Summary
एक आयनों एक्सचेंज राल आधारित विधि, तरल भिडंत के लिए अनुकूलित-आधारित वायरस के एयरोसोल नमूना प्रदर्शित किया जाता है । बहाव आणविक पता लगाने के साथ युग्मित करते हैं, विधि सतही और संवेदनशील एयरोसोल्स से वायरस का पता लगाने के लिए अनुमति देता है ।
Abstract
इस प्रोटोकॉल वायरस के लिए एक स्वनिर्धारित एयरोसोल नमूना विधि दर्शाता है । इस प्रणाली में, आयनों एक्सचेंज राल तरल भिडंत के साथ युग्मित है-आधारित हवा नमूना उपकरणों के प्रभावोत्पादक एकाग्रता के लिए नकारात्मक-एयरोसोल्स से आरोप लगाया वायरस । इस प्रकार, राल में एक अतिरिक्त एकाग्रता कदम के रूप में कार्य करता है एयरोसोल नमूना कार्यप्रवाह. वायरल कणों की न्यूक्लिक एसिड निष्कर्षण तो आयनों एक्सचेंज राल से सीधे किया जाता है, जिसके परिणामस्वरूप नमूना आणविक विश्लेषण के लिए उपयुक्त के साथ. इसके अलावा, इस प्रोटोकॉल का वर्णन एक कस्टम निर्मित एयरोसोल पर्यावरण की स्थिति की एक किस्म के तहत वायरस से लदी एयरोसोल पैदा करने में सक्षम है और ऐसे तापमान, आर्द्रता के रूप में पर्यावरण चर की सतत निगरानी के लिए अनुमति हवा की गति, और एयरोसोल जन एकाग्रता । इस प्रोटोकॉल का उपयोग करने का मुख्य लाभ वायरल का पता लगाने की संवेदनशीलता बढ़ जाती है, के रूप में एक unmodified पारंपरिक तरल pinger के लिए प्रत्यक्ष तुलना के द्वारा मूल्यांकन । अंय लाभ के लिए विभिंन नकारात्मक-वायरस का आरोप लगाया, आयनों विनिमय राल की कम लागत (~ नमूना प्रति $०.१४), और उपयोग में आसानी ध्यान देने की क्षमता शामिल हैं । नुकसान इस प्रोटोकॉल की अक्षमता को राल के infectivity-adsorbed वायरल कणों का आकलन शामिल है, और संभावित तरल नमूना के अनुकूलन के लिए की जरूरत है unpinger के भीतर इस्तेमाल बफर ।
Introduction
इस विधि के प्रयोजन के लिए एक अति संवेदनशील एयरोसोल नमूना मंच प्रदान करने के लिए एक गैर-एयरोसोल्स से नकारात्मक आरोप लगाया वायरस का आणविक पता लगाने की सुविधा है । सूक्ष्मजीवों, वायरल कणों सहित, समय की विस्तारित अवधि के लिए1में जीवित रह सकते हैं । एयरोसोल अपेक्षाकृत लंबी दूरी पर यात्रा कर सकते है और व्यवहार्यता और infectivity बनाए रखने, के रूप में ' Legionnaires रोग है कि औद्योगिक ठंडा प्रभावित व्यक्तियों से 6 किमी की दूरी पर स्थित टावरों से उत्पंन के प्रकोप का सबूत है और परिणामस्वरूप 18 मौत2. मानव के लिए वायरस के अप्रत्यक्ष संचरण के लिए एक से अधिक की मध्यस्थता कर सकते हैं और कई सेटिंग्स में हो सकता है और स्कूलों और रेस्तरां में नोरोवायरस प्रकोपों के लिए प्रदर्शन किया गया है3,4. इसी प्रकार, विषाणुओं के एयरोसोल संचरण में ऐसी सूअर और पोल्ट्री फार्मों के रूप में कृषि सेटिंग्स में हो सकता है, इस संचरण मार्ग के साथ उत्पादन सुविधाओं के बीच वायरस की आवाजाही में एक प्रमुख कारक के रूप में माना जा रहा है5, 6 , 7 , 8 , 9.
