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Biology

प्राथमिक संस् Murine Enterochromaffin कक्षों की संपूर्ण कक्ष इलेक्ट्रोफिजियोलॉजी

Published: September 26, 2018 doi: 10.3791/58112
Automatic Translation
*1, *1, 2, 2, 1, 1
1Enteric Neuroscience Program, Division of Gastroenterology & Hepatology,Department of Physiology & Biomedical Engineering, Mayo Clinic, 2Division of Gastroenterology, Department of Medicine, University of Massachusetts Medical School
* These authors contributed equally

Summary

Enterochromaffin (ईसी) कोशिकाओं जठरांत्र उपकला कोशिकाओं का एक छोटा सा सबसेट शामिल हैं । चुनाव आयोग कोशिकाओं विद्युत उत्तेजित और जारी सेरोटोनिन, अभी तक संवर्धन में कठिनाइयों और ईसी सेल की पहचान है शारीरिक अध्ययन सीमित है । विधि यहां प्रस्तुत एक प्राथमिक संस्कृति इलेक्ट्रोफिजियोलॉजी द्वारा एकल ईसी सेल की परीक्षा के लिए उत्तरदाई मॉडल स्थापित करता है ।

Abstract

जठरांत्र (सैनिक) उपकला में Enterochromaffin (ईसी) कोशिकाओं enteroendocrine कोशिकाओं की सबसे बड़ी उपजनसंख्या का गठन. विशेष संवेदी कोशिकाओं के रूप में, चुनाव आयोग कोशिकाओं चमकदार उत्तेजनाओं भावना और उन्हें सेरोटोनिन में परिवर्तित (5-hyroxytryptamine, 5-एचटी) रिलीज की घटनाओं. हालांकि, इन कोशिकाओं की इलेक्ट्रोफिजियोलॉजी खराब समझी जाती है क्योंकि उन्हें कल्चर और पहचानने में मुश्किल होती है । इस पत्र में प्रस्तुत विधि प्राथमिक चुनाव आयोग सेल एकल सेल इलेक्ट्रोफिजियोलॉजी के लिए अनुकूलित संस्कृतियों की रूपरेखा । इस प्रोटोकॉल का इस्तेमाल एक ट्रांसजेनिक सियान फ्लोरोसेंट प्रोटीन () रिपोर्टर मिश्रित प्राथमिक संस्कृतियों में माउस चुनाव आयोग कोशिकाओं की पहचान करने के लिए, वोल्टेज में पूरे सेल इलेक्ट्रोफिजियोलॉजी के उच्च गुणवत्ता रिकॉर्डिंग प्राप्त करने के दृष्टिकोण को आगे बढ़ाने-और वर्तमान क्लैंप मोड ।

Introduction

जठरांत्र (सैनिक) उपकला एक विविध कई प्रकार के सेल से मिलकर समुदाय है । Enteroendocrine कोशिकाओं के सभी उपकला कोशिकाओं के लगभग 1% शामिल है, और enterochromaffin (ईसी) कोशिकाओं सबसे बड़ा Enteroendocrine सेल जनसंख्या1हैं । हाल के अध्ययनों से पता चलता है कि enteroendocrine2 और चुनाव आयोग3,4 कोशिकाओं को बिजली से उत्तेजित कर रहे हैं । हम प्राथमिक ईसी सेल इलेक्ट्रोफिजियोलॉजी को समझने में रुचि रखते हैं । इस प्रकार, इस अध्ययन के प्रयोजन के लिए प्राथमिक चुनाव आयोग सेल पूरे सेल इलेक्ट्रोफिजियोलॉजी के लिए अनुकूलित संस्कृतियों की स्थापना थी ।

मौजूदा चुनाव आयोग सेल लाइनों का उत्पादन और 5-एचटी (जैसे, QGP-15, बोन6, KRJ-17) और5इलेक्ट्रोफिजियोलॉजी जांच करने के लिए इस्तेमाल किया गया है,8 आम तौर पर अमर नवोत्पादित से उत्पंन कर रहे है ऊतकों. हालांकि इन सेल लाइनों से प्राप्त जानकारी मूल्यवान5,8है, प्राथमिक सेल इलेक्ट्रोफिजियोलॉजी के अध्ययन के लिए ठीक से चुनाव आयोग सेल फिजियोलॉजी को समझने के लिए आवश्यक हैं । प्राथमिक ईसी सेल के इलेक्ट्रोफिजियोलॉजी में एकल उपकला कोशिकाओं के अलगाव और संस्कृति की आवश्यकता होती है, जो उपकला संस्कृतियों की कम व्यवहार्यता द्वारा सीमित किया गया है ।

संस्कृति इस अध्ययन में प्रस्तुत विधि फ्लोरोसेंट लेबल ईसी सेल के साथ ट्रांसजेनिक चूहों पर निर्भर करता है, Tph1 की तरह-9-7, इस अध्ययन में इस्तेमाल किया । विधि मिश्रित प्राथमिक उपकला संस्कृतियों पहले विकसित2,10 एकल कोशिका इलेक्ट्रोफिजियोलॉजी3के लिए ऑप्टिमाइज़ करता है । पिछले तरीकों Trypsin/EDTA प्लस Collagenase एक या EDTA और डीटीटी पाचन और प्रयुक्त घनत्व ढाल के लिए विशेष रूप से अलग और संस्कृति गिनी-सुअर11 और चूहा ईसी कोशिकाओं12के संयोजन का इस्तेमाल किया । हाल ही में, आंतों organoids उत्पन्न हुए थे और electrophysiological रिकॉर्डिंग के लिए यांत्रिक रूप से बाधित4. इन तरीकों का उपयोग संस्कृतियों अच्छी तरह से सेरोटोनिन रिलीज प्रयोगों के लिए अनुकूल हैं, आर टी-qPCR विश्लेषण और, जबकि वे इलेक्ट्रोफिजियोलॉजी के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है, समय लेने organoid पीढ़ी की सफलता पर निर्भर कर रहे हैं, घनत्व ढाल ईसी कोशिकाओं की पहचान करने के लिए, और Trypsin और EDTA के सेलुलर विघटनकारी प्रभाव । इसके विपरीत, प्रोटोकॉल यहां वर्णित एंजाइमी और यांत्रिक उपचार में सुधार, संवर्धन शर्तों का अनुकूलन, और प्रक्रियाओं को कारगर बनाने के लिए उच्च सेलुलर इलेक्ट्रोफिजियोलॉजी के लिए आवश्यक मानकों के लिए उपयुक्त एकल और स्वस्थ चुनाव आयोग कोशिकाओं का उत्पादन ।

यह विधि उन वैज्ञानिकों के लिए उपयोगी होगी, जो मिश्रित संस्कृतियों में प्राथमिक ईसी सेल पर काम करना चाहते हैं न कि नश्वर संस्कृतियों से और एकल कोशिकाओं के इलेक्ट्रोफिजियोलॉजी की जांच करना चाहते हैं । हालांकि, यह सेल आबादी का अध्ययन है कि छंटाई या दीर्घकालिक संस्कृतियों कि अस्तित्व की आवश्यकता पिछले ७२ एच की जरूरत के लिए कम उपयुक्त साबित हो सकता है ।

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Protocol

यहाँ वर्णित सभी विधियों को मेयो क्लिनिक की संस्थागत पशु परिचर्या एवं उपयोग समिति (IACUC) द्वारा अनुमोदित किया गया है. इस प्रोटोकॉल के प्राथमिक सेल संस्कृति भाग पहले प्रकाशित तरीकों पर आधारित है कि आगे विवरण10के लिए संदर्भित किया जा सकता है । सभी प्रायोगिक प्रक्रियाओं को (IACUC) द्वारा अनुमोदित किया जाना चाहिए, और सभी प्रयोगों को प्रासंगिक दिशानिर्देशों और विनियमों के अनुसार किया जाना चाहिए.

