Summary
Aquí utilizamos bioluminiscente, rayos x y emisión de positrones la tomografía/computado tomografía la proyección de imagen para estudiar cómo inhibidor mTOR actividad impactos tumores mieloma engrafted de médula ósea en un modelo de xenoinjerto. Esto permite fisiológicamente relevantes, no invasivo y multimodales análisis del efecto anti-mieloma de tratamientos contra tumores mieloma médula engrafted en vivo.
Abstract
Mieloma múltiple (MM) tumores engraft en la médula (BM) y su supervivencia y progresión dependen de complejas interacciones moleculares y celulares que existen dentro de este microambiente. Sin embargo el microambiente BM no puede ser fácilmente replicada en vitro, que potencialmente limita la relevancia fisiológica de muchos modelos experimentales in vitro y ex vivo . Estos problemas pueden ser superados mediante la utilización de un modelo de xenoinjerto en que luciferasa (LUC)-células transfected 8226 MM se engraft específicamente en el esqueleto del ratón. Cuando estos ratones se les da el sustrato apropiado, D-luciferin, los efectos del tratamiento sobre el crecimiento del tumor y la supervivencia pueden ser analizadas midiendo cambios en las imágenes bioluminiscentes (BLI) producida por los tumores in vivo. Estos datos BLI combinaron con tomografía de emisión positrónica/computacional análisis de tomografía (PET/CT) utilizando el marcador metabólico 2-deoxy - 2-(18F) fluoro-D-glucosa (18F-FDG) se utiliza para monitorizar los cambios en el metabolismo del tumor con el tiempo. Estas plataformas de proyección de imagen permiten varias mediciones no invasivas en el microambiente del tumor/BM.
Introduction
MM es una enfermedad incurable de plasma maligno de células B que infiltran el BM y causar destrucción ósea, anemia, insuficiencia renal e infección. MM hasta 10% - 15% de todas las malignidades hematológicas1 y es el cáncer más frecuente participación del esqueleto2. El desarrollo de la m proviene de la transformación oncogénica de larga vida células plasmáticas que se establezcan en los centros germinales de los tejidos linfoides antes de finalmente autoguiado hacia el blanco a la BM3. El BM se caracteriza por nichos altamente heterogéneas; como críticos y diversos componentes celulares, regiones de baja pO2 (hipoxia), extensa vascularización, complejas matrices extracelulares y redes citocinas y factor de crecimiento, todos los cuales contribuyen al tumorgenesis MM4. Así, el desarrollo de un modelo de xenoinjerto MM diseminado caracterizado por tumores que son estrictamente engrafted en el BM sería una herramienta muy potente y clínicamente relevante para el estudio de MM patología en vivo5,6. Sin embargo, numerosos obstáculos técnicos pueden limitar la efectividad de la mayoría de las modelos de xenoinjerto, haciéndolos costosos y difíciles de aplicar. Esto incluye problemas relacionados con el engraftment tumor consistente y reproducible dentro del nicho de BM, un prolongado desarrollo del tumor, y limitaciones en la capacidad de observar y medir los cambios de crecimiento del tumor/supervivencia sin tener que directamente sacrificio de ratones durante el curso del experimento7,8.
Este protocolo utiliza un modelo de xenoinjerto modificado que fue desarrollado inicialmente por Miyakawa et al. 9, en el que un desafío (IV) intravenosa con células de mieloma produce tumores que engraft consistente y reproducible en la BM de NOD/SCID/IL-2γ(null) (NOG) ratones10"diseminada". La visualización en situ de estos tumores se logra mediante la transfección estable de la línea de celular MM humano 8226 con un alelo LUC y en serie, medir los cambios en el BLI producido por estas células tumorales implantada del6. Lo importante, este modelo puede ser ampliado para utilizar varias otras LUC-expresión humana MM líneas celulares (por ejemplo, U266 y OPM2) con una propensión similar a engraft específicamente en el esqueleto de los ratones NOG. La identificación de los tumores por imágenes bioluminiscentes de los ratones es seguida por la medición de la captación de radiofármacos sondas (como la 18F-FDG) por PET/CT. juntos, esto permite la caracterización adicional de crítica bioquímico vías (es decir, alteraciones en el metabolismo, cambios en la hipoxia y la inducción de apoptosis) en el microambiente del tumor/BM. Las principales fortalezas de este modelo se pueden destacar la disponibilidad de una amplia gama de sondas radiactivos, bioluminiscentes y fluorescentes y marcadores que pueden utilizarse para estudiar la progresión MM y patología en vivo.
