Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

A cellula intera elettrofisiologia di cellule enterocromaffini murino coltura primaria

Published: September 26, 2018 doi: 10.3791/58112
Automatic Translation
*1, *1, 2, 2, 1, 1
1Enteric Neuroscience Program, Division of Gastroenterology & Hepatology,Department of Physiology & Biomedical Engineering, Mayo Clinic, 2Division of Gastroenterology, Department of Medicine, University of Massachusetts Medical School
* These authors contributed equally

Summary

Cellule enterocromaffini (EC) comprendono un piccolo sottoinsieme delle cellule epiteliali gastrointestinali. Dalle cellule EC sono elettricamente eccitabili e rilascio della serotonina, ancora difficoltà nella coltura e nell'identificazione di cellule EC hanno limitato gli studi fisiologici. Il metodo presentato qui stabilisce un modello di cultura primaria suscettibile di esame delle singole cellule EC di elettrofisiologia.

Abstract

Cellule enterocromaffini (EC) nell'epitelio gastrointestinale (GI) costituiscono la più grande sottopopolazione delle cellule enteroendocrine. Come le cellule sensoriali specializzate, cellule EC percepiscono stimoli luminal e convertono in eventi di rilascio di serotonina (5-hyroxytryptamine, 5-HT). Tuttavia, l'elettrofisiologia di queste cellule è capito male perché sono difficili per cultura e per identificare. Il metodo presentato in questa carta contorni primaria CE, colture cellulari ottimizzati per elettrofisiologia singola cella. Questo protocollo utilizza un reporter transgenici ciano proteina fluorescente (CFP) per identificare le cellule di topo CE in colture miste di primarie, avanzando l'approccio per ottenere registrazioni di alta qualità di elettrofisiologia di tutta la cella in modalità di morsetto di tensione e di corrente.

Introduction

L'epitelio gastrointestinale (GI) è una comunità variegata composta da diversi tipi di cellule. Le cellule enteroendocrine costituiscono circa 1% di tutte le cellule epiteliali e cellule enterocromaffini (EC) sono il più grande popolazione di cellule enteroendocrine1. Studi recenti dimostrano che ce3,4 cellule enteroendocrine2 e sono elettricamente eccitabili. Siamo interessati a capire primario elettrofisiologia cellulare di CE. Così, lo scopo di questo studio era di stabilire colture primarie di cellule CE ottimizzati per elettrofisiologia tutta la cella.

Cella CE esistente linee che producono e secernono 5-HT (ad es., QGP-15, BON6, KRJ-17) e sono state usate per esaminare l'elettrofisiologia5,8 vengono tipicamente generate da immortalato neoplastici tessuti. Mentre le informazioni acquisite da queste linee cellulari sono prezioso5,8, studi di elettrofisiologia cellulare primaria sono necessari per comprendere correttamente la fisiologia cellulare CE. L'elettrofisiologia di cellule primarie CE richiede l'isolamento e coltura di singole cellule epiteliali, che è stato limitato dalla bassa redditività delle culture epiteliali.

Il metodo di cultura presentato in questo studio si basa sui topi transgenici con fluorescente identificati dalle cellule EC, come Tph1-CFP9, utilizzato in questo studio. Il metodo ottimizza primaria misto epiteliali colture sviluppate in precedenza2,10 per singola cella elettrofisiologia3. Metodi precedenti utilizzate combinazioni di tripsina/EDTA plus A collagenosi o EDTA e DTT per digestione enzimatica e utilizzato gradienti di densità per isolare in modo specifico e cultura-cavia11 e ratto CE cellule12. Più recentemente, organoids intestinale sono stati generati e meccanicamente interrotta per registrazioni elettrofisiologiche4. Culture, usando questi metodi sono adatte per esperimenti, analisi di RT-qPCR di rilascio di serotonina e, mentre potrebbero essere usati per elettrofisiologia, fanno affidamento sul successo della generazione organoid che richiede tempo, gradienti di densità per identificare cellule EC e la effetti cellulari e dirompenti di tripsina ed EDTA. Al contrario, il protocollo descritto qui migliora trattamenti enzimatici e meccanici, ottimizza le condizioni di coltura e semplifica le procedure per produrre cellule EC di singole e sane adatte per gli elevati standard cellulari necessari per elettrofisiologia.