वायरस से लदी एयरोसोल का प्रभावी नमूना तेजी से निदान और प्रकोप की रोकथाम के लिए तैयारियों में सुधार के लिए अनुमति देता है, के रूप में प्रदर्शनों में दिखाया जिसमें H5 इंफ्लूएंजा एक वायरस चीन में रहते पशु बाजारों में और एयरोसोल्स से पता लगाया गया संयुक्त राज्य अमेरिका10,11। मौजूदा एयरोसोल नमूना प्रौद्योगिकियों विभिंन कण पर कब्जा सिद्धांतों की एक संख्या शामिल है, और मोटे तौर पर, और चक्रवात, प्रभाव, और फिल्टर12में वर्गीकृत किया जा सकता है । यह इस प्रोटोकॉल के दायरे से बाहर है exhaustively सभी लाभों और इन प्लेटफार्मों के नुकसान के लिए एक एयरोसोल से वायरस के नमूने कवर; हालांकि, यह कहा जा सकता है कि इन नमूना उपकरणों के बहुमत वायरस और bacteriophages13के संग्रह के लिए अनुकूलित नहीं किया गया है । इसके अलावा, वायरल कणों की infectivity अक्सर नकारात्मक प्रभावित होता है, तरल के साथ वायरल infectivity को बनाए रखने के लिए माना जाता है और अधिक प्रभावी ढंग से ठोस प्रभाव या14फिल्टर के रूप में नमूने उपकरणों से । हालांकि, तरल भिडंत का एक नुकसान लक्ष्य कमजोर पड़ने प्रभाव है, जो होता है क्योंकि वायरस अपेक्षाकृत बड़ी मात्रा में एकत्र कर रहे हैं (आमतौर पर ≥ 20 एमएल) तरल के संग्रह पोत में. एक अंय महत्वपूर्ण नुकसान तरल pingers की उपइष्टतम क्षमता शामिल है कणों ध्यान केंद्रित करने के लिए < 0.5 µ m आकार15में । हालांकि, इन उपकरणों की दक्षता कैप्चर ठोस मैट्रिक्स पर स्थिरीकरण द्वारा सुधार किया जा सकता है, के रूप में स्थिरीकरण वायरल न्यूक्लिक एसिड और वायरल infectivity16,17के संरक्षण में वृद्धि कर सकते हैं ।
हम पहले से प्रदर्शित किया है कि आयनों एक्सचेंज राल कब्जा और तरल मैट्रिक्स से वायरस की एकाग्रता के लिए एक प्रभावी उपकरण है, जिसमें F-आरएनए bacteriophages, हेपेटाइटिस ए वायरस, मानव एडीनोवायरस, और रोटावायरस18,19 ,20. के रूप में निर्माता द्वारा परिभाषित, आयनों विनिमय राल इस काम में उपयोग एक macroreticular polystyrene मजबूत आधार आयनों विनिमय राल जिसमें कार्यात्मक चतुर्धातुक अमीन समूह मध्यस्थता आकर्षण और एक तरल मध्यम में ॠणायन का कब्जा21 . नतीजतन, आयनों एक्सचेंज राल के साथ वायरस पर कब्जा करने की उंमीद है नेट नकारात्मक सतह शुल्क, सहित कई प्रवेश वायरस, इंफ्लूएंजा वायरस और अंय सार्वजनिक और पशु स्वास्थ्य के लिए प्रासंगिक वायरस ।
वर्तमान प्रोटोकॉल एक तरल pinger के लिए आयनों विनिमय राल के अलावा शामिल है । इस प्रणाली में, राल वायरल के लिए एक द्वितीयक एकाग्रता कदम के रूप में कार्य करता है pinger तरल में कब्जा कर लिया कणों । न्यूक्लिक एसिड तो सीधे छोटी मात्रा में eluted, आणविक विश्लेषण के लिए एक केंद्रित नमूना प्रदान कर सकते हैं । इस प्रकार, इस विधि का मुख्य लाभ वायरल का पता लगाने संवेदनशीलता में सुधार है, मुख्य रूप से नमूना मात्रा में कमी के माध्यम से. इसके अतिरिक्त, नकारात्मक-आरोपित वायरस के अंतर्निहित गैर-विशिष्ट कैप्चर के कारण, विधि ब्याज के वायरस की एक बड़ी संख्या का पता लगाने के लिए लागू होने की संभावना है । यहां, विधि प्रकार एक और प्रकार बी इंफ्लूएंजा वायरस और FRNA coliphage MS2 (MS2) के टीके उपभेदों के लिए प्रदर्शन किया है । इन वायरस बाद में पहले वर्णित के रूप में22मानक qRT-पीसीआर परख का उपयोग कर पता चला रहे हैं । अंत बिंदु उपयोगकर्ता इस पद्धति के प्रदर्शन में कठिनाइयों का सामना करने की उंमीद नहीं करनी चाहिए, क्योंकि वर्तमान में मौजूदा उपकरणों के संशोधनों के लिए एक एयरोसोल नमूना और विश्लेषण के पारंपरिक प्रवाह के लिए प्रमुख व्यवधान का गठन नहीं है ।
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Protocol
1. एयरोसोल चैंबर के सेटअप ( चित्रा 2देखें)
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पूर्व लोड ०.०१ एम फॉस्फेट के 20 मिलीलीटर के साथ तरल pings बफर खारा, पीएच ७.५ (पंजाब) ।
- जोड़ें ०.५ आयनों एक्सचेंज राल के जी और एक तरल pingers के पंजाब के भीतर निलंबित, एक और तरल एक नियंत्रण के रूप में सेवारत pinger के साथ ।
- स्थान के समानांतर में तरल pingers के अंदर unएयरोसोल कक्ष दबाना का उपयोग कर एयरोसोल के साथ खड़ा छिटकानेवाला का सामना करना पड़ रहा है ।
नोट: अतिरिक्त विवरण के लिए चित्र 2 देखें । - Co-तरल pingers के पास एक सीधा-पढ़ें एयरोसोल मॉनिटर को मापने के लिए जन एकाग्रता (mg//
- सह अतिरिक्त प्रत्यक्ष-पढ़ें इंस्ट्रूमेंटेशन (इनडोर वायु गुणवत्ता मॉनीटर और थर्मल मीटर) तरल pingers के पास जैसे तापमान, सापेक्षिक आर्द्रता और हवा की गति के रूप में पर्यावरण चर, पर नजर रखने के लिए, के भीतर एयरोसोल चैंबर ।