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Protocol
Todos los procedimientos animales que se describe a continuación fueron aprobados por el institucional cuidado Animal y el Comité uso (IACUC) de la mayor Los Angeles VA Healthcare system y se realizaron bajo condiciones estériles y libre de patógenos.
1. preparación de 8226 células expresan luciferasa (8226-LUC)
- Mantener la línea celular humana de MM, 8226, en Medio RPMI-1640 suplementado con 10% suero bovino fetal (FBS) y penicilina-estreptomicina de 1% a 37 ° C en una atmósfera humidificada que contenga 95% aire y 5% de dióxido de carbono (CO2).
- Generar células de reportero 8226 LUC-expresión estables de transferencia 1 x 106 8226 células con un vector reportero de luciferasa seguido de una selección con Higromicina (100-350 mg/mL) como ya describieron6.
- Mantener las células en condiciones estándar estéril cultivo durante 2-3 semanas, cambiando el medio día, hasta que se ha generado el establecimiento de una línea celular 8226 estable transfected.
- Confirmar la actividad de luciferasa en vitro en 1 x 106 transfectadas las células/100 μl de tampón fosfato salino (PBS) al agregar el sustrato de la luciferasa, D-luciferin (150 μg/mL solución de trabajo en medio de cultivo precalentado) y medir la bioluminiscencia de las células en un tubo de ensayo o una placa de 96 pozos utilizando un luminómetro6.
2. trasplante orthotopic del xenoinjerto modelo
- Mantener los ratones NOG (4-6 semanas edad, hombres o mujeres) bajo condiciones estériles patógeno-libre en un centro de atención animal.
- Preparar las células transfected LUC 8226 para inyección IV en los ratones NOG (~ 5 x 106 células/ratón) en el día del experimento. Lavar las células 3 x en PBS helado, contarlos y les vuelva a suspender en PBS helado (menos antibióticos y FBS) a una concentración final de 5 x 106 células/200 μL de PBS) en un tubo de ensayo estéril. Mantener las células en hielo y desafiar los ratones tan pronto como sea posible (dentro de 30-120 min).
- Anestesiar el ratón (con isoflurano, 1% - 3% en el aire a 0.5 - 1 L/min) y coloque el animal en una posición supina sobre una almohada con la cabeza hacia fuera. Compruebe el nivel de anestesia pellizcando el dedo del pie. Aplicar pomada oftálmica en los ojos.
- Inyectar las células LUC 8226 en los ratones a través de la vena de la cola (200 μL/inyección) usando una jeringa de insulina de 1 mL y una aguja de 26 G.
Nota: Puede utilizarse una lámpara de calor para calentar la cola, de tal modo dilatación de la vena y aumentando la eficacia de las inyecciones. - Regresar el animal a su jaula casera y vigilar los animales hasta que han recuperado plenamente.
- Confirmar el engraftment de células 8226-LUC en el esqueleto del ratón midiendo el BLI en ratones anestesiados (se describe a continuación y se muestra en la figura 1A).
Nota: Exudados del BM también pueden manchados para la expresión de CD45 humano mediante citometría de flujo (figura 1B) o por inmunohistoquímica del hueso cosechado (figura 1).
3. medición de BLI en Vivo
Nota: Típicamente, BLI medible de engrafted tumores en ratones se observa primero entre 10-20 días postchallenge, pero esto puede necesitar ser determinado experimentalmente.
- Anestesiar el ratón (con isoflurano, 1% - 3% en el aire a 0.5 - 1 L/min) y controlar el nivel de anestesia pellizcando el dedo del pie. Aplicar ungüento oftálmico en sus ojos.
- Dar al animal una inyección de IP (200 μL/inyección) de "en vivo-grado" sustrato D luciferin (30 mg/mL diluido en solución salina estéril).
