Summary
Biz bir rahim içinde nakli (IUT) intravenöz ve içi amniyotik yolları enjeksiyon fare modeli gerçekleştirmek için bir protokol tanımlamak. Bu iletişim kuralı hücreleri, viral vektörel çizimler ve diğer maddelerin benzersiz bağışıklık dayanıklı fetal ortama tanıtmak için kullanılabilir.
Abstract
Rahim içinde nakli (IUT) kök hücreler, viral vektörler veya herhangi bir diğer maddeler erken gebelik tanıtmak için kullanılan terapi, benzersiz ve çok yönlü bir modudur. IUT arkasındaki mantığı için tedavi amacıyla fetus, fetal immünolojik gelişmemişlik, erişilebilirlik ve cenin kök veya progenitör hücre ve bir hastalığı tedavi etmek için potansiyel proliferatif doğa veya belirtilerin başlangıcı küçük boyutuna göre Doğum öncesinde. Fetus, hematopoetik kök hücre (HSC) yolu ile gösterimi bu normal gelişim özelliklerini yararlanarak bir IUT gerekli olmadan orak hücre hastalığı gibi konjenital hematolojik bozuklukları tedavi potansiyeline sahiptir myeloablative veya immünsüpresif Klima postnatal HSC nakli için gerekli. Benzer şekilde, birden çok organlarda progenitör hücrelerin erişilebilirlik geliştirme sırasında potansiyel bir daha verimli bir gen tedavisi veya genom düzenleme viral vektörler IUT takip kök/progenitor hücre hedefleme için sağlar. Ayrıca, IUT olabilir de dahil olmak üzere normal gelişim süreçleri çalışırdım, ama immünolojik tolerans gelişimi için sınırlı değildir. Fare modeli potansiyeli ve önceden klinik büyük hayvan çalışmaları ve nihai bir klinik uygulama öncesinde IUT sınırlamaları anlamak için değerli ve uygun bir yol sağlar. Burada, intravenöz ve içi amniyotik yolları fare fetus bir IUT gerçekleştirmek için bir protokol açıklayın. Bu iletişim kuralı gerekli koşullar ve mekanizmaları rahim içinde hematopoetik kök hücre transplantasyonu, hoşgörü indüksiyon ve rahim içinde gen terapisi arkasında aydınlatmak için başarılı bir şekilde kullanılmıştır.
Introduction
Son gelişmeler antenatal tarama ve tanı fetus yeterli Doğum sonrası tedavi seçenekleri var ve önemli morbidite ve mortalite neden konjenital bozukluklar bir dizi tedavi imkanı ışık için getirdim. Özellikle, rahim içinde hematopoetik kök hücre transplantasyonu (IUHCT) ve gen terapisi/genom düzenleme hematolojik, bağışıklık ve genetik konjenital tedavisinde fetusun normal gelişim özelliklerinin avantajlarından yararlanın potansiyeline sahip daha verimli postnatal HSC nakli ve tedavi/Genom Gen düzenleme1,2yapabilirsiniz daha bozuklukları. Özellikle, fetus küçük boyutu nedeniyle, donör hücre veya viral vektör doz alıcı kilo maksimize. Ayrıca, fetusun immünolojik gelişmemişlik donör myeloablative ve immünsupresif Klima enjekte edilir HSCs Doğum sonrası organ nakli Protokoller'de gereklidir sağlar. Benzer şekilde, bir terapötik transgene ya da genom düzenleme teknoloji taşıyan viral vektörler transgene ürün ya da viral vektör bir sınırlayıcı bağışıklık yanıtı olmadan enjekte edilebilir. Son olarak, erişilebilirlik ve cenin kök/progenitor hücre proliferatif doğa Bisiklete binme gerektiren belirli modları genom düzenleme (Homoloji yönetmen onarım) yanı sıra hedef progenitör hücrelerin daha verimli bir iletim olasılığını göze verimli bir şekilde gerçekleşmesi için hücreleri. Fare modeli kök hücre biyolojisi ve İmmünoloji önceden klinik büyük hayvan modellerinde deneme önce önemli soruları ele için anlayışlı ve uygun fiyatlı bir araç olarak hizmet vermektedir ve bu nedenle, hangi IUHCT ve rahimde birincil model olarak hizmet vermiştir gen terapisi keşfedilmeyi1,2,3olmuştur.