Questo metodo sarà utile per gli scienziati che vogliono lavorare su cellule primarie di CE in colture miste anziché culture immortalizzate e vuole indagare l'elettrofisiologia delle singole cellule. Tuttavia, può rivelarsi meno appropriato per lo studio di popolazioni di cellule che hanno bisogno di colture di ordinamento o a lungo termine che richiedono sopravvivenza ultime 72 ore.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Tutti i metodi descritti qui sono stati approvati dal istituzionale Animal Care e uso Committee (IACUC) della Mayo Clinic. La parte di cultura cellula primaria di questo protocollo è basata su metodi pubblicati in precedenza che è possibile fare riferimento per ulteriori dettagli10. Tutte le procedure sperimentali devono essere approvate da (IACUC), e tutti gli esperimenti devono essere eseguiti conformemente alle norme e linee guida pertinenti.

1. preparazione cultura

  1. Media.
    1. Preparare terreni di coltura completo cella CE con alto glucosio per volta Eagle Medium (DMEM di [4500mg/L] quotazioni Dulbecco) completati con 5% di siero bovino fetale (FBS), 1% L-Glutammina e 1% penicillina-streptomicina (tabella 1).
      Nota: Media può essere memorizzato a 4 ° C fino ad un mese.
    2. Filtrare i terreni di coltura CE completo cella e inserire 25 mL di media in un tubo da 50 mL a 37 ° C.
    3. Preparare il supporto di digestione con alto glucosio [4.500 mg/L] DMEM completate con 0,1% albumina di siero bovino (BSA) (tabella 1).
    4. Filtrare i media di digestione e inserire quattro aliquote di 10 mL di media in provette separate da 50 mL e incubare a bagnomaria a 37 ° C.
      Nota: Media può essere memorizzato a 4 ° C fino ad un mese.
  2. Enzima.
    1. Pesare 4 mg (digiuno) o 24 mg (due punti) di collagenasi XI [≥ 800 unità/mg] in una microcentrifuga da 1,5 mL.
      Nota: La collagenasi sono stabile a-20 ° C fino ad un anno.
    2. Risospendere l'aliquota in 1 mL di PBS freddo ghiaccio con Ca2 + e Mg2 +collagenasi. Vortice la soluzione per combinare accuratamente e metterli su ghiaccio.
  3. Piastre di coltura del rivestimento.
    1. Scongelare i 150 µ l di matrice extracellulare durante la notte a 4 ° c sul ghiaccio.
    2. Fare una soluzione di 5% w/v matrice extracellulare mescolando 100 µ l di matrice extracellulare scongelata con 2 mL di DMEM privo di siero alto-glucosio ghiacciato.
      Nota: Matrice extracellulare si solidifica a temperatura ambiente e deve essere maneggiata con pipette pre-refrigerati, tubi e media fino al momento di cappotto piatti.
    3. Immediatamente cappotto il cerchio interno di vetro di piatti 35 mm con fondo di vetro con 250 µ l di soluzione di matrice extracellulare al 5%. Questa ricetta coprirà fino a 8 piatti.
    4. Posizionare i piatti con fondo di vetro in un incubatore a 37 ° C durante la procedura di isolamento di cultura cellulare. La matrice extracellulare richiede un minimo di 1 h per impostare, ma possono essere incubate per fino a 2,5 h durante l'esecuzione di altre procedure di isolamento.
      Nota: Incubazioni più di 3 h può creare un accumulo di matrice extracellulare che potrebbe ostacolare la guarnizione formazione durante elettrofisiologia tutta la cella.