1. कल्चरल वडा

  1. मीडिया.
    1. उच्च ग्लूकोज के साथ चुनाव आयोग सेल पूरा संस्कृति मीडिया तैयार [4500mg/Dulbecco के संशोधित ईगल मध्यम (DMEM) 5% भ्रूण गोजातीय सीरम (FBS), 1% L-Glutamine और 1% पेनिसिलिन-Streptomycin (तालिका 1) के साथ पूरक है ।
      नोट: मीडिया के लिए एक महीने के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहित किया जा सकता है ।
    2. चुनाव आयोग सेल पूरा संस्कृति मीडिया और ३७ डिग्री सेल्सियस पर एक ५० मिलीलीटर ट्यूब में मीडिया के 25 मिलीलीटर जगह ।
    3. उच्च ग्लूकोज के साथ पाचन मीडिया तैयार [४,५०० mg/L] DMEM ०.१% गोजातीय सीरम एल्ब्युमिन (BSA) (तालिका 1) के साथ पूरक ।
    4. फ़िल्टर पाचन मीडिया और प्लेस ४ १० एमएल aliquots मीडिया के अलग ५० मिलीलीटर ट्यूबों में और एक ३७ ° c पानी स्नान में मशीन ।
      नोट: मीडिया के लिए एक महीने के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहित किया जा सकता है ।
  2. एंजाइम.
    1. बाहर वजन 4 मिलीग्राम (jejunum के लिए) या 24 मिलीग्राम (बृहदांत्र के लिए) Collagenase XI [≥ ८०० इकाइयों/मिलीग्राम] एक १.५ मिलीलीटर microcentrifuge ट्यूब में ।
      नोट: Collagenase पर स्थिर है-20 ° c एक वर्ष तक के लिए ।
    2. Ca2 + और2 मिलीग्राम +के साथ बर्फ ठंडा पंजाबियों के 1 मिलीलीटर में collagenase aliquot resuspend । भंवर अच्छी तरह से गठबंधन करने के लिए समाधान, और बर्फ पर जगह है ।
  3. कोटिंग संस्कृति प्लेटें ।
    1. गल १५० µ एल के extracellular मैट्रिक्स पर रात भर 4 ˚ सी बर्फ पर ।
    2. बर्फ ठंडा सीरम मुक्त उच्च ग्लूकोज DMEM की 2 मिलीलीटर के साथ गल extracellular मैट्रिक्स के १०० µ एल मिश्रण से एक 5% डब्ल्यू/वी extracellular मैट्रिक्स समाधान बनाओ ।
      नोट: Extracellular मैट्रिक्स कमरे के तापमान पर जम जाता है और पूर्व ठंडा पिपेट, ट्यूबों के साथ संभाला जाना चाहिए, और मीडिया कोट व्यंजन के लिए तैयार जब तक ।
    3. तुरंत कांच के गिलास इनर सर्कल-नीचे 5% extracellular मैट्रिक्स समाधान के २५० µ l के साथ ३५ mm व्यंजन कोट । यह नुस्खा 8 व्यंजन को कवर किया जाएगा ।
    4. शेष कोशिका संस्कृति अलगाव चरणों के दौरान एक ३७ डिग्री सेल्सियस मशीन में कांच के नीचे व्यंजन रखें । extracellular मैट्रिक्स को सेट करने के लिए 1 h की एक ंयूनतम लेता है, लेकिन अंय अलगाव कदम प्रदर्शन करते हुए २.५ घंटे तक के लिए तैयार किया जा सकता है ।
      नोट: 3 h से अधिक की मशीन बना सकते है एक बिल्ड-अप extracellular मैट्रिक्स जो पूरे सेल इलेक्ट्रोफिजियोलॉजी के दौरान सील गठन बाधा सकता है ।

2. ऊतक अलगाव

  1. नैतिक दिशानिर्देशों के अनुसार, बलिदान एक 3to 6 सप्ताह पुराने पुरुष या महिला Tph1-ट्रांसजेनिक माउस (जैक्सन प्रयोगशाला स्टॉक: ०२८३६६)9 या एक अंय रिपोर्टर तनाव ।
    नोट: हम कार्बन डाइऑक्साइड के बढ़ते स्तर और एक माध्यमिक मृत्यु सुनिश्चित करने के लिए साधन के रूप में एक ग्रीवा विस्थापन की एक घातक खुराक का उपयोग करें । इच्छामृत्यु पर ऐवम समिति भी गर्भाशय ग्रीवा के विस्थापन को इसके उपयोग में प्रशिक्षित व्यक्तियों द्वारा एक स्वीकार्य प्राथमिक इच्छामृत्यु विधि पर विचार करती है यदि जानवरों को पहले बेहोश किया जाता है ।
  2. एक polystyrene फोम विच्छेदन मंच पर euthanized माउस बाहर पिन 21 जी सुई का उपयोग कर । ७०% इथेनॉल के साथ माउस पेट को दूषित ।
  3. खींचें माउस त्वचा सूक्ष्म विच्छेदन संदंश (#5) का उपयोग कर तना हुआ, और फिर तेज शल्य कैंची का उपयोग करने के लिए माउस पेट के नीचे intraperitoneal गुहा को बेनकाब करने के लिए एक अनुप्रस्थ चीरा बनाने के लिए । रिब पिंजरे सामने आ रहा है जब तक एक और चीरा खड़ी पेट ऊपर बनाओ ।
  4. सूक्ष्म विच्छेदन संदंश का उपयोग करने के लिए माउस के बाईं ओर अंधान्त्र ले जाने के लिए बृहदांत्र के एक स्पष्ट दृश्य पाने के लिए ।
  5. बृहदांत्र के सबसे बाहर भाग में कटौती करने के लिए सूक्ष्म विच्छेदन कैंची का प्रयोग करें (लेकिन अभी भी मलाशय से समीपस्थ) और एक दूसरे पेट के लिए बाहर की कटौती करते हैं । एक १०० x 15 मिमी2 पेट्री बर्फ की 20 मिलीलीटर के साथ भरा डिश में निकाली आंतों प्लेस-कोल्ड फास्फेट बफर खारा (पंजाब) ।
  6. मापने के लिए और या तो मध्य बृहदांत्र या jejunum के 10 सेमी कटौती एक छोटे शासक का प्रयोग करें । पहले मलाशय के ऊपर लिया कटौती करने के लिए समीपस्थ स्थित आंत के 10 सेमी खंड को मापने के द्वारा बृहदांत्र निकालें । आधे में पूरी छोटी आंत तह और आधे रास्ते पर एक पहला चीरा बनाने और एक दूसरे चीरा 10 सेमी पहली कटौती करने के लिए समीपस्थ द्वारा jejunum की पहचान करें ।
    नोट: बर्फ पर सभी क्रमिक आइसोलेशन चरणों को निष्पादित करने के लिए जारी रखें ।
  7. बर्फ ठंडा पंजाबियों के साथ एक 6 मिलीलीटर सिरिंज भरें और निकाले आंत्र क्षेत्र के लुमेन में सिरिंज सुई जगह है । माइक्रो-विच्छेदन संदंश का उपयोग करने के लिए दबाना और सिरिंज सुई के आसपास आंतों को सील, और धीरे से दूर मल कुल्ला करने के लिए लुमेन के माध्यम से पंजाब के 10 मिलीलीटर फ्लश ।
  8. धीरे लुमेन के माध्यम से सूक्ष्म विच्छेदन संदंश बुनाई द्वारा आंतों के ऊतकों को पलटना, एक आंत्र दीवार चुटकी, और संदंश की नोक को समीपस्थ ऊतक मुकर. इस प्रक्रिया को दोहराएँ जब तक इस खंड अंदर बाहर बाहर का सामना करना लुमेन के साथ बाहर है ।
  9. ऊतक खंड को 1 सेमी के टुकड़ों में काटने के लिए माइक्रो-विच्छेदन कैंची का प्रयोग करें ।
  10. 5 मिलीलीटर बाँझ पंजाबियों से भरे ५० मिलीलीटर यूरिन में टिशू सेगमेंट ट्रांसफर करने के लिए माइक्रो-विच्छेदन संदंश का प्रयोग करें । एक द्रवरूप निरंतरता के लिए ऊतक टुकड़े कीमा के लिए माइक्रो-विच्छेदन कैंची का प्रयोग करें ।
  11. कीमा बनाया हुआ ऊतक और बर्फ ठंडे पंजाब के 15 मिलीलीटर एक साफ ५० एमएल ट्यूब में स्थानांतरण पिपेट द्वारा प्लेस । Triturate 2 बार स्थानांतरण पिपेट के साथ, ऊतक बसने के लिए प्रतीक्षा करें, पंजाब supernatant के 15 मिलीलीटर निकालें, और ताजा पंजाबियों के साथ प्रतिस्थापित करें । पंजाबियों के साफ होने तक यह प्रक्रिया तीन बार दोहराएं ।
  12. बर्फ पर धोया ऊतक टुकड़े के साथ ५० मिलीलीटर ट्यूब प्लेस और एक ऊतक संस्कृति हुड में बर्फ की बाल्टी ले आओ ।