- एयरोसोल के मिश्रण की सुविधा के लिए एयरोसोल चैंबर के कोनों में अक्षीय प्रशंसकों भागो ।
नोट: अक्षीय प्रशंसक एक निश्चित गति से चलाने के लिए और समायोज्य नहीं कर रहे हैं ।
2. मॉडल Bioaerosolization प्रयोगों (देखें चित्रा 3)
- धारावाहिक प्रदर्शन, 10-MS2 भोजी और इंफ्लूएंजा वैक्सीन फॉस्फेट में वांछित सांद्रता के लिए के कमजोर पड़ने-बफर खारा (पंजाब) ।
नोट: विधि यहां प्रदर्शित करने के लिए, 10३.५ FFU/एमएल के प्रकार ए और बी इंफ्लूएंजा वायरस वैक्सीन उपभेदों और 105 PFU/एमएल MS2 भोजी का उपयोग कर रहे हैं । inocula के लिए titers का निर्धारण करने के लिए, bacteriophages ई कोलाई HS (pFamp) R में प्रचारित किए जाते हैं और पहले वर्णित20के रूप में गणना की । वाणिज्यिक टीका चार जीना तनु इंफ्लूएंजा वायरस उपभेदों, दो प्रकार एक इंफ्लूएंजा वायरस और दो प्रकार बी इंफ्लूएंजा वायरस, फ्लोरोसेंट फोकस इकाइयों या FFU में व्यक्त की मात्रा में शामिल हैं । - पंजाब के १०० मिलीलीटर में वायरल कणों की वांछित सांद्रता के निलंबन बनाने के द्वारा एक 6-जेट टकराव छिटकानेवाला के कांच पोत के भीतर inocula तैयार करने और कस्टम एयरोसोल चैंबर के भीतर स्थापित करें ।
- इस तरह के तापमान के रूप में,% सापेक्ष आर्द्रता, कार्बन डाइऑक्साइड एकाग्रता, और हवा की गति (एक अक्षीय प्रशंसक का उपयोग कर उत्पंन) एयरोसोल चैंबर के भीतर चर मापने के लिए इंस्ट्रूमेंटेशन आरंभ करें । एक सीधे का प्रयोग करें-एयरोसोल मॉनिटर को बायोमास चैंबर के भीतर जन एकाग्रता ट्रैक और भीतर और परीक्षणों के बीच निरंतरता स्थापित करने के लिए पढ़ें ।
- सील एयरोसोल चैंबर और HEPA-फ़िल्टर हवा के साथ 10 मिनट के लिए शुद्ध करना ।
- फ़िल्टर उद्धार, ६.९ केपीए पर छिटकानेवाला संचालन के लिए हवा सूख ।
- प्रत्येक एक एयरोसोल चैंबर परीक्षण में वायरल (छिटकानेवाला के माध्यम से) एयरोसोल्स के लक्ष्य एकाग्रता उत्पंन करते हैं । इस प्रदर्शन के लिए, 5 मिलीग्राम/एम3 की एकाग्रता के साथ एक एयरोसोल उत्पन्न कर रहे हैं ।
- एक बार एयरोसोल का लक्ष्य जन एकाग्रता तक पहुंच गया है, nebulization बंद करो ।
- प्रत्येक तरल pinger के लिए एक हवा नमूना पंप संचालित है कि १२.५ की एक प्रवाह दर करने पर तुले हुए है एल/मिनट आचरण अंशांकन से पहले और प्रत्येक नमूना घटना के बाद नमूना मात्रा में निरंतरता सुनिश्चित करने के लिए एक प्राथमिक प्रवाह मानक का उपयोग कर । आपूर्ति कमजोर पड़ने एक HEPA-फ़िल्टर छिटकानेवाला के पास स्थित लाइन का उपयोग हवा और बनाए रखने के चैंबर में लगातार दबाव ।
- सक्रिय रूप से नमूना प्रति ५०० एल की एक नमूना मात्रा को प्राप्त करने के लिए ४० मिनट की अवधि के लिए एयरोसोल चैंबर वातावरण नमूना.
नोट: ४० मिनट के लिए नमूने के साथ १२.५ l/समानांतर में दो पंपों के साथ १,००० l एयरोसोल के नमूने के लिए अनुमति देता है. इस प्रकार, प्रयोग के पूरा होने पर, यह उंमीद है कि वायु एयरोसोल चैंबर में वर्तमान के बहुमत का नमूना लिया गया है और एक HEPA-फ़िल्टर प्रणाली के माध्यम से पर्यावरण में जारी की । यह कण एकाग्रता में कमी का सबूत है । बाद प्रयोग, सतहों 10% घरेलू ब्लीच और ७०% इथेनॉल के साथ दूषित कर रहे हैं । संकेतक इस प्रदर्शन में उपयोग किया जाता है; हालांकि, यदि ज्ञात रोगजनक जीवों इस प्रणाली में इस्तेमाल किया जाता है, अतिरिक्त सुरक्षा उपायों की जरूरत के रूप में लागू किया जा सकता है ।
3. न्यूक्लिक एसिड निष्कर्षण और qRT-पीसीआर का पता लगाने
-
अलग न्यूक्लिक एसिड सीधे आयनों एक्सचेंज राल से और, तुलनात्मक प्रयोजनों के लिए, तरल pingers के भीतर इस्तेमाल तरल से । इस उदाहरण में, एक आरएनए आइसोलेशन प्रक्रिया का वर्णन किया गया है, लेकिन एक समान प्रोटोकॉल डीएनए वायरस के लिए उपयोग किया जा सकता है ।
- आयनों एक्सचेंज राल से न्यूक्लिक एसिड अलगाव ।
- एक बाँझ ५० एमएल शंकु ट्यूब करने के लिए तरल pinger के आयनों विनिमय राल युक्त तरल के सभी स्थानांतरण ।
- बसने के लिए राल की अनुमति दें, और धीरे आयनों एक्सचेंज राल से तरल नमूना नहीं कर सकते । आयनों विनिमय राल से शेष तरल के सभी को दूर करने के लिए एक 1 मिलीलीटर पिपेट टिप का उपयोग करें ।
- एक वायरल आरएनए अलगाव किट से, आयनों एक्सचेंज राल के लिए सीधे वायरल lysis बफर युक्त वाहक आरएनए के ५६० µ एल जोड़ें और आवधिक मिश्रण के साथ कमरे के तापमान पर 10 मिनट के लिए मशीन ।
- एक 1 मिलीलीटर पिपेट टिप का उपयोग करना, वायरल lysate (वायरल lysis बफर) एक बाँझ १.५ मिलीलीटर शंकु ट्यूब को हस्तांतरण और एक वायरल आरएनए अलगाव किट का उपयोग कर आरएनए अलगाव के साथ आगे बढ़ना ( सामग्री की तालिकादेखें) निर्माता के निर्देशों के अनुसार, सिवाय वह आरएनए eluted ६० µ एल के रेफरेंस बफर की कुल मात्रा में है.