2. tessuto isolamento

  1. Secondo orientamenti etici, sacrificio un 3per 6 settimana-vecchio maschio o femmina Tph1-CFP transgenico del topo (The Jackson Laboratory Stock: 028366)9 o un altro ceppo di reporter.
    Nota: Utilizziamo una dose fatale di innalzamento del livello di anidride carbonica e una dislocazione cervicale come un secondario significa garantire la morte. Il Comitato di AVAM sull'eutanasia ritiene dislocazione cervicale un metodo consentito eutanasia primario da individui addestrati nel suo utilizzo, se gli animali sono prima sedati.
  2. Appuntare il mouse eutanasizzato fuori su un palco di dissezione di polistirene espanso usando gli aghi 21G. Decontaminare l'addome del mouse con etanolo al 70%.
  3. Tirare la pelle del topo tesa utilizzando micro-dissezione forcipe (#5) e quindi utilizzare forbici chirurgiche per fare un'incisione trasversale nella parte inferiore dell'addome del mouse per esporre la cavità intraperitoneale. Fare un'altra incisione verticalmente fino all'addome fino a quando la gabbia toracica è esposto.
  4. Utilizzare il forcipe micro-dissezione per spostare l'intestino cieco a sinistra del mouse per raggiungere una visione chiara del colon.
  5. Utilizzare le micro-dissezione Forbici per tagliare la porzione più distale del colon (ma ancora prossimale al retto) e fare un secondo taglio distale allo stomaco. Luogo pieno di intestini estratti in un 100 x 15 mm2 piastra di Petri con 20 mL di fosfato ghiacciato tampone salino (PBS).
  6. Utilizzare un piccolo righello per misurare e tagliare 10 cm di una metà del colon o digiuno. Estratto del colon misurando il segmento di 10 centimetri di intestino situato proximally al primo taglio preso sopra il retto. Identificare il digiuno piegando l'intero piccolo intestino a metà e facendo una prima incisione a metà del percorso e una seconda incisione 10 cm prossimale al primo taglio.
    Nota: Continuare a eseguire tutte le operazioni di isolamento successivo sul ghiaccio.
  7. Riempire una siringa da 6 mL con PBS freddo ghiaccio e inserire l'ago della siringa nel lumen del segmento intestinale Estratto. Utilizzare il forcipe micro-dissezione per bloccare e sigillare gli intestini intorno all'ago di siringa e lavare delicatamente 10 mL di PBS attraverso il lume di sciacquare via materia fecale.
  8. Invertire il tessuto intestinale dolcemente il forcipe micro-dissezione attraverso il lume di tessitura, pizzicando una parete intestinale, e ritraendo il tessuto prossimale fino alla punta delle pinze. Ripetere questo processo fino a quando il segmento è dentro-fuori con il lume verso l'esterno.
  9. Utilizzare micro-dissezione Forbici per tagliare il segmento di tessuto in pezzi di 1 cm.
  10. Utilizzare pinze per micro-dissezione per trasferire i segmenti di tessuto in un becher da 50 mL riempita con 5 mL di PBS sterile. Utilizzare le forbici micro-dissezione per tritare i pezzi di tessuto per ottenere una consistenza liquefatto.
  11. Posizionare il tessuto macinata e 15 mL di PBS freddo ghiaccio in una provetta pulita 50 mL di pipetta. Triturare 2 volte con la pipetta, attendere che il tessuto per stabilirsi, 15 mL del surnatante PBS di rimuovere e sostituire con PBS fresco. Ripetere questo processo tre volte il PBS è chiaro.
  12. Posizionare il tubo da 50 mL con pezzi di tessuto lavato sul ghiaccio e portare il secchiello del ghiaccio in una cappa di coltura del tessuto.