3. एंजाइमी और यांत्रिक पाचन

  1. पहले पाचन
    1. जल स्नान से, ५० मिलीलीटर पूर्व गर्म पाचन मीडिया के 10 मिलीलीटर युक्त ट्यूबों के एक पुनः प्राप्त । ५० मिलीलीटर ट्यूब करने के लिए, पंजाब collagenase समाधान के २५० µ एल जोड़ें और आंत्र ऊतक टुकड़े कीमा बनाया हुआ ।
      नोट: पिछले वाशिंग स्टेप्स से किसी भी पंजाबियों सहित बचने के लिए ध्यान रखें ।
    2. ३७ डिग्री सेल्सियस पर 5 मिनट (बृहदांत्र या jejunum) के लिए एक जल स्नान में ५० मिलीलीटर ट्यूब प्लेस । प्रति मिनट ट्यूब 2x शेक ।
      नोट: इष्टतम समय और यांत्रिक पाचन की तीव्रता भिन्न हो सकते हैं और उपयोगकर्ता द्वारा निर्धारित किया जा करने की आवश्यकता होगी. इष्टतम पाचन शर्तों को निर्धारित करने के लिए, एक 10 µ l aliquot कोशिकाओं के प्रत्येक पाचन के बाद देखा जा सकता है । 1 पाचन के दौरान, supernatant कोशिकाओं के झुरमुट से मिलकर होना चाहिए ।
    3. धीरे triturate ऊतक एक बार 10 मिलीलीटर सीरम वैज्ञानिक पिपेट के साथ । संक्षेप में ऊतक टुकड़ों को व्यवस्थित करते हैं, तो supernatant के पूरे 10 मिलीलीटर को दूर करने के लिए एक हस्तांतरण पिपेट का उपयोग करें ।
  2. दूसरा पाचन: 3.1.3 के लिए कदम 3.1.1 दोहराएँ । 10 मिनट के लिए गर्मी की समय वृद्धि यदि बृहदांत्र पचा और jejunum के लिए 5 मिनट में गर्मी समय रहते हैं ।
    नोट: अवलोकन पर, supernatant अभी भी कोशिकाओं के बड़े झुरमुट से मिलकर करना चाहिए ।
  3. तीसरा पाचन
    1. दोहराएँ चरण 3.1.1
    2. 10 मिनट के लिए एक ३७ ˚ सी जल स्नान में ५०-एमएल ट्यूब प्लेस (बृहदांत्र या छोटे jejunum) । 1 और 2 डाइजेस्टर की तुलना में एक उच्च तीव्रता पर ट्यूब 2-3x प्रति मिनट शेक ।
    3. धीरे से ऊतक को 10 मिलीलीटर सीरम वैज्ञानिक पिपेट के साथ ऊपर और नीचे पिपेट । ऊतक के टुकड़ों को थोड़े समय के लिए व्यवस्थित करने की अनुमति दें ।
      नोट: supernatant एकल कोशिकाओं और छोटे झुरमुट का एक संयोजन से मिलकर होना चाहिए ।
    4. एक नया 15 मिलीलीटर ट्यूब में supernatant के 10 मिलीलीटर जगह के लिए एक हस्तांतरण पिपेट का प्रयोग करें, गर्म ईसी सेल पूरा संस्कृति मीडिया के 2 मिलीलीटर जोड़ने के लिए, और एक बार पलटना मिश्रण करने के लिए ।
    5. कमरे के तापमान पर 5 मिनट के लिए १०० x g पर स्पिन, तो supernatant को दूर करने के लिए एक स्थानांतरण पिपेट का उपयोग करें । एक स्थानांतरण पिपेट का प्रयोग करें गरम ईसी सेल पूरा संस्कृति मीडिया के २.५ मिलीलीटर में शेष गोली resuspend ।
  4. चौथा पाचन: दोहराएँ चरण 3.3.1 करने के लिए 3.3.5. बृहदांत्र के लिए 15 मिनट के लिए मशीन समय बढ़ाएं और jejunum के लिए 10 मिनट में रहते हैं ।
    नोट: supernatant अब एकल कक्षों से मिलकर होना चाहिए ।

4. सेल संस्कृति

  1. एक नए 15 मिलीलीटर ट्यूब (5 मिलीलीटर कुल मात्रा) में डाइजेस्टर 3 और 4 से एकत्र सेल निलंबन गठबंधन करने के लिए एक स्थानांतरण पिपेट का प्रयोग करें ।
  2. एक hemocytometer के साथ गिनती करने के लिए कोशिकाओं के 10 µ एल aliquot निकालें और शेष सेल निलंबन १०० x g पर 5 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर स्पिन ।
    नोट: अंतिम सेल निलंबन छोटे झुरमुट और एकल कोशिकाओं से मिलकर होगा ।
  3. एक स्थानांतरण पिपेट के साथ supernatant निकालें और एमएल प्रति १,०००,००० कोशिकाओं के एक घनत्व पर चुनाव आयोग सेल पूरा संस्कृति मीडिया में गोली resuspend ।
    नोट: सेल सस्पेंशन का अंतिम वॉल्यूम अंतिम सेल काउंट पर निर्भर करेगा । ठेठ सेल गिनती २,०००,००० से ४,०००,००० के लिए सीमा ।
  4. लेपित ग्लास-मशीन से नीचे संस्कृति व्यंजन निकालें । एक P1000 पिपेट का प्रयोग करें अंतिम सेल निलंबन के २५० µ एल के साथ प्रत्येक संस्कृति पकवान से extracellular मैट्रिक्स की जगह ।
    नोट: Extracellular मैट्रिक्स कोटिंग के लिए कांच के किनारों के नीचे पकवान छड़ी जाता है । विशेष देखभाल के किनारे से कोटिंग को हटाने के लिए जेल buildup को रोकने के लिए लिया जाना चाहिए ।
  5. 1 मिमी पर रॉक अवरोधक Y-२७६३२ के एक शेयर समाधान बनाओ । प्रत्येक डिश में 10 µ एम रॉक अवरोधक के एक काम एकाग्रता को प्राप्त करने के लिए स्टॉक समाधान के प्रत्येक ग्लास नीचे पकवान के २.५ µ एल जोड़ें ।
    नोट: यह कदम jejunum संस्कृतियों के अस्तित्व के लिए महत्वपूर्ण है, लेकिन बृहदांत्र के लिए वैकल्पिक है ।
  6. एक ३७ ° c में प्रत्येक संस्कृति पकवान प्लेस और 5% सह 24 के लिए2 मशीन ७२ ज (चित्रा 1) ।