Her ne kadar fazla değişken IUHCT ve rahim içinde gen terapisi/genom fare ve büyük hayvan modellerinde düzenleme başarısında önemli bir rol oynamaktadır, bir anahtar değişken teslim HSCs veya viral vektör yöntemidir. Donör HSCs fetal karaciğer, hematopoetik organ IUHCT, zaman içinde meydana gelen bir ilk geçiş etkisi ile yüksek dozda teslimini engraftment fare ve büyük hayvan modeller4 macrochimeric düzeyleri ulaşmada vesile olmak için gösterilen ,5. Bu elde ile donör hücreleri ile fare modeli vitelline ven ve üzerinden intra kardiyak iğne köpek modelindeki bir enjeksiyon yapıldı. Rota enjeksiyon de progenitör hücrelerin farklı organların gelişimi sırasında hedefleme temel bir rol oynar. Örneğin, bir İntravenöz enjeksiyon yolu ile vitelline ven verimli bir şekilde cardiomyocytes ve geç gebelik enjeksiyon6,7takip tetkikine transduce gösterilmiştir. Alternatif olarak, fiziksel olarak sunulan organları enjeksiyon8sırasında embriyonik katlanır/geliştirme üzerinde temel hedefleme viral vektörler içi amniyotik bir enjeksiyon sağlar. Bu en iyi solunum epitel ile gebelikte hangi amniyon içinde viral vektör için solunum yolu sunar "nefes" normal cenin hareketleri yararlanmak için geç içi amniyotik bir enjeksiyon hedefleyerek örneklenir sıvı9. Bu iki işletim modundan birinde IUT, intravenöz üzerinden vitelline ven ve içi amniyotik, birden çok geçmiş ve devam eden bizim laboratuvar deneylerinde temeli olmuştur. Bu protokol için biz Intravenöz ve içi amniyotik IUT fare modelinde gerçekleştirmek için yöntem ayrıntılı olarak tarif.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Deneysel protokol kurumsal hayvan bakım ve kullanım Komitesi Çocuk Hastanesi Philadelphia tarafından kabul edildi.
1. enjeksiyon pipetler oluşturulması
- Bir dikey micropipette çektirmenin kullanarak, bir 100 µL microcapillary pipet (Şekil 1A - 1 C) çek. Konik sonuna > 1 cm uzunluğunda olması micropipette çektirme kalibre edin.
Not: Başlangıçta, çektirme ayarlarını optimum bir uzunluk için ayarlanmalıdır. Daha yüksek bir ısı ayarı ucunu daha uzun hale getirecek ve daha yüksek çekme ayarları ucu çapının dar yapacaktır. - Böylece ≥ 1 cm uzunluğunda konik sonunda kesti. İğne ucunda iç çapı 70 µm ve 100 µm arasında olduğunu ve konik sonuna uzunluğu ters orantılı olduğundan emin olun.
Not: İç çapı da micropipette çektirme kalibrasyon üzerinde bağlıdır. Dikey micropipette çektirme veya herhangi bir tercih edilen micropipette çektirme tipi üreticinin yönergelerine bakın. - İğne doğru iç çapı olduğunu kontrol ettikten sonra 15-20 derece konik ucunu micropipette beveller bir elmas netlik tekerlek (Şekil 2A - 2 C) kullanarak keskinleştirme tarafından oluşturun. Direksiyonu kırma veya ucu çatlama olasılığını azaltmak için çok fazla baskı olmadan ucunda yavaşça dinlenmek emin olun.
Not: Bir fırça uzakta iğne ucunda kurar herhangi bir enkaz silmek için kullanılabilir. - İpucu bir mikroskop altında değerlendirmek ve ucu herhangi bir fiş ya da çatlamak yuvarlak olduğundan emin olun. İç çapı 70 µm ve 100 µm (Şekil 2B - 2 H) arasında olduğundan emin olmak için yeniden değerlendirmek.
- Aralarında hacmi 5 µL belirlemek için iğne diğer çizgiler çizmek (Örneğin, bir iç çapı 1.3 mm iğne olması gereken 3,77 mm artışlarla çizilmiş çizgiler).
- Otoklav ameliyatta kullanıp onları steril eldiven ile idare etmek belgili tanımlık iğne önce.