- तरल pingers से न्यूक्लिक एसिड अलगाव ।
- पिपेट १४० µ एल एक बाँझ १.५ मिलीलीटर शंकु ट्यूब में तरल नमूना और आरएनए अलगाव के अनुसार वायरल आरएनए आइसोलेशन किट का उपयोग करते हुए निर्माता के निर्देश के साथ, eluting आरएनए के अपवाद के साथ ६० µ एल की कुल मात्रा में रेफरेंस बफर की.
नोट: १४० µ एल अधिकतम नमूना मात्रा है कि विशिष्ट वायरल आरएनए अलगाव एक एकल कदम की तैयारी में यहां कार्यरत किट के साथ संसाधित किया जा सकता है ।
- पिपेट १४० µ एल एक बाँझ १.५ मिलीलीटर शंकु ट्यूब में तरल नमूना और आरएनए अलगाव के अनुसार वायरल आरएनए आइसोलेशन किट का उपयोग करते हुए निर्माता के निर्देश के साथ, eluting आरएनए के अपवाद के साथ ६० µ एल की कुल मात्रा में रेफरेंस बफर की.
- आयनों एक्सचेंज राल से न्यूक्लिक एसिड अलगाव ।
- प्रदर्शन qRT-MS2 और इंफ्लूएंजा ए और बी वायरस का पता लगाने के लिए पीसीआर के रूप में पहले23,24वर्णित है । इस प्रदर्शन में qRT-पीसीआर के लिए 5 µ l न्यूक्लिक एसिड eluates का उपयोग किया जाता है ।
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Representative Results
चित्रा 1 तरल आधारित pingers में राल के शामिल किए जाने के माध्यम से आरोप के पीछे सिद्धांत-एयरोसोल्स से वायरस के आधार पर कब्जा को दर्शाता है । चित्रा 2 कस्टम निर्मित एयरोसोल चैंबर के सेटअप से पता चलता है । चित्र 3 , गुणवत्ता नियंत्रण सुनिश्चित करने के लिए aerosolization प्रयोग और उपायों को सेट करने में शामिल चरणों का वर्णन करता है । चित्रा 4 qRT के लिए प्रवर्धन घटता से पता चलता है-नकारात्मक-आरोपित वायरस का पता लगाने के लिए-एयरोसोल से कब्जा कर लिया । 1 तालिका इस अध्ययन में इस्तेमाल किया उदाहरण के वायरस के लिए qRT-पीसीआर के लिए इस्तेमाल प्राइमरों और जांच से पता चलता है ।
MS2 और इंफ्लूएंजा कस्टम एयरोसोल चैंबर में मॉडलों के रूप में इंफ्लूएंजा वैक्सीन के भीतर निहित वायरस का प्रयोग, तरल आयनों एक्सचेंज राल के साथ संशोधित करने के लिए लगभग 3x के लिए अनुमति वायरल पता लगाने में 9 x सुधार के लिए, विशिष्ट पर निर्भर करता है वायरस, तरल भिडंत के प्रत्यक्ष परीक्षण की तुलना में22. के रूप में प्रतिनिधि qRT में दिखाया-पीसीआर प्रवर्धन घटता (आंकड़ा 4), प्रकार के एक इंफ्लूएंजा वायरस ३.२६ चक्र को प्राप्त किया जा सकता है जल्दी ही जब आयनों विनिमय राल की तुलना में इस्तेमाल किया गया भिडंत तरल के प्रत्यक्ष परीक्षण के लिए । यह देखते हुए कि एक qRT-पीसीआर कि १००% कुशल है, एक सीटी का लाभ एक 2-लक्ष्य एकाग्रता में वृद्धि गुना से मेल खाती है, यह अंतर पता लगाने में एक 9.58 एक्स सुधार के बराबर है ।
चित्रा 1: तरल आयनों एक्सचेंज राल के साथ मिलकर भिडंत । संशोधित एक एयरोसोल नमूना उपकरणों के प्रत्येक अपने डिजाइन में एक आयनों एक्सचेंज राल शामिल हैं । प्रत्येक राल मनका एक ०.५ के लिए १.० मिमी क्षेत्र एक छिद्रित सतह के साथ है, एक विशेषता है कि आयनों विनिमय सतह इलाके बढ़ जाती है । कार्यात्मक चतुर्धातुक अमोनियम समूहों तरल मीडिया में आयनों के कब्जे के लिए अनुमति देते हैं, नेट नकारात्मक सतह के आरोपों के साथ वायरस का कब्जा मध्यस्थता, MS2 coliphages और इंफ्लूएंजा वायरस, जो मॉडल जीवों के रूप में इस प्रोटोकॉल में उपयोग किया जाता है सहित (एक पूंछ भोजी यहां कब्जा कर लिया वायरस के लिए एक उदाहरण के रूप में तैयार की है) । न्यूक्लिक एसिड अलगाव तो राल से सीधे प्रदर्शन किया है (व्यावसायिक रूप से उपलब्ध किट का उपयोग), सबसे आणविक जांच रणनीतियों के लिए उपयुक्त नमूना (qRT-पीसीआर यहां कार्यरत) के साथ । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।