- Medir el BLI en 5-10 min, después de la inyección del sustrato luciferin (aunque la actividad BLI puede ser observable en los ratones hasta 45-60 minutos), colocando el animal anestesiado en posición supina en un sistema de proyección de imagen de pequeños animales (figura 2 ). Seleccione luminiscente y análisis de la radiografía y adquisición de imágenes (figura 3).
- Medir la luminosidad media (/steradian fotones/s/cm2) en las regiones de interés (ROIs) utilizando el software de proyección de imagen (figura 4).
- Devolver el animal a su jaula casera y vigilar hasta que haya recuperado completamente (aproximadamente 15-20 min).
4. tratamiento de los ratones con terapia dirigida
- Medir la línea base BLI y aleatorizar los animales en grupos de tratamiento (4-8 ratones/grupo).
- Tratar a los ratones con una inyección de IP (200 μL/inyección) de temsirolimus (0.2 - 40 mg/kg ratón) utilizando un régimen de cinco inyecciones diarias de IP seguido de 2 días de descanso y una inyecciones diarias cinco adicional11.
- Medir la actividad de luciferasa (/steradian fotones/s/cm2) 2 x por semana tal como se describe en la sección 3 y trama el cambio de la BLI en el tiempo. Cambios en tumor BLI puede presentarse como imágenes seriales de los ratones (figura 5B).
Nota: Se recomienda que seguimiento diario de los animales se realizará hasta que presentan los siguientes síntomas (normalmente dentro de 45-60 días del reto inicial): peso (pérdida de más del 10% en relación con el peso antes de la implantación) o posteriores parálisis de miembro, momento en el cual debe sacrificados utilizando una cámara de CO2 seguida por dislocación cervical.
5. PET/CT análisis usando 18F-FDG para medir cambios en el metabolismo del Tumor
- Rápidamente los animales en su jaula casa quitando sus alimentos durante 24 h antes del experimento para evitar la excesiva absorción no específica de 18F-FDG.
- Preparar 18sondas PET FDG radiactiva F (50-100 μCi/inyección de solución salina estéril) en el día del experimento. Registrar el tiempo y la actividad de la sonda de 18F-FDG con un calibrador de dosis.
Nota: 18F tiene una vida media relativamente corta (~ 2 h), una esmerada preparación y planificación para el uso de estas sondas deben ser establecidas. - Anestesiar al animal (con isoflurano, 1% - 3% en el aire a 0.5 - 1 L/min) y coloque en una posición supina sobre una almohada con la cabeza hacia fuera. Compruebe el nivel de anestesia pellizcando el dedo del pie. Aplicar ungüento oftálmico en sus ojos.
- Inyectar la sonda a través de la vena de la cola (100 μl/inyección) usando una jeringa de insulina 1 mL blindado y una aguja de 26 G.
Nota: Puede utilizarse una lámpara de calor para calentar la cola, de tal modo dilatación de la vena y aumentando la eficacia de las inyecciones. - Mida la radiactividad residual en la aguja y jeringuilla en un calibrador de dosis y tenga en cuenta la actividad y el tiempo.
Nota: La estandarización de la incubación de ratón, la dosis y el tiempo es esencial para asegurar la comparabilidad y reproducibilidad de los datos. - Mantener los ratones bajo anestesia y a 37 ° C utilizando una almohadilla de calefacción durante todo el período de absorción de la punta de prueba (~ 45-90 min).
Nota: Es importante que los ratones permanezcan quietos y a 37 ° C para evitar la absorción inespecífica de la sonda. - Alterne las inyecciones de la sonda de 18F-FDG a ocurrir a intervalos de aproximadamente 20 - 30 min para veces Etiquetadoras similares en los ratones.
Nota: Flujo de trabajo adecuado y el momento de las inyecciones sonda dará lugar a condiciones de proyección de imagen óptima y reproducibles. - Medir la actividad de 18F-FDG en un sistema imagen de PET/CT de pequeños animales en las regiones de interés que corresponden a los tumores implantados (figura 6).
Nota: Inicialmente, se recomiendan una exposición estática de PET de 10 minutos y una exposición de CT de 2 min, pero los tiempos de exposición exacto deba determinarse experimentalmente. - Devolver los animales a sus jaulas hogar y controlarlos hasta que se recuperó completamente. Los ratones en un cuarto retorno dedicado 24 h mientras que la caries sonda a niveles de fondo de la casa.