2. rahim içinde enjeksiyonları
- Hazırlamak gerekli ısıyla tarafından onları vaktinden aletleri. Microinjector iğne bağı, bir cerrahi iğne sürücü, Adson forseps, eğri normal doku makas, 1 mL insülin şırınga, pamuk-tıp uygulayıcıları bir çift, bir transfer pipet, 50 mL konik Tüp, bir çift bir çift gibi temel araçlar içerir ve bir 4-0 polyglactin 910 dikiş sürüsü.
- Steril tekniği kullanarak, iğne iğne bağı takmak ve microinjector takın.
Not: Kullanılan sıkıştırılmış azot ayarlarını takip şunlardır: 4-6 psi enjekte, 0 psi dengelemek. Ne, özellikle, injectate, viskozite, hem de micropipette boyutunu enjekte bağlı olarak enjeksiyon saatlerini farklı arasında 0,3 - 1,5 s. - 5-10 µL steril 1 fosfat tamponlu tuz çözeltisi (PBS) x kadar çizim ve sonra temizleyerek mümkün herhangi bir enkaz iğne ucu temiz. Bu 2-3 x tekrarlayın.
- Hamile 2 için 6-aylık dişi fareler bir kesme makinesi ile onların abdomens tıraş tarafından ameliyat için hazırlayın. Meme zarar vermemeye dikkat et. Sözlü ağrı kesici (Örneğin, 1.5 mg/mL Meloksikam oral süspansiyon fare başına 100 µL) yönetmek için.
- İstenen ses seviyesinde istenen malzeme (hücre/vektör/ilaç) ile iğne doldurma başlamak. İğne ucu iğne doldururken kırmamaya dikkat et.
Not: Enjeksiyon fetüsün başına hacmi belirli deneysel tasarımına bağlı olarak değişir. Çok sayıda hücre (yani, vitelline damar 107 hücrelere kadar. enjekte 20 µL verir Örneğin, 1 x 107 bütün kemik iliği hücreleri izole C57BL/6TgN(act-EGFP) OsbY01 teslim ["B6 yeşil flüoresan Protein (GFP)"] fare ile vitelline damar Gestasyonel gün-14 Balb/c fetusa içine. Viral vektör enjeksiyonlar için PBS ile 1:1 seyreltilmiş vektör 10 µL tek bir enjeksiyon kuyusu. - Enjeksiyon zamanı ayarlamak için aşağıdaki adımları uygulayın.
- İtme modu enjeksiyon kalibrasyon ekran almak için microinjector üzerinde 3 x düğmesine basın. Aralıklarla 10 ekleyerek enjeksiyon zamanını ayarlayın veya 2 x 100 ms ve itme modu düğmesi.
- Bir kez ayak pedalı itmek ve denge düğmeye. Şimdi tekrar pedala bas ve değerlendirmek ne kadar toplu iğne başı itme dışarı boşaltılır. 5-20 µL pedal itme başına istenen hacmi için kalibre değil, 2.6.1 ve 2.6.2 yineleyin.
Not: Genel olarak, yarım toplam hedef birimi teker teker teslim bas-konuþ her ayarlamak iyidir. O 30'dan fazla µL veya toplam hacminin bile 40 µL enjekte etmek mümkün olmakla birlikte, biz genellikle fetüs, intravenöz veya içi amniyotik başına 20 µL üzerine gitme.
- İğneyi istenen seviyeye kadar doldurun.
- 1 L/dk oksijen akış ölçer ve % 3 isoflurane Buharlaştırıcı ayarlayarak fare anestezi teslim başlatın.
- Fare pedal refleks olmaması için kontrol ederek anestezi olup olmadığını doğrulayın. Fareyi bir ısıtma yastığı sırtüstü pozisyonda aktarın.
- Kornea kuruma önlemek için yağ göz jeli uygulayın. Yerde fare pedi için üst ve alt ekstremitelerde taping tarafından güvenli.
- Alkol tarafından takip klorheksidin maki ile karın hazırla ve subkutan lokal anestezi (Örneğin, % 0.25 bupivacaine 100 µL) enjekte (Şekil 3A).
- Alt sınır için sıyrıklar 1 cm yakın olması makasla, 1-2 cm cilt kesi yapmak; fasya altında çok ince ve saydam bir.