5. पूरे सेल इलेक्ट्रोफिजियोलॉजी के लिए ईसी सेल की तैयारी

  1. दो 5 x ०.५-मोम फिल्म के सेमी स्ट्रिप्स के साथ माइक्रोस्कोप मंच के भीतरी व्यास एक ओ-अंगूठी बनाने के लिए लाइन । माउंट ओ-रिंग (चित्रा 2ए-बी) के भीतर ३५-mm सेल कल्चर डिश ।
  2. ऐसे unattacheded extracellular मैट्रिक्स या मृत कोशिकाओं के रूप में दोनों अस्थाई मलबे, कुल्ला, और संस्कृति मीडिया सीरम पूरी तरह से चुनाव आयोग कोशिकाओं से दूर करने के लिए या तो ईसी सेल और इलेक्ट्रोड के बीच सील गठन में बाधा से रोकने के लिए । इलेक्ट्रोफिजियोलॉजी के लिए पर्याप्त पूरी तरह से सेल धोने को प्राप्त करने के लिए तीन निम्न विकल्पों का उपयोग करें:
    1. विकल्प 1: समाधान विनिमय अधिक एक लंबे कक्ष में अधिक कुशल है तो एक परिपत्र चैंबर से । चूंकि ईसी सेल राउंड ३५ एमएम डिश में कल्चर्ड थे, इसलिए डिश के लिए प्लास्टिक एलिप्टिकल डालने का निर्माण करें ।
      1. 3 डी मुद्रण द्वारा या पारंपरिक मिलिंग विधियों द्वारा सम्मिलित बनाएँ । हम इस्तेमाल किया डालने के निंनलिखित आयामों (मिमी में): बाहरी व्यास, ३४.५ के साथ एक्रिलिक प्लास्टिक से मिल गया था; भीतरी दीर्घवृत्त, 20x9; बाहरी ऊंचाई, 10; भीतरी ऊँचाई, १.५; पुल स्पैन, 3x3; पुल की मंजूरी, १.५; प्रवेश और आउटलेट, 4 x 4 प्रत्येक ।
      2. संस्कृति डिश में डालने कम (चित्रा 2a-B) और यह दो ०.१५ के साथ माइक्रोस्कोप मंच के शीर्ष करने के लिए सुरक्षित मॉडलिंग क्ले के ०.२ ग्राम टुकड़े में दबाया १.२ x ०.३ x ०.१ सेमी आयतों (चित्रा 2ए-सी) ।
      3. एक प्लास्टिक हस्तांतरण पिपेट के साथ, धीरे पकवान (प्रवेश) के एक पक्ष के लिए extracellular समाधान जोड़ने जबकि दूसरी तरफ से aspirating (आउटलेट) ।
    2. विकल्प 2: एक इंजीनियर प्लास्टिक डालने के बिना, डिश (प्रवेश) के एक तरफ से पिपेट हस्तांतरण द्वारा extracellular समाधान जोड़ जबकि विपरीत पक्ष (आउटलेट) से aspirating । धीरे से स्थानांतरण पिपेट के स्थान को घुमाएगी (जैसे, एन ई करने के लिए एस) विपरीत पक्ष पर आकांक्षा सुई की नियुक्ति को प्रतिबिंबित करते हुए (जैसे, s करने के लिए डब्ल्यू एन) ।
    3. विकल्प 3: कोट extracellular मैट्रिक्स पर आयताकार coverslips चरण में 1.3.3., और संस्कृति चरण ४.४ में इन coverslips पर सेल निलंबन । इस coverslip को extracellular समाधान से भरे आयताकार चैंबर में स्थानांतरित करें, चरण ५.१ को छोड़ रहा है और चरण ५.३ लंघन कर रहा है । एक प्लास्टिक हस्तांतरण पिपेट से extracellular समाधान के साथ चैंबर कुल्ला, के रूप में 1 विकल्प (5.2.1.3) में वर्णित है ।
  3. पुन: उल्टे माइक्रोस्कोप (चित्रा 2डी) के ऊपर सेल संस्कृति के साथ मंच देते हैं । कमरे के तापमान पर सीरम मुक्त extracellular समाधान में ईसी सेल संस्कृति की मशीन ।
  4. 4 घंटे के बाद, संस्कृति extracellular समाधान के साथ फिर से कुल्ला के रूप में ऊपर वर्णित है । पूरे सेल इलेक्ट्रोफिजियोलॉजी के साथ आगे बढ़ें ।