3. enzimatica e meccanica la digestione

  1. Prima digestione
    1. Dal bagno di acqua, recuperare uno dei tubi 50 mL contenente 10 mL di media di digestione pre-riscaldato. Per il tubo da 50 mL, aggiungere 250 µ l della soluzione di PBS collagenosi e pezzi di tessuto intestinale macinate.
      Nota: fare attenzione a evitare di includere qualsiasi PBS da precedenti passaggi del lavaggio.
    2. Posizionare il tubo da 50 mL in un bagno d'acqua per 5 minuti (colon o digiuno) a 37 ° C. Agitare il tubo 2 x / min.
      Nota: Il timing ottimale e l'intensità di digestione meccanica possono variare e dovrà essere determinata dall'utente. Per determinare le condizioni di una digestione ottimale, un'aliquota di 10 µ l di cellule può essere visualizzata dopo ogni digestione. Durante la digestione 1, il surnatante dovrebbe consistere di grumi di cellule.
    3. Lentamente e triturare il tessuto una volta con una pipetta sierologica di 10 mL. Brevemente lasciate il tessuto pezzi stabilirsi, quindi utilizzare una pipetta di trasferimento per rimuovere l'intero 10 mL di surnatante.
  2. Secondo la digestione: ripetere i passaggi da 3.1.1 a 3.1.3. Aumentare il tempo di incubazione di 10 min se digestione del colon e mantenere il tempo di incubazione a 5min per digiuno.
    Nota: Al momento dell'osservazione, il surnatante ancora dovrebbe consistere di grandi ciuffi di cellule.
  3. Terza digestione
    1. Ripetere il punto 3.1.1
    2. Posizionare il tubo da 50 mL in bagnomaria a 37 ˚ c per 10 min (colon o piccolo digiuno). Agitare la provetta 2-3 volte al minuto a un'intensità più elevata rispetto a digestioni 1 e 2.
    3. Lentamente di dispensare il tessuto su e giù con una pipetta sierologica di 10 mL. Consentire i pezzi di tessuto di stabilirsi per un breve periodo.
      Nota: Il surnatante dovrebbe consistere di una combinazione di singole cellule e piccoli ciuffi.
    4. Utilizzare una pipetta di trasferimento per inserire 10 mL del surnatante in una nuova provetta da 15 mL, aggiungere 2 mL di riscaldato CE cella completa cultura media e invertire una volta per mescolare.
    5. Spin a 100 x g per 5 min a temperatura ambiente, quindi utilizzare una pipetta di trasferimento per rimuovere il surnatante. Utilizzare una pipetta di trasferimento per risospendere in 2,5 mL di terreni di coltura riscaldato CE cella completo.
  4. Quarta digestione: ripetere i passaggi da 3.3.1 a 3.3.5. Aumentare il tempo di incubazione di 15 min per colon e rimangono a 10 min per il digiuno.
    Nota: Il surnatante ora dovrebbe consistere di singole cellule.

4. coltura cellulare

  1. Utilizzare una pipetta di trasferimento per combinare le sospensioni cellulari raccolte da digestioni 3 e 4 in una nuova provetta da 15 mL (volume totale di 5 mL).
  2. Rimuovere un'aliquota di 10 µ l di cellule di contare con un emocitometro e filare la sospensione delle cellule rimanenti a 100 x g per 5 min a temperatura ambiente.
    Nota: La sospensione cellulare finale sarà composto di piccoli ciuffi e cellule singole.
  3. Rimuovere il surnatante con una pipetta di trasferimento e risospendere il pellet in CE cella completa di coltura ad una densità di 1.000.000 cellule per mL.
    Nota: Il volume finale della sospensione cellulare dipenderà il conteggio finale delle cellule. Tipica cellula conta vanno da 2.000.000 a 4.000.000.
  4. Togliere i piatti di cultura con fondo di vetro rivestito dall'incubatrice. Utilizzare una pipetta P1000 per sostituire la matrice extracellulare da ogni piatto di cultura con 250 µ l di sospensione cellulare finale.
    Nota: Il rivestimento di matrice extracellulare tende ad attaccarsi ai bordi del piatto con fondo di vetro. Deve prestare particolare attenzione a rimuovere il rivestimento dal lungo il bordo per prevenire l'accumulo di gel.
  5. Preparare una soluzione stock di inibitore di ROCK Y-27632 a 1 mM. Aggiungere 2,5 µ l di soluzione di riserva ad ogni piatto fondo di vetro per ottenere una concentrazione di lavoro dell'inibitore ROCK 10 µM in ogni piatto.
    Nota: Questo passaggio è fondamentale per la sopravvivenza delle culture di digiuno ma è facoltativo per i due punti.
  6. Posizionare ogni piatto di cultura in incubatore 37 ° C e 5% CO2 per 24-72 h (Figura 1).