- Çevredeki şeffaf olan fasya midline tanımlayın. Orta çizgi her iki tarafında yalan epigastrik damarlar zarar değil dikkatli olun. Epigastrik damarlar yaralı, basınç kanamayı durdurmak için pamuk-tıp uygulayıcıları ile tutun.
- Adson forseps kullanarak, fasya herhangi bir bağırsak, mesane veya fetusa gibi temel organlara kapma olmadan çimdik. Fasya organların herhangi bir zarar vermemesi için dikkatli olmak makas ile açın. Bir kez güvenli bir şekilde karın, fasial kesi genişletmek. O artık cilt kesi yapmak.
- Pamuk-tıp uygulayıcıları bağırsak böylece açığa gravid rahim karın üst kısmına taşımak için kullanın. Rahim dikkatle tüm fetusa (Şekil 3B) dikkate alınır emin olmak için sağ ve sol yumurtalık tanımlamak belgili tanımlık kesme dışarı teslim.
- Sadece doğru rahim maruz sol rahim karın geri yerleştirin; Bu kuruma rahim engeller ve sigara enjekte fetusa sıcak tutuyor.
- Başparmak ve işaret parmakları operatörün sigara dominant el (Şekil 3C) arasında en yanal fetüs/amniyotik kese tutun. Her zaman herhangi bir hasar için fetusa değil neden olarak nazik ol.
- (10 X büyütme idealdir) diseksiyon mikroskop getirin ve fetus görünümünde odağı ayarlamak. Aydınlatma daha iyi görselleştirme için ayarlama yapar.
- Eklenecek bölüm tanımlamak (vitelline ven, amnion). İntravenöz enjeksiyonlar için ilk vitelline damarlar ve onların anastomoz gözünde canlandır. İçi amniyotik enjeksiyon için görünümde fetus sağ tarafı gelecek şekilde yönlendirin.
- Aşağıda açıklandığı gibi iğne ile hedef alan ulaşmak.
- Bir İntravenöz enjeksiyoniçin aşağıdaki gibi yapın.
- Enjekte edilir vitelline ven paralel iğne ucu rahim döndürür; Enjeksiyonlar iki damarlar anastomoz doğru yapılması gerekir unutmayın.
- 5 ° açıyla rahim iğne yatıyordu ve rahim duvarı delip. Rahim duvarı ve amniyotik kese arasında yolgösterendir göre ucunu doğrudan vitelline damar üstüne yerleştirin.
- Eğimin delip geçiyor ve geminin gelişmeler kadar neredeyse teğet bir açıyla iğne damar üzerinde kayma; Bu bir flaş iğne ucu (Şekil 3D) görülen kan tarafından açıktır.
Not: değil iğne ilk kayma ile damar damar üzerinde pierce gibi damar erişen bir kaç denemeden sürebilir.
- Bir içi amniyotik enjeksiyoniçin aşağıdaki gibi yapın.
- Amniyotik kese döndürün ve damarları delmek için yoksun bir yer bulmak.
- Rahim duvara dik iğne üzerine gelin ve rahim, sarısı sac ve sonra amniyotik kese ile delip. Fetal herhangi bir doku ile delip değil dikkatli olun. Bu iğneyi amniyotik kese olduğunu onaylar gibi iğne uzuvların geçti emin olun. Sonra enjeksiyon ile devam edin.
- Bir İntravenöz enjeksiyoniçin aşağıdaki gibi yapın.
- İstenen malzemenin (genellikle 10-20 µL) uygun hacmi ayak pedalı iterek enjekte.
Not: enjektör iğne ucu ile görselleştirme korumak gerekir çünkü mikroskop her zaman, ikinci bir kişi, iğneyi enjekte miktarı ölçmek ve enjektör enjekte etmek için ne kadar çok ses yaptı bilgilendirmek üzerindeki işaretleri okumak gerekir. Bir tartışma enjektör ve Yardımcısı arasında enjeksiyon öncesinde herhangi bir karışıklık ve gecikme önlemek önemlidir. İğne gecikmeli kaldırılmasını iğne ve bir yanlış dozaj sonucu içine geri tepme venöz kan sağlayacak çünkü bu özellikle İntravenöz enjeksiyonlar için önemlidir. - İstenen ses teslim sonra iğneyi enjeksiyon sitesinden geri alıyorum. Olabilir gibi bazı gelen kanama gemi İntravenöz enjeksiyonlar sitesiyle ponksiyon, basınç kanamayı durdurmak 10-15 s için iğne tarafı ile tutun.