Nota: Debido a la corta vida media de 18F, mediciones múltiples usando una punta de prueba fresca pueden hacer tan con frecuencia como 2 x por semana.
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Representative Results
En estudios piloto iniciales, las inyecciones IV de células LUC 8226 en ratones NOD/SCID no desarrollaron tumores m m BM-engrafted, aunque forman squamous MM tumores eran fácilmente (100% de éxito). En cambio, desafíos IV con 8226 células en ratones NOG generan (dentro de 15-25 días) tumores en el esqueleto (y sólo raramente formados tumores en tejidos no esqueléticos, como el hígado o bazo). Puesto que los tumores en el esqueleto no se podían confirmar visualmente examinando físicamente los animales, otros métodos debían considerarse para confirmar el engraftment acertado del tumor y la localización de los tumores en el BM (figura 1). Similar a los informes de Miyakawa et al. 9, IgG humana, producida por 8226 células, pudo detectarse en el suero de los ratones NOG impugnadas mediante ELISA (datos no mostrados), aunque estos datos sólo confirmaron engraftment y no la localización o extensión de los tumores. Proyección de imagen serial de varios animales muestra la distribución de tumores engrafted BM MM (figura 4). El BLI producida por estos engrafted tumor células puede entonces medirse en serie y no invasiva para evaluar cambios en el crecimiento del tumor y supervivencia en ratones tratados con el inhibidor de la mTOR temsirolimus (figura 5). Finalmente, análisis de la PET-TAC para la captación de 18F-FDG en los tumores se utilizó para demostrar temsirolimus mediada por cambios en el metabolismo de la glucosa y que esta correlacionado con cambios en el crecimiento del tumor (figura 6). Sin embargo, por estable transfectar 8226 células con un alelo de la luciferasa, junto con un óptico de proyección de imagen de radiografía análisis, la ubicación exacta y la distribución de los tumores de milímetros en el esqueleto del ratón podrían ser rápida y no invasiva determinadas.
Figura 1: células de confirmación del engraftment de 8226-LUC en el esqueleto del ratón. (A) NOG ratones fueron desafiados con las células 5 x 106 LUC2 8226 IV (ratón a la izquierda) o con solución salina (a la derecha del ratón). Después de 15 días, los ratones recibieron una inyección del IP del sustrato D luciferin y reflejada usando un sistema de proyección de imagen de animal pequeño. (B) los ratones fueron sacrificados, el fémur se recolectaron y se cosechó el exudado celular BM. La expresión de CD45 humano fue determinada por citometría de flujo utilizando un anticuerpo de CD45 anti humano conjugado con PE. (C) este panel muestra una inmunohistoquímica de secciones seriadas de fémur de ratón manchado de hipoxia con pimonidazole (paneles superiores) o CD45 humano (paneles inferiores) en ratones desafiados con 8226 (paneles de la derecha) o solución salina (control, paneles de la izquierda). El asterisco indica la ubicación de un vaso sanguíneo grande en secciones seriadas. La barra de escala = 100 μm. haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2: ratones anestesiados NOG con posicionamiento en el sistema de proyección de imagen antes de la medición de la BLI señal de médula ósea-engrafted tumores MM. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3: configuración de la proyección de imagen óptica y análisis de rayos x de la señal bioluminiscente recogidos de ratones NOG. Una vez los animales han sido impugnados con éxito y se ha confirmado el engraftment de tumores en el BM, los ratones pueden ser aleatorios en grupos de tratamiento. En varios momentos durante el curso del experimento, los animales pueden controlarse los cambios en el BLI. Porque el procedimiento es no invasivo, la frecuencia de monitoreo podría modificarse para reflejar el crecimiento de los tumores, así como cómo rápidamente las células cancerosas responderán a la terapia. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 4: proyección de imagen Serial de varios animales que muestra la distribución de tumores MM engrafted médula. Se identifican las regiones de interés (ROI) para cada ratón. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 5: cambios en el BLI de tumores implantados en NOG ratones durante un régimen terapéutico anti-MM. (A) este panel muestra un cambio en la luminosidad media (/ser p/s/cm2) de temsirolimus (20 mg/kg ratón)-ratones tratados NOG desafiaron IV con 5 x 106 células. Una vez que los ratones se observaron a ser positivo para tumores implantados, ellos fueron asignados al azar a diferentes grupos de tratamiento. Los ratones se les dio cinco inyecciones de IP diariamente, seguido de 2 días de descanso y, luego, un cinco inyecciones adicionales de IP de temsirolimus (las barras en el eje x indican los días de tratamiento) o de control del vehículo. En varios días, los ratones recibieron inyecciones de IP de "en vivo-grado" D-luciferin y el BLI se midió usando una plataforma de proyección de imagen óptica. Los valores representan la luminosidad media (/ser p/s/cm2) ± un intervalo de confianza del 95%. (B) parcela de Kaplan-Meier esta muestra el cambio en porcentaje de los ratones sobrevivientes con el tiempo. Ratones que habían alcanzado los criterios de punto final (es decir, una pérdida de > 10% del peso corporal o parálisis extremidades) fueron sacrificados humanitariamente. (C) este panel muestra imágenes representativas de los ratones tomadas durante los días 28, 35 y 40, que muestra cambios en la actividad LUC. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 6: Proyección de imagen Serial y cambios relativos en la captación de 18F-FDG por PET/CT. (A) este panel muestra serial proyección de imagen del mismo ratón por imágenes de bioluminiscencia (óptico de proyección de imagen/X-ray) y 18F-FDG captación por PET/CT. BLI se midió en ratones anestesiados, y la proyección de imagen PET/CT del mismo ratón se realizó 24 h después. El ratón ayunó durante la noche y el día del estudio, recibió una inyección IV de 50 μCi 18F-FDG. Los ratones fueron mantenidos bajo anestesia durante la incubación de la absorción de sonda (60 min) y, luego, se analizaron para la captación de 18F-FDG por análisis de la PET-TAC. Tumores (T1 y T2) son los indicados. H = corazón, K = riñón y B = vejiga. (B) este panel muestra los cambios relativos (en porcentaje de los tumores de control sin tratamiento) en la captación de 18F-FDG en el control de ratones (sin tratamiento) o temsirolimus (20 mg/kg ratón)-tratado de ratones (medidos a los 22, 35 y 40 días). Los datos se presentan como la media (n = 5 ratones) ± 1 D.E. haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
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Discussion
A pesar de una gran variedad de modelos de xenoinjerto preclínica de MM6,9,11,12,13, la capacidad para el estudio de las interacciones del tumor/BM en el microambiente del BM sigue siendo difícil 14. las técnicas aquí descritas permiten el engraftment rápido y reproducible de las células de tumores 8226-LUC en el esqueleto de los ratones NOG.
Los pasos críticos en este protocolo implicó el establecimiento de líneas de celulares MM expresión de luciferasa y la verificación de una expresión estable de luciferasa en vitro15. Una vez que se han establecido las líneas celulares, ratones NOG son retados por inyección IV y el engraftment de tumores al esqueleto se confirma midiendo el BLI actividad en vivo (normalmente en 10-20 días postchallenge) (figura 1A). El uso de ratones NOG es importante porque otras cepas inmunodeficientes (como NOD/SCID) normalmente no forman tumores engrafted BM. La relativamente alta tasa de éxito de la implantación (> 90%) y el intervalo corto para observar una señal positiva de BLI hace que este modelo sea ideal para un análisis longitudinal y de alto rendimiento de modalidades terapéuticas anti-MM (figura 4). Otro aspecto muy importante de este modelo es que las líneas de células m m BM-engrafted mantienen sus características morfológicas e inmunológicas de las líneas de células madre (p. ej., 8226, U266); tienen patrones de crecimiento consistente y reproducible y exhiben características de paciente enfermedades, como el aumento de niveles de paraproteína IgG humanos del suero y la formación de lesiones óseas.