6. प्राथमिक संस्कृति से ईसी सेल की पूरी सेल इलेक्ट्रोफिजियोलॉजी

  1. एक पूरे सेल गीगा-सील प्राप्त करने
    1. 1-5 MΩ के एक प्रतिरोध करने के लिए एक दर्जन इलेक्ट्रोड खींचो.
      नोट: पिपेट के 1 – 2 MΩ प्रतिरोध कि उपज 10-100 GΩ जवानों सबसे अच्छा प्रदर्शन करते हैं । आग चमकाने इलेक्ट्रोड युक्तियां GΩ जवानों को प्राप्त करने के लिए आवश्यक नहीं है ।
    2. कोट समान बहुलक के साथ सभी पिपेट की नाक शंकु । जमीन को पिपेट क्षैतिज पकड़ो और एक गर्मी बंदूक के सामने सीधा करने के लिए । धीरे से पिपेट को घुमाएगी जब तक बहुलक सख्त ।
    3. एक 15 मिलीलीटर शंकु ट्यूब में intracellular समाधान के एक aliquot डालो । 1 एमएल सिरिंज के माध्यम से एक १.५ मिलीलीटर microcentrifuge ट्यूब में इस समाधान के १.२ मिलीलीटर स्थानांतरण । सिरिंज में intracellular समाधान की एक और ०.७ मिलीलीटर वापस ले लो । सिरिंज के अंत से हवा दूर. एक लचीला ३४ जी, ६७ mm सुई सिरिंज के लिए संलग्न है, और इस सुई से किसी भी शेष हवा बाहर फ्लश ।
    4. किसी अन्य कोशिका या मलबे के संपर्क में नहीं है कि एक Tph1---+ सेल पहचानें ।
    5. intracellular समाधान के साथ इलेक्ट्रोड टिप भरें । Backfill को सिरिंज द्वारा पिपेट. ध्यान से हवा बुलबुला इंटरफेस दूर करने के लिए एक नख के साथ पिपेट झटका.
    6. हवा के ०.३ मिलीलीटर के साथ तैयार गोताख़ोर के साथ, धारक टयूबिंग के आउटलेट के लिए एक 6 मिलीलीटर सिरिंज संलग्न । धारक में इलेक्ट्रोड माउंट ।
      नोट: इससे पहले कि इलेक्ट्रोड को सील करने के लिए intracellular समाधान के भीतर तटस्थ या सकारात्मक दबाव बनाए रखने के लिए स्नान समाधान में प्रवेश करती है टयूबिंग के लिए सिरिंज कनेक्ट ।
    7. एक दो कदम वोल्टेज-दबाना प्रोटोकॉल है कि रिकॉर्ड स्थिर राज्य के पहले कदम पर एक वोल्टेज सीढ़ी से धाराओं को सक्रिय करने और दूसरे चरण पर एक वोल्टेज से उपलब्ध धाराओं रिकॉर्ड लोड । सील परीक्षण खोलें (५० kHz पर 5 एमवी).
    8. स्नान समाधान में इलेक्ट्रोड कम. micromanipulators के साथ, इलेक्ट्रोड टिप में विमान के साथ और सीधे सेल से क्षैतिज पैंतरेबाज़ी । सिरिंज से ०.३ मिलीलीटर हवा से निष्कासित ।
    9. धीरे सेल स्पर्श करने के लिए एक्स-अक्ष के साथ इलेक्ट्रोड क्षैतिज ले जाएँ. एक डिंपल के लिए देखो ईसी सेल और/या सील परीक्षण पर झिल्ली प्रतिरोध में वृद्धि पर दिखाई देते हैं । यदि आवश्यक हो, तो इलेक्ट्रोड को z-अक्ष के साथ नीचे पुनः समायोजित करें और/या क्षैतिज रूप से x-अक्ष के साथ, कक्ष के midline के आगे नहीं बढ़ रहा है ।
    10. 6-एमएल सिरिंज पर 0.1-0.2 मिलीलीटर सक्शन लागू करें । पकड़ गोताख़ोर स्थिर जब तक १०० MΩ हासिल की है, तो गोताख़ोर से पकड़ जारी है । सेल के लिए गीगा-सील करने के लिए रुको । धीरे एक पंगा लेना गति के साथ सिरिंज डिस्कनेक्ट.
      नोट: यदि कोई ईसी सेल शुरू में मुहर नहीं लगाता है, तो उसे बाद के प्रयास से फिर से सील करना संभव हो सकता है । ऐसा करने के लिए, धीरे से इलेक्ट्रोड को < 20 MΩ सील प्रतिरोध के साथ ईसी सेल से दूर खींच । micromanipulators के साथ खर्च इलेक्ट्रोड स्टीयरिंग, circumnavigate लक्षित ईसी सेल मैन्युअल दूर मैट्रिक्स या मलबे स्पष्ट करने के लिए । फिर, एक ताजा इलेक्ट्रोड के साथ ईसी सेल सील करने का प्रयास ।
  2. रिकॉर्ड पूरे सेल वोल्टेज-gated Na+ वर्तमान ।
    1. एक 3 मिलीलीटर 0.5-1.0 मिलीलीटर हवा के साथ तैयार सिरिंज अनुलग्न करें । एक 3 मिलीलीटर सिरिंज पर सक्शन (0.1-0.5 मिलीलीटर) के एक त्वरित नल लागू करें । दोहराएँ जब तक पूरे सेल का उपयोग हासिल की है, तो धीरे सिरिंज डिस्कनेक्ट.
      नोट: एक सिरिंज के प्रदर्शन के रूप में शुरू में भिंन हो सकते है और समय और उपयोग, 3 मिलीलीटर सिरिंज (एक सूचकांक उंगली के साथ अंत सील) के साथ पहले से अभ्यास के साथ धीरे से परिवर्तन सुनिश्चित करने के लिए कि गोताख़ोर 0.1 के भीतर हटना होगा-0.2 इसके शुरू होने की स्थिति की मिलीलीटर । यदि नहीं, तो एक नया एक के लिए सिरिंज विनिमय ।
    2. पूरे सेल समाई मुआवजा पर बारी । समाई और श्रृंखला प्रतिरोध समायोजित करें । श्रृंखला प्रतिरोध मुआवजा पर बारी । अंतराल के साथ ६० ms में सेट, समायोजित तो भविष्यवाणी की श्रृंखला प्रतिरोध मुआवजा सही । सील परीक्षण बंद करें ।
    3. पूरे सेल वोल्टेज के 5 रन के औसत रिकॉर्ड-gated Na+ वर्तमान (चित्रा 3ए) ।
    4. जल्दी से वोल्टेज के दो मापदंडों का ध्यान रखें-gated na+ वर्तमान: खिड़की पर वोल्टेज वर्तमान (चित्रा 3बी, लाल प्रतीकों, स्थिर के प्रतिच्छेदन-राज्य सक्रियकरण और निष्क्रियता घटता) और पीक na+ वर्तमान घनत्व.
      नोट: पीक Na+ धाराओं के साथ ईसी सेल-वोल्टेज क्लैंप मोड में अधिक से अधिक-५० पीए आमतौर पर आग पर जाना होगा वर्तमान दबाना मोड में क्षमता । इसके अतिरिक्त, धाराओं से अधिक-वोल्टेज दबाना में २०० pA (चित्रा 3ए) तो आमतौर पर आग कार्रवाई सहज झिल्ली क्षमता से वर्तमान दबाना में क्षमता (लाल रेखा, चित्रा 3डी) की वोल्टेज के पास खिड़की वर्तमान (लाल प्रतीकों, चित्रा 3बी) ।
  3. कार्रवाई क्षमता को रिकॉर्ड में लाना ।
    1. श्रृंखला प्रतिरोध मुआवजा बंद कर दें । बाहरी आदेश को बंद करें । वी-दबाना से मोड स्विच करने के लिए I-दबाना । लाभ समायोजित करें । एक प्रासंगिक वर्तमान दबाना प्रोटोकॉल लोड । 0 pA के लिए वर्तमान होल्डिंग की राशि समायोजित करें । बाहरी आदेश चालू करें ।
      चेतावनी: पहले बाहरी आदेश को बंद करने के बिना I-दबाना (या इसके विपरीत) करने के लिए वी-दबाना से स्विच न करें ।
    2. आराम झिल्ली क्षमता नोट करें । पकड़ वर्तमान इनपुट इतना है कि झिल्ली संभावित खिड़की वर्तमान (जैसे, -८० से-१०० एमवी) नीचे पढ़ता समायोजित करें । प्रासंगिक वर्तमान दबाना प्रोटोकॉल को समायोजित करें ताकि वर्तमान इनपुट के चरण अंतराल होल्डिंग वर्तमान के मूल्य से कम है (चित्रा 3सी इनसेट, + 2 pa के लिए कदम-3 फिलीस्तीनी अथॉरिटी होल्डिंग वर्तमान) ।
    3. कार्रवाई क्षमता को रिकॉर्ड में लाना । एक कार्रवाई की क्षमता (चित्रा 3सी, 5 के 3 झाडू, एक + 4 फिलीस्तीनी अथॉरिटी से-3 pa होल्डिंग = + 1 फिलीस्तीनी अथॉरिटी) को चालू करने के लिए इंजेक्शन के वर्तमान कम राशि नोट ।
  4. सहज कार्रवाई क्षमता रिकॉर्ड ।
    1. बाहरी आदेश को बंद करें । एक गैप-मुक्त (गैर प्रासंगिक) वर्तमान दबाना प्रोटोकॉल लोड ।
      नोट: अंतराल-मुक्त वर्तमान दबाना प्रोटोकॉल में वर्तमान होल्डिंग की मात्रा कक्ष के लिए उपयुक्त होने के लिए सत्यापित किया गया है जब तक कि बाहरी आदेश को वापस चालू न करें ।
    2. होल्डिंग वर्तमान की राशि के लिए वर्तमान में अंतिम झाडू में इंजेक्ट किया जाता है कि एक कार्रवाई की क्षमता (आंकड़ा 3डी, दूसरा झाडू के दौरान मौजूदा इनपुट, एक + 2 pa से कदम-3 pa होल्डिंग =-1 pa) आग नहीं किया था ।
    3. बाहरी आदेश चालू करें । डबल की जांच करें कि अनुमानित होल्डिंग वर्तमान दहलीज से नीचे झिल्ली क्षमता लाता है एक कार्रवाई की क्षमता आग । यदि आवश्यक हो तो होल्डिंग वर्तमान समायोजित करें । रिकॉर्ड सहज गतिविधि ।