- Sonraki fetus için devam edin. Şu rahim korna tüm fetusa enjekte edilmiş kadar devam edin.
- Sol rahim boynuz karından kaldırın ve periton boşluğuna içeri doğru rahim boynuz değiştirin.
Not: Bazen, iğneyi injectant ile doldurulmuş gerekir. - Bir kez tüm fetusa enjekte edilmiş, rahim karın (Şekil 3E) değiştirin. Rahim veya bağırsak volvulusu önlemek emin olun.
- Tek kullanımlık transfer pipet ile kabaca 2 mL 1 x PBS duyarsız herhangi bir kayıp yerine karın yerleştirin.
- Fasya ve karın bir sürekli katmanındaki temel organları kapatma (Şekil 3F - 3 G) sırasında yaralamak için 4-0 polyglactin 910 dikiş kullanarak kapatın.
- Bandı çıkarın ve bir kafes a ısı lamba altında fare aktarmak. Fare ısı lamba çok yakın yeri yok dikkatli olun. Odada mevcut yataklar kullanılıyorsa, gıda ve su kafes olduğundan emin olun.
Not: Bir termostatik kontrollü sıcak odası da kullanılabilir. Dik ve yürüyüş olduğunda fare kendine geldi. - Fare her gün gözlemlemek ve gerektiği gibi ağrı kesici verin.
Not: fare ağrı belirtileri gösteriyorsa rutin Meloksikam ameliyat sonrası gün 1 ve 2 ve bazen 3. gün veriyoruz. - Bir toplu iş anahtarıyla aynı enjeksiyon malzemesi yapan enjeksiyon iğne steril PBS ile dışarı temiz. Farklı bir malzeme ile enjekte iğne "Sharps" kap içinde imha ve yeni bir iğne kullanın.
Not: Baraj injectant ve transferler karşı antikorlar için anne sütü pups üzerinden bir bağışıklık yanıtı bağlar diye hemen doğumdan sonra vekil barajlar ile belgili tanımlık pups teşvik önerilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Hayatta kalma ve engraftment IUHCT deneyler için başarının önemli önlemlerdir. Bir deney bağlı olarak belirli bitiş noktaları, bir IUHCT alınan fetüsler prenatally sezeryan veya postnatally analiz. Ortalama olarak, İntravenöz enjeksiyonlar sonra sağkalım oranları % 75-100 aralığı. Sağkalım oranları içi amniyotik enjeksiyonları sonra yaklaşık % 85-100 İntravenöz enjeksiyon daha iyi Fuar eğilimindedir.
Bizim laboratuvar bu teknikler yeterlilik ulaşmak için eğitim süreci yaklaşık 8-12 ay sürer. Bu iğneleri bir tekrarlanabilir biçimde gerçekleştirmek için gereken becerileri edinme değerlendirmek için stajyerler IUT takip kısa sürede noktalarda fetal hayatta kalma ve donör hücre engraftment için izlenir. Bu aşağıdaki kalite kontrol deneyleri tarafından gösterilmiştir. Özellikle, 1 x 107 bütün kemik iliği hücreleri izole C57BL/6TgN(act-EGFP) OsbY01 ("B6 GFP") fareler daha önce açıklanan5 ve vitelline damar Gestasyonel gün-14 Balb/c fetusa içine enjekte ile vardır. Bir grupta IUT deneyimli bir eğitmen tarafından ve diğer grubunda tekniği için pratik bir stajyer tarafından gerçekleştirilen ~ 4 ay. Hasat fetal karaciğer IUT sonra 24 h görüntülerini temsilcisi floresan mikroskopi Şekil 4' teAgösterilir. IUT stajyer tarafından alınan fetüsler karaciğerleri transplante GFP hücrelerinin bir alt engraftment nedeniyle daha az belli. Bu karaciğer sonra GFP+ donör hücreleri için engraftment düzeylerini ölçmek için akış sitometresi tarafından analiz edildi. Adi engraftment seviyeleri iki enjektörleri ilişkilendirir Floresan Mikroskobu (Şekil 4B) altında görülen görüntüleri ile arasındaki farkı.