चित्रा 2: कस्टम एयरोसोल चैंबर योजनाबद्ध । a: 6-जेट छिटकानेवाला ६.९ केपीए के एक सृजन दबाव में फ़िल्टर्ड और सूखे हवा के साथ आपूर्ति की; बी: वर्दी bioaaerosol मिश्रण की सुविधा के लिए अक्षीय प्रशंसकों; सी: एयरोसोल मॉनिटर रिश्तेदार एयरोसोल सांद्रता की पहचान करने के लिए; डी: राल के साथ तरल pinger; ई: राल के बिना तरल pinger; एफ: थर्मल मीटर हवा की गति को मापने के लिए; जी: वायु गुणवत्ता मॉनिटर तापमान, कार्बन डाइऑक्साइड, और प्रतिशत सापेक्ष आर्द्रता सहित अन्य पर्यावरणीय चर को मापने के लिए; एच: सक्रिय नमूना पंपों १२.५ एल के लिए तुले/ मैं:-एयरोसोल कक्ष के भीतर नमूना उपकरण स्थिति के लिए वायवीय सील दस्ताने बंदरगाहों; जंमू: प्रेक्षण खिड़की । यह आरेख publisher22से अनुमति के साथ पिछले कार्य से उपयोग किया गया था । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।
चित्रा 3: bioaerosolization प्रयोग के कार्यप्रवाह । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।
चित्रा 4: आयनों एक्सचेंज राल में सुधार qRT-पीसीआर आधारित एयरोसोल्स में नकारात्मक-आरोप लगाया वायरस का पता लगाने । इस उदाहरण में, प्रकार एक इनोक्युलम एकाग्रता में इंफ्लूएंजा वायरस 10३.५ FFU/एमएल एयरोसोल जन एकाग्रता तक पहुंचा कस्टम बायोमास चैंबर में एयरोसोल थे 5 mg/एम3। साथ और राल के बिना तरल pingers एक साथ एक नमूना (५०० एल) के लिए लगे थे । वायरल आरएनए आयनों एक्सचेंज राल से या pinger के तरल से प्राप्त किया गया था और qRT-पीसीआर द्वारा परख । प्रयोग तपसिल में दोहराया गया । न्यूक्लिक एसिड राल नमूनों से प्राप्त २६.७६ के एक औसत सीटी पर पाया गया, जबकि pinger तरल नमूने ३०.०२ (३.२६ के ΔCt) के एक औसत सीटी में पाए गए । सीटी में यह अंतर आयनों एक्सचेंज राल का उपयोग कर पता लगाने में एक 9.58 एक्स सुधार के बराबर है । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।
| वायरस | प्राइमरी का नाम | प्राइमरी सीक्वेंस | संदर्भ | |
| MS2 | सैनिक Fwd | 5 '-ATCCATTTTGGTAACGCCG-3 ' | 23 | |
| सैनिक जांच | 5 '-(6-FAM)-TAGGCATCTACGGGGACGA-(BBQ)-3 ' | |||
| सैनिक रेव | 5 '-TGCAATCTCACTGGGACATAT-3 ' | |||
| आईएस Fwd (46F) | 5 '-GACATCGATATGGGTGCCG-3 ' | |||
| आईएस जांच | 5 '-(Cy5)-CACATTCACCAGGGAGACGCATGAGA-(BBQ)-3 ' | |||
| आईएस रेव (186R) | 5 '-CGAGACGATGCAGCCATTC-3 ' | |||
| प्रकार एक इंफ्लूएंजा वायरस | सीडीसी यूनिवर्सल इंफ्लूएंजा एक वायरस आगे प्राइमर | 5 '-GAC सीआरए टीसीसी टीजीटी CAC सीटीसी TGA सी-3 ' | 24 | |
| सीडीसी यूनिवर्सल इंफ्लूएंजा एक वायरस रिवर्स प्राइमर | ५ '-AGG जीसीए TTY TGG ऐका AAK CGT CTA-३ ' | |||
| सीडीसी यूनिवर्सल इंफ्लूएंजा एक वायरस की जांच | 5 '-(FAM)-TGC AGT CCT CGC टीसीए CTG GGC ACG-(BHQ1)-3 ' | |||
| प्रकार बी इंफ्लूएंजा वायरस | सीडीसी यूनिवर्सल इंफ्लूएंजा बी वायरस आगे प्राइमर | 5 '-TCCTCAACTCACTCTTCGAGCG-3 ' | 24 | |
| सीडीसी यूनिवर्सल इंफ्लूएंजा बी वायरस रिवर्स प्राइमर | 5 '-CGGTGCTCTTGACCAAATTGG-3 ' | |||
| सीडीसी यूनिवर्सल इंफ्लूएंजा बी वायरस जांच | 5 '-(जो)-CCAATTCGAGCAGCTGAAACTGCGGTG-(BHQ1)-3 ' | |||
तालिका 1: इस अध्ययन में प्रयुक्त प्राइमरों और जांच । सभी प्राइमरों और जांच Friedman एट अल २०११23 और Selvaraju और Selvarangan २०१०24से थे ।
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Discussion