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Representative Results

संस्कृतियों:
प्राथमिक murine उपकला कोशिकाओं से बना एक ट्रांसजेनिक Tph1--एक मॉडल 4 घंटे के बाद बर्तन के लिए देते हैं और 24 से ७२ एच के बीच शारीरिक प्रयोगों के लिए तैयार हैं. जब संस्कृति शर्तों को अनुकूलित नहीं किया गया था, उपकला कोशिका संस्कृति बड़े झुरमुट के शामिल, सेलुलर मलबे, क्षतिग्रस्त झिल्ली, और चुनाव आयोग की कोशिकाओं में कमजोर विश्लेषक संकेत चल (चित्रा 1ए). संस्कृतियों कि एकल कोशिकाओं और छोटे झुरमुट के शामिल इलेक्ट्रोफिजियोलॉजी के लिए अनुकूलित किया गया है । स्वस्थ चुनाव आयोग कोशिकाओं को आसानी से उज्ज्वल प्रतिदीप्ति द्वारा पहचाने गए थे और अभी भी जोरदार धोने के बाद पकवान का पालन किया (चित्रा 1बी) ।

इलेक्ट्रोफिजियोलॉजी
चुनाव आयोग पूरे सेल सिर्फ 15 ± रॉक अवरोध करनेवाला के बिना बृहदांत्र संस्कृतियों से प्रयास के 4% पर प्राप्त किया गया (29 पूरे १८२ प्रयास से 22 संस्कृतियों से बाहर कोशिकाओं), लेकिन रॉक अवरोध करनेवाला के साथ बृहदांत्र संस्कृतियों से प्रयास के 30 ± 7% (१०२ से बाहर के प्रयासों से 27 पूरी कोशिकाओं ५० संस्कृतियों) (< c1 > चित्रा 4A; p < 0.05 द्वारा एक गैर-पैरामीट्रिक दो-पुच्छ t-परीक्षण, चट्टान अवरोधक के साथ बनाम बिना बृहदांत्र संस्कृतियों) । इसी तरह, jejunum रॉक अवरोधक के बिना चुनाव आयोग कोशिकाओं को लंबे समय तक जीवित नहीं इलेक्ट्रोफिजियोलॉजी के लिए पर्याप्त है, जबकि चुनाव आयोग पूरी कोशिकाओं ४१ ± रॉक अवरोध करनेवाला के साथ jejunum संस्कृति से प्रयास के 3% पर प्राप्त किया गया (१८६ पूरे ५० संस्कृतियों से ४४७ प्रयास से बाहर कोशिकाओं) (आंकड़ा 4क; p > 0.05 एक गैर द्वारा पैरामीट्रिक दो पूंछ टीपरीक्षण, रॉक अवरोध करनेवाला के साथ jejunum बनाम बृहदांत्र) ।

पूरे सेल इलेक्ट्रोफिजियोलॉजी द्वारा, Na+ धाराओं में दर्ज किया गया वोल्टेज-दबाना मोड और कार्रवाई क्षमता (एपी) वर्तमान दबाना मोड में. Na+ धाराओं से दर्ज किए गए ८१.३ ± ४.०% TPH1-jejunum या ६४.१ ± ९.२% से कोशिकाओं3बृहदांत्र से । jejunum संस्कृतियों से ५९ ईसी कोशिकाओं की वोल्टेज द्वारा की पुष्टि-दबाना है ना+ पीक धाराओं से भी बड़ा-25 pA, 19 वर्तमान में चुनाव आयोग कक्ष-क्लैंप मोड निकाल दिया सहज एपी ("सहज"), 29 ईसी सेल एपी निकाल दिया केवल जब वर्तमान में एक कदम प्रोटोकॉल द्वारा-दबाना मोड ("केवल-"), और 11 ईसी सेल एपी सहज या कदम प्रोटोकॉल ("गैर गोलीबारी") (चित्रा 4बी) द्वारा आग नहीं था । सहज कोशिकाओं था एक औसत पीक Na+ वर्तमान घनत्व (मैंपीक) के-१०८.० ± १९.३ pA/पीएफ,---६०.२ ± ९.२ pa/ पीएफ, जबकि गैर-फायरिंग कोशिकाओं के एक मैं चोटी था--४३.३ ± 14 फिलीस्तीनी अथॉरिटी/पीएफ (चित्रा 4 ब; p < ०.०५, सहज बनाम -केवल या गैर-गोलीबारी वाले समूह; p > 0.05-केवल बनाम गैर-फायरिंग समूह) । वर्तमान घनत्व में अंतर पूरे कोशिका समाई का एक प्रतिबिंब नहीं थे, के रूप में सहज (३.३ ± ०.२ पीएफ),-केवल (२.९ ± ०.२ पीएफ), और गैर गोलीबारी (३.१ ± ०.३ पीएफ) कोशिकाओं के समान पूरे सेल capacitances था (पी > 0.05) । चुनाव आयोग सेल na+ धाराओं और बटोरा एपी के प्रति संवेदनशील थे [na +]ओ एकाग्रता और नाV१.३ अवरोध3.