La ventaja de esta estrategia es la utilización de estas técnicas de imagen potente repetidamente estudiar bioquímicos y moleculares componentes del microambiente tumoral/BM a lo largo de la progresión de la enfermedad y en respuesta a las terapias antitumorales. En este experimento encontramos que dirigidos a la actividad de mTOR en ratones con tumores mieloma engrafted BM produjo una disminución en las mediciones bioluminiscentes que podría observarse con el tiempo. Además, se encontró que los cambios en la absorción de la sonda de 18F-FDG (Figura 6B) en estos mismos tumores se correlacionaron con cambios en la señal bioluminiscente (figura 5B). Otro componente fundamental de este procedimiento es que se pueden medir múltiples variables bioquímicas dentro del tumor con el tiempo. Esto es especialmente importante porque la progresión del tumor es un proceso dinámico que se caracteriza por cambios en las características de la fisiología y el microambiente del tumor. Así, este procedimiento, debido a su naturaleza invasiva y la relativamente corta vida media de las sondas permite múltiples análisis longitudinales de los cambios en la respuesta del tumor a la terapia.
Después de dominar la técnica, las futuras aplicaciones de la técnica de presentan una gran flexibilidad. Por ejemplo, el uso de otras etiquetas bioluminiscentes o fluorescentes (p. ej., anticuerpos fluorescente etiquetados) podría también utilizarse, igual que otros 18F-labeled sondas y compuestos radiofarmacéuticos para estudiar bioquímica específica vías o procesos en el microambiente del tumor/BM. Debido a la corta vida media de muchos de estos radionucleotides, mediciones múltiples de serie podrían realizarse durante el curso de un experimento específico para el estudio de decaimiento, distribución, cinética y la absorción de drogas. Utilizando este modelo de xenoinjerto, la habilidad de MM para utilizar la glucólisis anaeróbica y otras vías metabólicas (es decir, síntesis de ácidos grasos) mediante otras puntas de prueba (e.g.,18F-fluoro-2deoxyglucose [18F-FDG] y 18 F-fluoro-4-thia-palmitate [FTP])16,17, así como la capacidad para medir los efectos antiproliferativos del tratamiento usando otro ampliamente utilizado sonda (es decir, 3'-deoxi-3'-fluorothymidine [18F] [ 18F-FLT]) pueden incluirse en los diseños experimentales. Además, es posible medir directamente la muerte celular mediante el uso de 18F-anexina B1 para medir apoptosis en vivo18. Muchos de estos compuestos están comercialmente disponibles.
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Disclosures
El autor Kevin Francis es un empleado de Perkin-Elmer.
Acknowledgments
Este trabajo fue apoyado por un grant1I01BX001532 de mérito VA desde los Estados Unidos Departamento de los veteranos asuntos laboratorio investigación biomédica y desarrollo servicio (BLRDS) y P.F., C.E. reconoce apoyo de la (VA ciencia clínica R & D servicio Merecen Premio I01CX001388) y rehabilitación VA R & D servicio (mérito Premio I01RX002604). Más apoyo vino de una donación de semillas Facultad de UCLA a J.K. Estos contenidos no representan necesariamente las opiniones de la nos Department of Veterans Affairs o el gobierno.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 8226 human myeloma cell line | ATCC | CCL-155 | |
| NOD.Cg-Prkdcscid Il2rgtm1Wjl/SzJ Mice (NOG) | Jackson Labs | 5557 | |
| VivoGlo Luciferin substrate | Promega | P1041 | |
| Hypoxyprobe-1Kit | HPL | HP1-100 | |
| PE-CD45 (clone H130) | BD Biosciences | 555483 | Used for flow cytometry to identify human CD45+ tumor cells in BM exudate |
| rabbit anti-human CD45 (clone D3F8Q) | Cell Signaling Technology | 70527 | Primary antibody used for Immunohistochemistry of excised bone |
| Goat Anti-rabbit IgG (HRP conjugated) | ABCAM | ab205718 | Seconday antibody used for Immunohistochemistry of excised bone |
| Dual-Luciferase Reporter Assay System | Promega | E1910 | |
| pGL4.5 Luciferase Reporter Vector | Promega | E1310 | |
| IVIS Lumina XRMS In Vivo Imaging System | Perkin Elmer | ||
| Sofie G8 PET/CT Imaging System | Perkin Elmer |
References
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