48 h reklam-GFP (bir adenovirus vektör içi amniyotik enjeksiyonu takiben viral vektörler epitel, iletim tarafından teslim yolu ile hücre amniyotik sıvı temas transduce içi amniyotik rota örneklenir yetenek hücreleri GFP transgene10taşıyan) gebelik gün-12,5 fetusa (Şekil 5A ve 5B) içinde.
Resim 1 . Micropipette çektirme Cam Pipet iğne yapma süreci. (A)Cam Pipet Mount ve her iki ucundaki çektirme aramalar sıkma tarafından güvenli. (B) bir kez güvenli, ısı çekerek anahtarı etkinleştirir. Isı #1 gösterilen ayarlar şunlardır: 985 ve çekme: 27. Karanlık cam güvenliği için bu işlem sırasında kapatılması gerekir. Photoshoot amaçlı açılmıştır. (C) micropipette ayrılır. Alt bölümüne atın ve sonraki adımlar için ayrılmış micropipette üst kısmı götürün. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Resim 2 . İğne ucu şekle micropipette öğütme işlemi. (A) Bu panel öğütme genel kurulumunu gösterir. Bir ışık kaynağı uç mikroskop altında görselleştirmek için gereklidir. (B ve C) micropipette 15-20 ° açıyla bağlayın. (D) A birikmesi enkaz zımparalama işlemi süresince bekleniyor. Öğütme işleminin daha iyi bir görsel öğeyi almak için belgili tanımlık uç temizlemek için bir fırça kullanın. (E) A iyi yer iğne ucu herhangi bir tanımlanabilir fiş ya da pürüzlü kenarları olmadan bir 4 X büyütme altında gösterilir. (F, Gve H) 10 X büyütme altında zemin iğne yeniden incelenmesi keskin bir uç ve belgili tanımlık uç etrafında düzgün kenarlara iyi zemin bir iğneyle gösterir. Farklı açılardan iğne kontrol etmek emin olun. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 3 . Laparotomi ve rahim içinde nakli. (A)tıraş, anestezi ve hamile bir baraj teyp ve karnının hazırlayın. (B) laparatomi sonra rahim dışında bir teşhis edilmesi için kullanılan tüm fetusa karın tamamı teslim. (C) pozisyon fetus cerrahın baskın işaret parmağı ve başparmak üçüncü parmak ile gerginlik korurken. Fetus ile ilgili olarak mikroskop altında iğne ucu tanımlayın. Geri akan kan, (D) A flash uygulamasına micropipette iğneyi vitelline ven cannulation görülmelidir. (E) tüm enjeksiyonlar tamamlanmasından sonra fetus karın geri yerleştirin. (F) yakın bir tek katmanlı çalışan 4-0 polygalactin 910 dikiş kullanarak dikiş ile karın. A ısı lamba altında kurtarmak Barajı (karın tamamen kapatıldıktan sonraG) ver. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 4 . Vitelline ven enjeksiyon sonra donör bütün kemik iliği mononükleer hücrelerin engraftment. (A) engraftment (Stajyer) ile derecesini farklılığı ve (eğitmen) hücreleri kaçağı açıkça floresan mikroskobu altında gösterilir. (B) yüzde chimerism aynı zamanda Akış Sitometresi Analizi tarafından gösterilen aynı bulma yansıtılır. Her veri noktası üzerinden farklı enjekte cenin karaciğer temsil eder. Deneme bir stajyer ve bir öğretim görevlisi tarafından gerçekleştirildi. Hata çubukları bir standart sapma (SD) temsil eder. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 5 . Fetal embriyo 48 h reklam-GFP içi amniyotik bir enjeksiyon sonra yeşil flüoresan proteinin ifade deseninin. Kornea (kırmızı ok) ve cilt E14.5, GFP ile reklam-GFP, E12.5 (E12.5/E14.5) içi amniyotik bir enjeksiyon sonra lekeli (A) Bu panel gösterir. (B) A cryosection (mavi ışıklı birpanelinde gösterilir) embriyo daha yüksek büyütmede geri viral iletim yüzeysel peridermal hücre katmanı (kırmızı oklar) ve epidermis (EPI) ile sınırlı olduğunu gösterir. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Rahim içinde nakli erken gebelik tanısı birçok konjenital bozukluklar için potansiyel bir tedavi yöntemidir. Fare modeli IUT için araştırmacılar fetal çevre keşfetmek için veya farklı terapileri ile deneme için izin verir. Ne enjekte edilir ve ne hedef bağlı olarak, intravenöz veya içi amniyotik rahim içinde nakli bir injectant bir güvenilir teslim istenen alanı içine sağlayabilir.