5. preparazione di cellule EC per tutta la cella elettrofisiologia

  1. Linea il diametro interno della fase microscopio con due strisce di 5 x 0,5 cm di pellicola di cera per creare un o-ring. Montare la piastra di coltura cellulare di 35 mm all'interno dell'o-ring (Figura 2A-B).
  2. Risciacquare entrambi detriti galleggianti, matrice extracellulare non collegata o le cellule morte e siero di terreni di coltura completamente lontano CE cellule per impedire o da ostacolare guarnizione formazione tra la cella di CE e l'elettrodo. Uso delle tre opzioni seguenti per raggiungere cella completa di lavaggio sufficiente per elettrofisiologia:
    1. Opzione 1: Soluzione exchange è più efficiente in un alloggiamento lungo piu ' di una circolare dell'alloggiamento. Poiché le cellule EC sono state coltivate in piatti rotondi 35 mm, creare un inserto ellittico in plastica per il piatto.
      1. Creare l'inserto dalla stampa 3D o da metodi di fresatura tradizionale. L'inserto che abbiamo usato è stato lavorato da plastica acrilica con le seguenti dimensioni (in mm): diametro esterno, 34.5; ellisse interna, 20 x 9; Altezza esterna, 10; Altezza interna, 1,5; portata di ponte, 3 x 3; gioco del ponte, 1,5; entrata ed uscita, 4 x 4.
      2. Abbassare l'inserto nella piastra di coltura (Figura 2A-B) e fissarlo alla parte superiore del tavolino del microscopio con due pezzi di 0,15-0,2 g di modellazione argilla pressata 1.2 x 0.3 x rettangoli di 0,1 cm (Figura 2A-C).
      3. Con una pipetta di trasferimento in plastica, aggiungere lentamente soluzione extracellulare su un lato del piatto (in entrata) mentre ad aspirazione dal lato opposto (outlet).
    2. Opzione 2: Senza un inserto in plastica ingegnerizzato, aggiungere soluzione extracellulare di pipette di trasferimento da un lato del piatto (in entrata) mentre ad aspirazione dal lato opposto (outlet). Ruotare lentamente la posizione della pipetta di trasferimento (ad es., N e a S) mentre il mirroring il posizionamento dell'ago aspirazione sul lato opposto (ad es., S a W a N).
    3. Opzione 3: Cappotto tabella extracellulare su vetrini coprioggetto rettangolari al punto 1.3.3. e la sospensione cellulare su questi vetrini coprioggetti al punto 4.4 della coltura. Trasferire questo vetrino coprioggetto un vano rettangolare riempito con soluzione extracellulare, saltando il punto 5.1 e saltando il punto 5.3. Sciacquate la vaschetta con la soluzione extracellulare di una pipetta di trasferimento in plastica, come descritto nell'opzione 1 (5.2.1.3).
  3. Fissare nuovamente il palco con la coltura delle cellule sopra il microscopio invertito (Figura 2D). Incubare la coltura delle cellule EC nella soluzione extracellulare privo di siero a temperatura ambiente.
  4. Dopo 4 ore, sciacquare la cultura nuovo con soluzione extracellulare come descritto sopra. Procedere con elettrofisiologia tutta la cella.