Figure 1
चित्रा 1 : संस्कृति परिणाम के प्रतिनिधि रेंज । एक प्राथमिक उपकला jejunum संस्कृति के epifluorescence छवियों के साथ एक Tph1--एक गिलास नीचे पकवान पर चढ़ाया और 24 ज के लिए संस्कृति के साथ शब्दकोश । इन दो छवियों इस प्रोटोकॉल से संस्कृति परिणामों की एक श्रृंखला प्रदर्शित करता है । (सफेद) enterochromaffin (चुनाव आयोग) कोशिकाओं । (एक) एक संस्कृति है कि इलेक्ट्रोफिजियोलॉजी के लिए खराब गुणवत्ता है से प्रतिनिधि छवि । संस्कृति बड़े झुरमुट, क्षतिग्रस्त कोशिका झिल्ली, कम प्रतिदीप्ति संकेत, और मृत कोशिकाओं के अस्थायी समूहों के होते हैं । (ख) एक संस्कृति है कि इलेक्ट्रोफिजियोलॉजी के लिए अनुकूलित किया गया है से प्रतिनिधि छवि । संस्कृति एकल, स्वस्थ कोशिकाओं और छोटे झुरमुट है कि थाली का पालन किया है की मुख्य रूप से होते हैं । इस संस्कृति में ईसी सेल एक मजबूत प्रतिदीप्ति संकेत बनाए रखें । स्केल बार = १०० µm; पैनलों 1:1 स्केल कर रहे हैं । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 2
चित्रा 2 : इलेक्ट्रोफिजियोलॉजी के लिए सेल संस्कृतियों की तैयारी । सीरम मुक्त extracellular समाधान के साथ चुनाव आयोग सेल संस्कृतियों के कुशल और पूरी तरह से धोने के लिए एक रणनीति extracellular मैट्रिक्स और सीरम जो सील गठन में बाधा होगी को कम करने के लिए महत्वपूर्ण है । (क) सामग्री । ऊपर छोड़ दिया से दक्षिणावर्त,: चरण, मोम फिल्म के दो 5 मिमी चौड़ी स्ट्रिप्स, मॉडलिंग क्ले के २ २०० मिलीग्राम टुकड़े, प्लास्टिक हस्तांतरण पिपेट, #5 संदंश, अंडाकार रिकॉर्डिंग चैंबर, ग्लास नीचे के साथ ३५ मिमी संस्कृति डिश. (ख) मंच के भीतरी व्यास को मोम फिल्म पालन, संस्कृति पकवान में अंडाकार कक्ष कम है, और आयताकार स्ट्रिप्स में मिट्टी समतल । (ग) धीरे मोम फिल्म में संस्कृति पकवान प्रेस लाइन में खड़ा मंच और पकवान के किनारे पर मॉडलिंग मिट्टी खींच द्वारा रिकॉर्डिंग चैंबर स्थिर, चैंबर से मंच तक । । । extracellular समाधान के कई संस्करणों के साथ चुनाव आयोग कोशिकाओं कुल्ला । (घ) उल्टे माइक्रोस्कोप के ऊपर बढ़ते कोष्ठक को मंच पर लौटा देना. कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 3
चित्रा 3 : प्रतिनिधि इलेक्ट्रोफिजियोलॉजी परिणाम. (एक) एक दो कदम वोल्टेज-दबाना प्रोटोकॉल (इनसेट) द्वारा दर्ज की गई पूरी सेल Na+ धाराओं, । ५० एमएस ध्रुवीकरण से-१२० एमवी चरण 1 के दौरान चैनलों को सक्रिय (●), जबकि चरण 2 के दौरान 0 एमवी के लिए एक और ध्रुवीकरण (○) चैनल है कि अभी तक निष्क्रिय नहीं था सक्रिय करता है (यानी, अभी भी खोलने के लिए उपलब्ध हैं). लाल ट्रेस, वर्तमान वोल्टेज से कदम-१२० से-४० 0 एमवी के लिए (ख) वर्तमान-वोल्टेज से पीक Na का संबंध+ एक पैनल से धाराओं, चरण 1 (●, स्थिर राज्य सक्रियण) या 2 कदम (○, स्थिर राज्य निष्क्रियता). स्थिर राज्य सक्रियकरण और निष्क्रियता curves के प्रतिच्छेदन एक छोटी सी खिड़की पर वर्तमान से पता चलता है-४० एमवी (लाल प्रतीकों) । (ग) कार्रवाई की क्षमता वर्तमान उत्तेजनाओं ध्रुवीकरण द्वारा बटोरी गई । एक कार्रवाई की क्षमता 0 एमवी (ग्रे लाइन) पिछले आग कर सकते हैं, जब झिल्ली क्षमता ना की वोल्टेज तक पहुंच+ खिड़की वर्तमान (लाल रेखा,-४० एमवी) । इनसेट, वर्तमान-क्लैंप प्रोटोकॉल, जिसमें 0 से + 8 पीए ५० के लिए इंजेक्शन-3 पीए के एक आधारभूत से एमएस ध्रुवीकरण किया गया । (घ) कार्रवाई की क्षमता सहज घटनाओं है कि-४० एमवी के लिए विध्रुवीकरण किया है ऊपर से आग । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 4
चित्र 4 : पूरे सेल इलेक्ट्रोफिजियोलॉजी का प्रवाह । (A) अभाव में काम के n दिनों के लिए प्रयास के प्रति पूरे कोशिकाओं का प्रतिशत मतलब (-) या उपस्थिति (+) रॉक अवरोध करनेवाला (10 µ एम) । jejunum से ईसी सेल रॉक अवरोध करनेवाला के बिना संस्कृति में 24 ज बच नहीं किया । (ख) Na+ वर्तमान घनत्व वोल्टेज में मापा- n ईसी सेल, जिसमें कार्रवाई क्षमता आग नहीं किया था से दबाना (गैर गोलीबारी), केवल जब एक प्रासंगिक वर्तमान द्वारा निकाले-दबाना प्रोटोकॉल (केवल-), या सहज अंतराल में निकाल दिया-मुक्त वर्तमान दबाना मोड (सहज) (त्रुटि सलाखों SEM हैं) । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

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Discussion

पूरी तरह से समझ ईसी सेल समारोह एक उच्च गुणवत्ता प्राथमिक संस्कृति के लिए पूरे सेल इलेक्ट्रोफिजियोलॉजी के लिए कोशिकाओं को उत्पंन विधि की आवश्यकता है । सैनिक उपकला की प्राथमिक संस्कृतियों परंपरागत रूप से कम अस्तित्व के कारण मुश्किल हो गया था. इस प्राप्त कारक को समाप्त, वर्तमान विधि या तो छोटे या बड़े आंत्र है कि कई दिनों के लिए जीवित करने में सक्षम है से एकवचन चुनाव आयोग कोशिकाओं की संस्कृतियों पैदावार ।

हमने पाया है कि निंनलिखित संस्कृतियों की गुणवत्ता में सुधार के लिए महत्वपूर्ण इलेक्ट्रोफिजियोलॉजी के लिए उपयुक्त हो: (1) के बजाय यह छीलने म्यूकोसा औंधा, (2) पाचन मीडिया को BSA की एक छोटी राशि जोड़ने और संस्कृति मीडिया को FBS, (3) कम Collagenase ग्यारहवीं एकाग्रता, (4) संख्या और एकल कोशिकाओं के स्वास्थ्य को बढ़ाने के लिए यांत्रिक आंदोलन की अवधि और तीव्रता समायोजन, (5) एक कम एकाग्रता पर extracellular मैट्रिक्स चढ़ाना, और (6) रॉक अवरोध करनेवाला के साथ संवर्धन.

इसी प्रकार, निम्नलिखित रूपांतरों पैच clamping जबकि पूरे कोशिकाओं को प्राप्त करने के लिए महत्वपूर्ण थे: (1) अच्छी तरह से सीरम मुक्त extracellular समाधान के साथ संस्कृतियों धोने, (2) ईसी कोशिकाओं को दे extracellular समाधान के लिए में खड़े हो जाओ कम से 4 ज, (3) फिर से किसी भी खर्च इलेक्ट्रोड purposing-असफल जवानों से उन लोगों की तरह-दूर मलबे स्पष्ट करने के लिए अगले ईसी सेल के मार्ग, (4) जोड़ने 10 µ एम Gd3 + extracellular समाधान के लिए ब्लॉक लीक धाराओं (यदि वर्तमान) और स्तनधारी सेल के पालन की सुविधा के लिए कांच के लिए सस्पेंशन । हम सावधानी, तथापि, कि Gd3 + वोल्टेज ब्लॉक सकता है-gated सीए2 + और/या mechanosensitive चैनलों ईसी सेल में व्यक्त की ।

ध्यान से संवर्धन शर्तों को अनुकूलित होने के बावजूद, हम कुछ सीमाएं मिल: चुनाव आयोग कोशिकाओं को 24 घंटे की जरूरत है पूरी तरह से अभी तक के बाद समाप्त करने के लिए संलग्न ~ ७२ h संस्कृति में; इसलिए, वे एक ४८ घंटे की खिड़की है जब वे electrophysiological प्रयोगों के लिए उपयुक्त होगा । क्योंकि झुरमुट कोशिकाओं अक्सर समाई यात्रियों कि रिकॉर्डिंग से मुआवजा नहीं किया जा सकता परिचय, एकल ईसी सेल की पीढ़ी के महत्वपूर्ण हैं । हालांकि, उपकला से चुनाव आयोग कोशिकाओं को अलग करके, कोशिकाओं तो एक गैर-देशी वातावरण में रहते हैं (यानी, एक कृत्रिम तहखाने झिल्ली के रूप में extracellular मैट्रिक्स के ऊपर भ्रूण गोजातीय सीरम और रॉक अवरोधक के साथ उच्च ग्लूकोज मीडिया) और जवाब दे सकता नहीं पूरी तरह से vivo मेंचुनाव आयोग सेल समारोह के प्रतिनिधि उत्तेजनाएं । इन सीमाओं के बावजूद, चुनाव आयोग कोशिकाओं के प्राथमिक संवर्धन अभी भी अपने शरीर क्रिया विज्ञान में अंतर्दृष्टि प्रदान करता है ।