Belirli organ hedef olarak gösterirken, fetus yanı sıra enjeksiyon tekniği uygun Embriyoda yaş almak önemlidir. İntravenöz enjeksiyon, E14 hücrelerinin hematolojik niş hedeflemesi için idealdir ve E16, içi amniyotik enjeksiyon akciğer hedefleme için idealdir, bunlar tek seçenekleri kullanılabilir değildir. Örneğin, içi amniyotik enjeksiyonları fetus için E8 gibi erken ultrason rehberlik8ile gerçekleştirilebilir. Sistemik teslim E14 önce ultrason destekli intra kardiyak enjeksiyonları E9 - E1011yönü ile mümkündür. Enjeksiyonları çeşitli yaşlardaki fetüsün gerçekleştirme fizibilite araştırma Emanet ve gen aktarımı verimliliğini deneyler için büyük bir potansiyel sunmaktadır ve gelişimsel temel soruları araştıran yanı sıra hücre nakli Biyoloji.
Ayrıca, intravenöz ve içi amniyotik teslim yanı sıra diğer siteler de terapi veya takip ediliyor bilimsel soru amacı bağlı olarak hedeflemek için mevcuttur. Rahim içinde yaklaşım muskuler dystrophies12, omurilik motor nöronlar13, iletim için kesici bir yaklaşım için bir gen transferi için kullanılan ve kafa içi bir yaklaşım gen için hedefe aktarır kas içi Merkezi sinir sistemi hastalıkları14. Rahim içinde hematopoietik hücre transplantasyonu için her yola ait teslimat sonuçta hematopoetik niş15hedefleyen ek uygun seçenekler intrahepatic ve mayi yollar şunlardır. Ancak, donör hücreleri hematopoetik niş içine daha verimli bir posta ve böylece istikrarlı uzun vadeli donör hücre engraftment genel olarak daha yüksek seviyelere elde donör hücrelerinin büyük bir dozaj için intravenöz nakli yol sağlar fetal mortalite1eklendi.
Biz detaylı sahip yukarıda IUT gerçekleştirmek için güçlü ve çok yönlü araçlar eğitim kök hücre biyolojisi, gelişimsel İmmünoloji ve immünolojik tolerans indüksiyon, gelişim biyolojisi, bir benzersiz vivo içinde yaklaşım için izin iletişim kuralları ve Doğum öncesi gen terapisi/genom düzenleme. Bu teslim yöntemi Ayrıca ilgili klinik uygulamaları bulunmaktadır ve çalışmalar köpek ve ovine model4,16gibi önceden klinik büyük hayvan modellerinde IUHCT ve rahim içinde gen tedavisinin temeli olmuştur. Onlar yeni fikirler gelişim biyolojisi sınamak ve konjenital, hematolojik, bağışıklık, genetik ve metabolik bozukluklar yıkıcı için yeni tedaviler keşfetmek için değerli bir araç olarak hizmet vermeye devam edecektir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarlar ifşa gerek yok.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Gloves | Cardinal Health | 2D73DP65 | |
| Adson Forceps w/ teeth | Fine Science Tools | 11027-12 | |
| Adson Forceps w/o teeth | Fine Science Tools | 11006-12 | |
| Curved scissors | Fine Science Tools | 14075-11 | |
| Heavy Scissors | Fine Science Tools | 14002-13 | |
| Needle Driver | Fine Science Tools | 12005-15 | |
| Vicryl 2.0 | Ethicon | JB945 | |
| Transfer Pipette | Medline | GSI135010 | |
| Cotton Tipped Applicators | Medline | MDS202000 | |
| 50 mL Conical tube | Fischer Scientific | 14-432-22 | |
| Tape | 3M | 1527-1 | |
| Eye lubricant | Major LubriFresh | 0904-6488 | |
| Heating Pad | K&H | 3060 | |
| Stereomicroscope | Leica | MZ16 | |
| Injector | Narishige | HI01PK01 | |
| Glass Capillary tubes | Kimble | 71900-100 | |
| Vertical Micropipette Puller | Sutter Instruments | P-30 | |
| Microelectrode Beveler | Sutter Instruments | BV-10 | |
| IM-300 Pneumatic Microinjector | Narishige | IM-300 | |
| Insulin Syringe | BD | 305935 | |
| Filter | Genesee Scientific | 25-244 | |
| Compac5 Anesthesia Machine | VetEquip Compac5 | 901812 | |
| Isoflurane | Piramal Critical Care | NDC 66794-017-25 | |
| N2 gas | Airgas | NI 125 | |
| O2 gas | Airgas | OX 125 | |
| Ad-GFP viral vector | Penn Vector Core | H5'.040.CMV.eGFP |
References
- Loukogeorgakis, S., Flake, A. In utero stem cell and gene therapy: current status and future perspectives. European Journal of Pediatric Surgery. 24, 237-245 (2014).
