller | Sutter Instruments | P-30 | |
| Microelectrode Beveler | Sutter Instruments | BV-10 | |
| IM-300 Pneumatic Microinjector | Narishige | IM-300 | |
| Insulin Syringe | BD | 305935 | |
| Filter | Genesee Scientific | 25-244 | |
| Compac5 Anesthesia Machine | VetEquip Compac5 | 901812 | |
| Isoflurane | Piramal Critical Care | NDC 66794-017-25 | |
| N2 gas | Airgas | NI 125 | |
| O2 gas | Airgas | OX 125 | |
| Ad-GFP viral vector | Penn Vector Core | H5'.040.CMV.eGFP |
References
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