इस प्रोटोकॉल को संशोधित तरल pingers का उपयोग कर एयरोसोल्स से संवेदनशील वायरल पर कब्जा करने के लिए एक विधि रूपरेखा । विधि का पता लगाने और ठहराव में वायरल लोड के लिए अनुकूलित है । विशिष्ट संशोधन यहां का प्रदर्शन किया आयनों एक्सचेंज राल के अलावा एक आम तरल pinger के भीतर समाहित तरल शामिल है । इस विधि के बहाव नमूना प्रसंस्करण में अपनी सादगी के लिए विकसित किया गया था, जबकि अन्य नमूना प्रसंस्करण तकनीक जैसे कि केंद्रापसारक, निस्पंदन, और वर्षण-आधारित विधियों इस तरह के एक लाभ प्रदान नहीं करते । न्यूक्लिक एसिड का निष्कर्षण सीधे राल से किया जाता है, obviating उच्च मात्रा elutions और कई नमूना तैयारी चरणों के लिए की जरूरत है, अंततः प्रभावी नमूना में कमी के माध्यम से विधि का पता लगाने संवेदनशीलता में सुधार करने के लिए योगदान वॉल्यूम. इसके अलावा, यह ठोस सतहों पर वायरल कणों के स्थिरीकरण वायरल न्यूक्लिक एसिड या वायरल infectivity17,25की अवधारण की वृद्धि की स्थिरता के लिए योगदान कर सकते है कि दिखाया गया है । स्थिरीकरण16reaerosolization के कारण नुकसान को कम करने के द्वारा कब्जा दक्षता बढ़ाने में योगदान कर सकते हैं । विधि आसानी से बहाव आणविक विश्लेषण के साथ युग्मित किया जा सकता है (qRT-पीसीआर यहां प्रदर्शित) । आयनों विनिमय राल क्षेत्र हो सकता है और निकाले विश्लेषण के लिए एक संदर्भ प्रयोगशाला में भेज दिया, जबकि हवा नमूना उपकरण नमूना क्षेत्र में निगरानी के लिए समर्पित रह सकते हैं । प्रक्रिया के पीछे सिद्धांत के रूप में एक शुद्ध-नकारात्मक सतह प्रभारी ले जाने वाले वायरस के गैर-विशिष्ट कब्जा शामिल है, विधि मानव स्वास्थ्य और पशु चिकित्सा के लिए महत्व के कई रोगजनक वायरस का पता लगाने के लिए उत्तरदायी होने की उम्मीद है. के रूप में Michen और26कॉल द्वारा की समीक्षा की, सार्वजनिक और पशु स्वास्थ्य के लिए महत्वपूर्ण वायरस की एक बड़ी संख्या में शुद्ध नकारात्मक सतह शुल्क है, कुछ ज्ञात अपवादों के साथ, जैसे rotaviruses और polioviruses के कुछ उपभेदों ।
इस प्रोटोकॉल का पता लगाने की संवेदनशीलता पर पर्यावरणीय परिस्थितियों के प्रभाव का सीधे मूल्यांकन नहीं करता है; हालांकि, जब हवा नमूना क्षेत्र सेटिंग्स में आयोजित किया जाता है, यह कल्पना है कि इस तरह के सापेक्ष आर्द्रता और तापमान के रूप में चर हवा नमूना12के कई प्रकार के पार संग्रह क्षमता को प्रभावित कर सकता है । इस प्रकार, एयरोसोल चैंबर के भीतर की स्थिति के रूप में इन पर्यावरणीय मापदंडों के अनुरूप संशोधित किया जा सकता है की जरूरत है । आयनों एक्सचेंज राल विधि को प्रभावी ढंग से भौतिक गुणों की एक विस्तृत श्रृंखला के साथ पानी के नमूनों से कई वायरस ध्यान केंद्रित दिखाया गया है, का संकेत है कि बात कण, बैक्टीरिया से हस्तक्षेप, और अंय पर्यावरणीय संदूषण18ंयूनतम होने की उंमीद है । साथ ही, संग्रह बफ़र्स अनुकूलन विशिष्ट वायरस, के रूप में कुछ मामलों में यह दिखाया गया है कि संग्रह बफ़र ऑप्टिमाइज़िंग वायरल स्थिरता का सुधार अवधारण करने के लिए लीड कर सकते है की आवश्यकता हो सकती27। प्रस्तुत के रूप में विधि का एक मुख्य नुकसान तथ्य यह है कि यह वायरल infectivity निर्धारित नहीं कर सकता है । इस प्रोटोकॉल का एक और नुकसान nebulization और हवा सुखाना, बाल काटना सहित वायरल स्थिरता पर नमूना, और गैर एयरोसोल चैंबर22सतहों के लिए विशिष्ट सोखना के संभावित नकारात्मक प्रभाव का आकलन करने में असमर्थता है ।
संशोधित एयरोसोल नमूने उपकरणों क्षेत्र के लिए उत्तरदायी हो सकता है आधारित कई सेटिंग्स में नमूना, अस्पतालों, स्कूलों, कृषि संचालन, और अन्य स्थानों सहित. क्योंकि संशोधनों के मौजूदा हवा नमूना उपकरण के लिए बना रहे हैं, यह उंमीद है संशोधित उपकरणों के ऑपरेटरों द्वारा आसानी से अपनाने होगा वर्तमान में वायरस के लिए एयरोसोल नमूने । प्रोटोकॉल यहां एक कस्टम में प्रदर्शन किया है, MS2 और इंफ्लूएंजा वायरस है, जो इस तथ्य के कारण है कि वे गैर के उदाहरण का प्रतिनिधित्व करते है और लिफाफा वायरस, MS2 एक के रूप में मांयता प्राप्त है की वजह से विकास के लिए उपयोगी लक्ष्य है एयरोसोल का उपयोग कर चैंबर बनाया प्रवेश वायरस के किराए और सामांयतः22,26,27,28,29के मूल्यांकन में कार्यरत हैं ।