6. tutta la cella elettrofisiologia di cellule EC da coltura primaria

  1. Raggiungimento di una cellula intera Giga-seal
    1. Tirare una dozzina gli elettrodi ad una resistenza di 1 – 5 MΩ.
      Note: Pipette di resistenza di 1 – 2 MΩ che producono 10-100 GΩ guarnizioni le migliori prestazioni. Fuoco le punte dell'elettrodo di lucidatura non è necessario realizzare guarnizioni GΩ.
    2. Cappotto in modo uniforme il cono di naso di tutte le pipette con polimero. Tenere la pipetta in posizione orizzontale per terra e perpendicolare alla parte anteriore di una pistola di calore. Ruotare lentamente la pipetta fino a quando il polimero si indurisce.
    3. Versare una parte aliquota della soluzione intracellulare in una provetta conica da 15 mL. Trasferimento 1,2 mL di questa soluzione in una provetta da microcentrifuga da 1,5 mL tramite siringa 1 mL. Un altro 0,7 mL di soluzione intracellulare aspirare con la siringa. Dissipare l'aria dall'estremità della siringa. Collegare un flessibile G 34 67 mm ago alla siringa e scovare eventuali residui di aria da questo ago.
    4. Identificare un Tph1-CFP + cella che non è a contatto con altre cellule o detriti.
    5. Riempire la punta dell'elettrodo con la soluzione intracellulare. Recupero informazioni la pipetta dalla siringa. Scorri attentamente la pipetta con un'unghia per dissipare l'interfaccia di bolla di aria.
    6. Con lo stantuffo redatto con 0,3 mL di aria, collegare una siringa da mL 6 all'uscita del titolare della tubazione. Montare l'elettrodo nel supporto.
      Nota: Collegare la siringa al tubo prima che l'elettrodo entri la soluzione del bagno per mantenere la pressione neutra o positiva all'interno della soluzione intracellulare prima della sigillatura.
    7. Caricare un protocollo di tensione-morsetto in due fasi che registra correnti d'attivazione allo steady-state di una scala di tensione sul primo gradino e registra le correnti disponibili da un'unica tensione sul secondo gradino. Aprire il test di tenuta (5 mV 50 kHz).
    8. Abbassare l'elettrodo nella soluzione di bagno. Con i micromanipolatori, manovrare l'elettrodo punta in piano con e orizzontale direttamente dalla cella. Espellere i 0,3 mL di aria dalla siringa.
    9. Spostare delicatamente l'elettrodo orizzontalmente lungo l'asse x per toccare la cella. Guarda per una fossetta a comparire sulla cella CE e/o un aumento nella resistenza di membrana sulla prova di tenuta. Se necessario, regolare di nuovo l'elettrodo giù lungo l'asse z e/o orizzontalmente lungo l'asse x, non si muove oltre la linea mediana della cella.
    10. Applicare 0,1 – 0,2 aspirazione mL sulla siringa 6 mL. Tenere premuto lo stantuffo costante fino a 100 MΩ è raggiunto, quindi rilasciare la presa dallo stantuffo. Attendere che la cella a giga-seal. Staccare delicatamente la siringa con un movimento di svitamento.
      Nota: Se una cella CE non sigillare inizialmente, potrebbe essere possibile sigillare nuovamente con un tentativo successivo. Per effettuare questa operazione, tirare delicatamente l'elettrodo esterno una cella CE con < 20 resistenza di tenuta MΩ. Sterzo l'elettrodo esaurito con i micromanipolatori, circumnavigare la cella CE mirata a matrice manualmente chiaro via o detriti. Quindi, il tentativo di sigillare la cella CE con un elettrodo di fresco.
  2. Record a cellula intera tensione-gated Na+ corrente.
    1. Collegare una siringa da 3 mL redatta con 0,5 – 1,0 aria mL. Applicare un colpetto rapido di aspirazione (0,1 – 0,5 mL) su una siringa da 3 mL. Ripetere finché non si ottiene accesso a cellula intera, quindi staccare delicatamente la siringa.
      Nota: poiché le prestazioni di una siringa possono variare inizialmente e cambiano gradualmente con il tempo e l'uso, pratica in anticipo con la siringa da 3 mL (sigillando l'estremità con un dito indice) per assicurarsi che lo stantuffo sarà rinculo entro 0,1 – 0,2 mL di iniziare la sua posizione. Se così non fosse, poi scambiare la siringa per uno nuovo.