चुनाव आयोग कोशिकाओं को एक अच्छी तरह से काम कर रहे सैनिक पथ और शरीर को बनाए रखने में एक महत्वपूर्ण भूमिका निभाते हैं, और जैसे, वहां कई ईसी सेल इलेक्ट्रोफिजियोलॉजी के बारे में समझ हासिल करने के लिए विकसित तरीकों गया है । Enteroendocrine और चुनाव आयोग सेल इलेक्ट्रोफिजियोलॉजी में जांच की थी अमर सेल मॉडल5,8,13, प्राथमिक ईसी सेल संस्कृतियों से गिनी पिग11, और माउस3,4, हमारे विधि एक संस्कृति है कि ंयूनतम संसाधित किया गया है और देशी ईसी कोशिकाओं को दर्शाता है बनाने के लिए सेल गुणवत्ता संरक्षण विधियों का इस्तेमाल करता है । हम एक ट्रांसजेनिक माउस मॉडल, Tph1-, कि कोशिका द्रव्य में एक सियान प्रतिदीप्ति जब Tph1 मौजूद है9से पता चलता है का उपयोग करें । इस विधि अंय रिपोर्टर या वंश-traced enteroendocrine सेल प्रकार के लिए भी इस्तेमाल किया जा सकता है । हमारी विधि भी कम से कम समय और एंजाइमी उपचार में एकल ईसी कोशिकाओं के अलगाव को पूरा, के रूप में कोशिकाओं को ही एक सौंय Collagenase ग्यारहवीं के लिए संपर्क कर रहे है ०.१ मिलीग्राम/एमएल (jejunum) और ०.६ मिलीग्राम/एमएल (बृहदांत्र) के एक ंयूनतम से अधिक एक घंटे के लिए । इन संशोधनों का परिणाम है एक संस्कृति है कि चुनाव आयोग कोशिकाओं के electrophysiological अध्ययन के लिए अनुकूलित किया गया है ।

हम सफलतापूर्वक murine ईसी सेल3में इलेक्ट्रोफिजियोलॉजी और सेरोटोनिन रिलीज का अध्ययन करने के लिए इस विधि का इस्तेमाल किया है । सफलतापूर्वक अलग करने की क्षमता, पहचान, और संस्कृति एकल ईसी सेल चुनाव आयोग कोशिका फिजियोलॉजी पर अध्ययन में महत्वपूर्ण भविष्य के निर्देशों की सुविधा । इस विधि आगे महत्वपूर्ण रास्ते और सेरोटोनिन और अन्य चुनाव आयोग सेल विशेष ट्रांसमीटरों के ईसी सेल exocytosis में शामिल चैनलों का निर्धारण करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है । विधि भी अलग और ईसी सेल पहचान13के लिए acridine ऑरेंज के उपयोग के साथ मानव ईसी सेल के फिजियोलॉजी की विशेषता को संशोधित किया जा सकता है ।

सबसे वैज्ञानिक प्रोटोकॉल विकास के साथ के रूप में, संचार और निष्पक्ष टिप्पणियों इस प्रोटोकॉल के निवारण में महत्वपूर्ण थे । जब हम अपनी संस्कृतियों के अस्तित्व के लिए नई संस्कृति तरीकों का परीक्षण किया, यह व्यवहार्यता का एक उपाय के रूप में फ्लोरोसेंट कोशिकाओं की संख्या गिनती मददगार था, प्रत्येक डिश में अनुमान सेल घनत्व, और प्रतिनिधि तस्वीरें इकट्ठा और कई समय में संस्कृतियों के वीडियो अंक. कोशिकाओं के बाद पिछले 24 संस्कृति में एच जीवित रहने में सक्षम थे, हम इलेक्ट्रोफिजियोलॉजी प्रयोगों के लिए हमारी संस्कृतियों को संशोधित करने पर काम किया । छवियों और विस्तृत टिप्पणियों का संग्रह करने के साथ साथ, यह यांत्रिक पाचन और पूरक और/या सब्सट्रेट सांद्रता के लिए समायोजन के बारे में प्रयोगशाला कर्मियों के बीच स्पष्ट संचार बनाए रखने के लिए महत्वपूर्ण था, ताकि स्वस्थ चुनाव आयोग कोशिकाओं को तैयार थे electrophysiological लक्षण वर्णन के लिए ।

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Disclosures

कोई

Acknowledgments

लेखकों ने प्रशासनिक सहायता के लिए श्रीमती Lyndsay Busby का शुक्रिया अदा किया और श्री रॉबर्ट Highet को मेयो क्लिनिक डिविजन ऑफ इंजीनियरिंग से डिजाइन और कल्चरल डिश डालने के 3डी प्रिंटिंग के लिए धन्यवाद दिया । यह काम NIH K08 द्वारा अटल बिहारी (DK106456), पायलट और के लिए व्यवहार्यता अनुदान के लिए मेयो क्लिनिक सेंटर से गैस्ट्रोएंटरोलॉजी में संकेतन (NIH P30DK084567) और २०१५ अमेरिकन Gastroenterological एसोसिएशन अनुसंधान विद्वान पुरस्कार (आगा RSA) अटल बिहारी और NIH R01 GF (DK52766) ।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
100 mm x 15 mm culture dish Corning (Falcon) 351029
Transfer Pipette Fisherbrand 13-711-7M
10 mL serological pipette Corning (Falcon)  357551
50 mL Conical Corning (Falcon)  352098
15 mL Conical Corning (Falcon)  352097
1,000 mL Barrier Pipet Tips Thermo Scientific (Art) 2079E Keep sterile
MatTek Glass Bottom Dishes MatTek Corporation P35G-1.5-14-C Keep sterile
Micro-dissection Forceps - Very Fine, Extra-Long Points Fine Science Tools SB12630M
Surgical Scissors-Sharp Nasco 14002-14
Micro-Dissection Scissors Nasco SB46568M
Monoject Hypo Needle, 21 G x 1" A, 100/BX Covidien 8881250172
 Tg(Tph1-CFP)1Able/J Mice Jackson Stock # 028366 Use male or female mice between the ages of 4-7 weeks
Microfil nonmetallic syringe needles (34 gauge, 67 mm) World Precision Instruments MF34G-5
Parafilm "M" Laboratory Film Pechiney Plastic Packaging
R6101 Dow Corning
6 mL syringe with regular luer tip Monoject
3 mL syringe with regular luer tip Monoject
Electrophysiology Equipment
Amplifier Molecular Devices Axopatch 200B
Data acquisition system (daq) Molecular Devices Digidata 1440A
Signal conditioner Molecular Devices CyberAmp 320
Software Molecular Devices pClamp 10.6

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References

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प्राथमिक संस् Murine Enterochromaffin कक्षों की संपूर्ण कक्ष इलेक्ट्रोफिजियोलॉजी
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Knutson, K., Strege, P. R., Li, J., Leiter, A. B., Farrugia, G., Beyder, A. Whole Cell Electrophysiology of Primary Cultured Murine Enterochromaffin Cells. J. Vis. Exp. (139), e58112, doi:10.3791/58112 (2018).

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