- Vrecenak, J., Flake, A. In utero hematopoietic cell transplantation: recent progress and the potential for clinical application. Cytotherapy. 15, 525-535 (2013).
- Peranteau, W., et al. Correction of murine hemoglobinopathies by prenatal tolerance induction and postnatal nonmyeloablative allogeneic BM transplants. Blood. 126 (10), 1245-1254 (2015).
- Vrecenak, J., et al. Stable Long-Term Mixed Chimerism Achieved in a Canine Model of Allogeneic in utero Hematopoietic Cell Transplantation. Blood. 124 (12), 1987-1995 (2014).
- Peranteau, W., et al. CD26 Inhibition Enhances Allogeneic Donor-Cell Homing and Engraftment after in utero Hematopoietic-Cell Transplantation. Blood. 108 (13), 4268-4274 (2006).
- Waddington, S., et al. In utero gene transfer of human factor IX to fetal mice can induce postnatal tolerance of the exogenous clotting factor. Blood. 101 (4), 1359-1366 (2003).
- Stitelman, D., et al. Developmental Stage Determines Efficiency of Gene Transfer to Muscle Satellite Cells by in utero Delivery of Adeno-Associated Virus Vector Serotype 2/9. Molecular Therapy - Methods & Clinical Development. 1, 14040 (2014).
- Endo, M., et al. Gene Transfer to Ocular Stem Cells by Early Gestational Intraamniotic Injection of Lentiviral Vector. Molecular Therapy. 15 (3), 579-587 (2007).
- Boelig, M., et al. The Intravenous Route of Injection Optimizes Engraftment and Survival in the Murine Model of In utero Hematopoietic Cell Transplantation. Biology of Blood and Marrow Transplantation. 22 (6), 991-999 (2016).
- Wu, C., et al. Intra-amniotic Transient Transduction of the Periderm with a Viral Vector Encoding TGFβ3 Prevents Cleft Palate in Tgfβ3-/-. Mouse Embryos. Molecular Therapy. 1, 8-17 (2013).
- Roybal, J., Endo, M., Radu, A., Zoltick, P., Flake, A. Early gestational gene transfer of IL-10 by systemic administration of lentiviral vector can prevent arthritis in a murine model. Gene Therapy. 18 (7), 719-726 (2011).
- Reay, D., et al. Full-Length Dystrophin Gene Transfer to the Mdx Mouse in utero. Gene Therapy. 15 (7), 531-536 (2008).
- Ahmed, S., Waddington, S., Boza-Morán, M., Yáñez-Muñoz, R. High-Efficiency Transduction of Spinal Cord Motor Neurons by Intrauterine Delivery of Integration-Deficient Lentiviral Vectors. Journal of Controlled Release. 273, 99-107 (2018).
- Haddad, M., Donsante, A., Zerfas, P., Kaler, S. Fetal Brain-Directed AAV Gene Therapy Results in Rapid, Robust, and Persistent Transduction of Mouse Choroid Plexus Epithelia. Molecular Therapy - Nucleic Acids. 2, 101 (2013).
- Nijagal, A., Le, T., Wegorzewska, M., MacKenzie, T. A mouse model of in utero transplantation. Journal of Visualized Experiments. (47), e2303 (2011).
- Davey, M., et al. Jaagsiekte Sheep Retrovirus Pseudotyped Lentiviral Vector-Mediated Gene Transfer to Fetal Ovine Lung. Gene Therapy. 19 (2), 201-209 (2011).