    2. Attivare la compensazione di capacitanza a cellula intera. Regolare la serie della capacità e della resistenza. Attivare la compensazione della resistenza serie. Ritardo impostato a 60 ms, regolare la compensazione serie resistenza previsto poi corretto. Chiudere la prova di tenuta.
    3. Registrare una media di 5 piste di corrente di cellule intere tensione-gated Na+ (Figura 3A).
    4. Rapidamente prendere nota di due parametri di corrente tensione-gated di Na+ : la tensione alla finestra corrente (Figura 3B, simboli rossi, l'intersezione delle curve di attivazione e inattivazione allo steady-state) e la corrente di picco Na+ densità.
      Nota: CE le cellule con correnti di picco Na+ più di pA-50 in modalità di tensione morsetto comunemente andrà a fuoco potenziali hanno suscitati in modalità corrente del morsetto. Inoltre, correnti superiori a pA-200 nel morsetto di tensione (Figura 3A) allora solitamente fuoco potenziali di azione spontaneamente a pinza amperometrica da potenziali di membrana (linea rossa, Figura 3D) vicino la tensione della finestra corrente (simboli rossi, Figura 3B).
  3. Record ha suscitato i potenziali di azione.
    1. Disattivare la compensazione della resistenza serie. Disattivare il comando esterno. Cambiare la modalità da V-clamp-morsetto. Regolare il guadagno. Caricare un protocollo attuale episodica di morsetto. Regolare la quantità di corrente a 0 di mantenimento PA. Attivare il comando esterno.
      Attenzione: Non accendere da V-clamp-Morsetto (o viceversa) senza prima spegnere il comando esterno.
    2. Nota il potenziale di membrana di riposo. Regolare la corrente di mantenimento input in modo che il potenziale di membrana legge sotto la finestra corrente (ad es., -80 a -100 mV). Regolare il protocollo corrente episodica di morsetto in modo che l'intervallo di passaggio della corrente di ingresso è inferiore al valore di corrente di mantenimento (inserto diC nella figura 3, + 2 passaggi di pA PA-3 corrente di tenuta).
    3. Record ha suscitato i potenziali di azione. Si noti la quantità minima di corrente iniettata per fuoco spento un potenziale di azione (Figura 3C, sweep 3 di 5, un passo + 4 pA da pA-3 holding = pA + 1).
  4. Registrare i potenziali di azione spontanei.
    1. Disattivare il comando esterno. Caricare un protocollo morsetto attuale gap-free (non episodico).
      Nota: Non accendere il comando esterno indietro fino a quando la quantità di detenzione corrente nel protocollo morsetto privo di divario attuale è stata verificata per essere adatto per la cella.
    2. Modificare la corrente di essere la quantità di corrente iniettata nell'ultima operazione nel protocollo hanno suscitato che non è stato generato un potenziale di azione di mantenimento (Figura 3D, l'ingresso di corrente durante la seconda sweep, un passo + 2 pA da pA-3 holding =-1 pA).
    3. Attivare il comando esterno. Controllare che la corrente di mantenimento previsto porta la membrana potenziale sotto la soglia di un potenziale di azione del fuoco. Se necessario, regolare la corrente di mantenimento. Registrare l'attività spontanea.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Culture:
Cellule epiteliali murine primarie effettuate in un modello transgenico Tph1-CFP allegare ai piatti dopo 4 ore e sono pronte per esperimenti fisiologici tra 24-72 h. Quando le condizioni di coltura non avevano state ottimizzate, la coltura delle cellule epiteliali ha consistito di grandi ciuffi, galleggiante di detriti cellulari, membrane danneggiate e segnale debole di PCP nelle cellule CE (Figura 1A). Culture che sono state ottimizzate per elettrofisiologia è costituito da cellule singole e piccoli ciuffi. Le cellule sane del CE sono state identificate prontamente tramite fluorescenza brillante di PCP e avevano ancora aderito al piatto dopo il lavaggio vigoroso (Figura 1B).