भविष्य के काम नमूना शर्तों (यानी, हवा नमूना वेग, संग्रह बफ़र्स) और अतिरिक्त प्रासंगिक वायरस के परीक्षण प्रोटोकॉल में शामिल किए जाने का अनुकूलन शामिल होंगे ।
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Disclosures
लेखकों का खुलासा करने के लिए कुछ नहीं है ।
Acknowledgments
यह काम सीडीसी/NIOSH उच्च मैदानी कृषि स्वास्थ्य और सुरक्षा (5U54OH008085) और कोलोराडो विज्ञान डिस्कवरी मूल्यांकन अनुदान कार्यक्रम (14BGF-16) के लिए केंद्र से धन द्वारा समर्थित किया गया था ।
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Escherichia coli bacteriophage MS2 (ATCC 15597-B1) | American Type Culture Collection | ATCC 15597-B1 | |
| FluMist Quadrivalent | AstraZeneca | Contact manufacturer | Viral constitutents of this vaccine are subject to change on an annual basis |
| CFX96 Touch Real-Time PCR Detection System | Bio-Rad | 1855195 | |
| Primers and probes | Integrated DNA Technologies | NA | |
| 0.2 µM sterile filter | NA | NA | |
| 1 L pyrex bottles or equivalent | NA | NA | |
| 1 mL pipet tips | NA | NA | |
| 1 mL pipettor | NA | NA | |
| 50 mL serological pipet | NA | NA | |
| PCR tubes | NA | NA | |
| Pipet-aid or equivalent | NA | NA | |
| QIAamp Viral RNA Mini Kit | Qiagen | 52904 | |
| QuantiTect Probe RT-PCR Kit | Qiagen | 204443 | |
| Amberlite IRA-900 chloride form | Sigma-Aldrich | 216585-500G | |
| Phosphate buffered saline | Sigma-Aldrich | P5368-10PAK | |
| Water (molecular biology grade) | Sigma-Aldrich | W4502-1L | |
| Eppendorf DNA LoBind Microcentrifuge Tubes | ThermoFisher | 13-698-791 | |
| Falcon 50 mL Conical Centrifuge Tubes | ThermoFisher | 14-432-22 | |
| Falcon Polypropylene Centrifuge Tubes | ThermoFisher | 05-538-62 | |
| SuperScript III Platinum One-Step qRT-PCR Kit w/ROX | ThermoFisher | 11745100 | |
| SKC Biosampler 20 mL, 3-piece glass set | SKC Inc. | 225-9593 | |
| Vac-u-Go sample pumps | SKC Inc. | 228-9695 | |
| Collison nebulizer (6-jet) | BGI Inc. | NA | |
| HEPA capsule | PALL | 12144 | |
| Q-TRAK indoor air quality monitor 8554 | TSI Inc. | NA | |
| Alnor velometer thermal anemometer AVM440-A | TSI Inc. | NA | |
| SidePak AM510 personal aerosol monitor | TSI Inc. | NA | |
| Bioaerosol chamber | NA | NA |
References
- Pirtle, E. C., Beran, G. W. Virus survival in the environment. Revue scientifique et technique (International Office of Epizootics). 10 (3), 733-748 (1991).
- Nguyen, T. M., et al. A community-wide outbreak of legionnaires disease linked to industrial cooling towers--how far can contaminated aerosols spread? The Journal of Infectious Diseases. 193 (1), 102-111 (2006).
- Marks, P. J., et al. Evidence for airborne transmission of Norwalk-like virus (NLV) in a hotel restaurant. Epidemiology and Infection. 124 (3), 481-487 (2000).
- Marks, P. J., et al. A school outbreak of Norwalk-like virus: Evidence for airborne transmission. Epidemiology and Infection. 131 (1), 727-736 (2003).
- Corzo, C. A., Culhane, M., Dee, S., Morrison, R. B., Torremorell, M. Airborne detection and quantification of swine influenza a virus in air samples collected inside, outside and downwind from swine barns. PLoS One. 8 (8), e71444 (2013).
- Anderson, B. D., et al. Bioaerosol sampling in modern agriculture: A novel approach for emerging pathogen surveillance. The Journal of Infectious Diseases. 214 (4), 537-545 (2016).
- Hietala, S. K., Hullinger, P. J., Crossley, B. M., Kinde, H., Ardans, A. A. Environmental air sampling to detect exotic Newcastle disease virus in two California commercial poultry flocks. Journal of Veterinary Diagnostic Investigation. 17 (2), 198-200 (2005).
- Jonges, M., et al. Wind-mediated spread of low-pathogenic avian influenza virus into the environment during outbreaks at commercial poultry farms. PLoS One. 10 (5), e0125401 (2015).
- Otake, S., Dee, S. A., Jacobson, L., Torremorell, M., Pijoan, C. Evaluation of aerosol transmission of porcine reproductive and respiratory syndrome virus under controlled field conditions. The Veterinary Record. 150 (26), 804-808 (2002).
- Wu, Y., et al. Aerosolized avian influenza A (H5N6) virus isolated from a live poultry market, China. The Journal of Infection. 74 (1), 89-91 (2017).
- Choi, M. J., et al. Live animal markets in Minnesota: A potential source for emergence of novel influenza A viruses and interspecies transmission. Clinical Infectious Diseases. 61 (9), 1355-1362 (2015).
- Haig, C. W., Mackay, W. G., Walker, J. T., Williams, C. Bioaerosol sampling: Sampling mechanisms, bioefficiency and field studies. The Journal of Hospical Infection. 93 (3), 242-255 (2016).
- Anderson, B. D., Lednicky, J. A., Torremorell, M., Gray, G. C. The use of bioaerosol aampling for airborne virus surveillance in swine production facilities: A mini review. Frontiers in Veterinary Science. 4, 121 (2017).
- Verreault, D., Moineau, S., Duchaine, C. Methods for sampling of airborne viruses. Microbiology and Molecular Biology Reviews. 72 (3), 413-444 (2008).
- Hogan, C. J. Jr Sampling methodologies and dosage assessment techniques for submicrometre and ultrafine virus aerosol particles. Journal of Applied Microbiology. 99 (6), 1422-1434 (2005).
- Yu, K. -P., Chen, Y. -P., Gong, J. -Y., Chen, Y. -C., Cheng, C. -C. Improving the collection efficiency of the liquid impinger for ultrafine particles and viral aerosols by applying granular bed filtration. Journal of Aerosol Science. 101, 133-143 (2016).
- Perez-Mendez, A., et al. Evaluation of a simple and cost effective filter paper-based shipping and storage medium for environmental sampling of F-RNA coliphages. J Virol Methods. 194 (1-2), 60-66 (2013).
- Chandler, J. C., et al. Field-based evaluation of a male-specific (F+) RNA coliphage concentration method. Journal of Virological Methods. 239, 9-16 (2017).
- Perez-Mendez, A., Chandler, J. C., Bisha, B., Goodridge, L. D. Concentration of enteric viruses from tap water using an anion exchange resin-based method. Journal of Virological Methods. 206, 95-98 (2014).
- Perez-Mendez, A., Chandler, J. C., Bisha, B., Goodridge, L. D. Evaluation of an anion exchange resin-based method for concentration of F-RNA coliphages (enteric virus indicators) from water samples. Journal of Virological Methods. 204, 109-115 (2014).
- Kammerer, J., Carle, R., Kammerer, D. R. Adsorption and ion exchange: Basic principles and their application in food processing. Journal of Agricultural and Food Chemistry. 59 (1), 22-42 (2011).
- Chandler, J. C., et al. A method for the improved detection of aerosolized influenza viruses and the male-specific (F+) RNA coliphage MS2. Journal of Virological Methods. 246, 38-41 (2017).
- Friedman, S. D., Cooper, E. M., Calci, K. R., Genthner, F. J. Design and assessment of a real time reverse transcription-PCR method to genotype single-stranded RNA male-specific coliphages (Family Leviviridae). Journal of Virological Methods. 173 (2), 196-202 (2011).
- Selvaraju, S. B., Selvarangan, R. Evaluation of three influenza A and B real-time reverse transcription-PCR assays and a new 2009 H1N1 assay for detection of influenza viruses. Journal of Clinical Microbiology. 48 (11), 3870-3875 (2010).
- Cademartiri, R., et al. Immobilization of bacteriophages on modified silica particles. Biomaterials. 31 (7), 1904-1910 (2010).
- Michen, B., Graule, T. Isoelectric points of viruses. Journal of Appled Microbiology. 109 (2), 388-397 (2010).
- Turgeon, N., Toulouse, M. J., Martel, B., Moineau, S., Duchaine, C. Comparison of five bacteriophages as models for viral aerosol studies. Applied and Environmental Microbiology. 80 (14), 4242-4250 (2014).
- Vergara, G. G., et al. Evaluation of FRNA coliphages as indicators of human enteric viruses in a tropical urban freshwater catchment. Water Research. 79, 39-47 (2015).
- Tung-Thompson, G., Libera, D. A., Koch, K. L., de Los Reyes, F. L. 3rd, Jaykus, L. A. Aerosolization of a human norovirus surrogate, bacteriophage MS2, during simulated vomiting. PLoS One. 10 (8), e0134277 (2015).