Elettrofisiologia:
Le cellule intere CE sono state ottenute solo 15 ± 4% di tentativi da culture del colon senza inibitore ROCK (29 intere cellule fuori 182 tentativi da 22 culture) ma 30 ± 7% di tentativi da culture del colon con inibitore ROCK (27 celle intere fuori 102 tentativi da 50 culture) (< C1 > figura 4A; p < 0,05 da una a due code non parametrico t-prova, culture del colon senza vs con inibitore di roccia). Allo stesso modo, digiuno CE le cellule senza inibitore di roccia non è sopravvissuto abbastanza a lungo per elettrofisiologia, mentre ce le cellule intere sono state ottenute su 41 ± 3% di tentativi dalla cultura di digiuno con inibitore ROCK (186 intere cellule fuori 447 tentativi da 50 culture) (Figura 4A; p > 0,05 da una a due code non parametrico t-test, digiuno vs colon con inibitore di roccia).

Di elettrofisiologia a cellula intera, correnti di Na+ sono state registrate in modalità tensione-morsetto e potenziali d'azione (AP) in modalità di corrente-morsetto. Correnti di na+ sono state registrate da 81,3% di ±4.0 di TPH1-CFP + cellule dal digiuno o 64,1% di ±9.2 da due punti3. Di 59 cellule EC da culture di digiuno confermate dalla tensione-morsetto per avere correnti di picco Na+ più grande pA-25, 19 cellule EC in modalità corrente-morsetto licenziato spontanea AP ("spontanea"), 29 cellule EC licenziato AP solo quando suscitata da un protocollo di passaggio in corrente-morsetto modalità ("ha suscitato solo") e 11 cellule EC non fuoco AP spontaneamente o da passo protocollo ("non sparare") (Figura 4B). Spontanee cellule hanno avute una picco medio Na+ densità di corrente (Ipicco) di -108.0 ±19.3 pA/pF, cellule sola ha suscitato un io ha avutopicco di-60.2 ±9.2 pA/pF, mentre le cellule non sparare un io ha avutopicco di-43.3 ± 14 pA/pF (Figura 4 B; p < 0,05, spontaneo vs sola ha suscitato o non sparare gruppi; p > 0,05 sola ha suscitato vs non sparare gruppi). La differenza di densità di corrente non erano un riflesso della capacità di cellule intere, come la spontanea (3,3 ± 0.2 pF), sola ha suscitato (2,9 ± 0.2 pF) e non sparare (3,1 ± 0.3 pF) cellule hanno avute simile intera cella capacitanze (P > 0.05). CE cella Na+ correnti e AP hanno suscitato erano sensibili a [Na+]o concentrazione e NaV1.3 inibizione3.

Figure 1
Figura 1 : Una gamma rappresentativa di risultati cultura. DIC con epifluorescenza immagini di una cultura di digiuno epiteliale primario da un mouse Tph1-CFP placcato su un piatto fondo di vetro e coltivati per 24 h. Queste due immagini illustrano una serie di esiti di cultura da questo protocollo. Cellule fluorescenti PCP (bianche) sono cellule enterocromaffini (EC). (A) immagine rappresentativa da una cultura che è di scarsa qualità per elettrofisiologia. La cultura è costituito da grandi ciuffi, danneggiato le membrane cellulari, segnale di fluorescenza basso e galleggianti gruppi di cellule morte. (B) immagine rappresentativa da una cultura che è stata ottimizzata per elettrofisiologia. Cultura è costituito principalmente da cellule singole, sane e piccoli ciuffi che hanno aderito alla piastra. Cellule EC in questa cultura mantengono un segnale forte fluorescenza. Barra della scala = 100 µm; i pannelli sono in scala 1:1. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 2
Figura 2 : Preparazione della cella culture per elettrofisiologia. Una strategia efficiente e accurato risciacquo delle colture cellulari CE con soluzione extracellulare privo di siero è fondamentale per la riduzione della matrice extracellulare e del siero che impedirebbe la formazione di guarnizione. (A) materiali. In senso orario, da sinistra in alto: palco, due strisce larghe 5 mm della pellicola di cera, due pezzi di 200 mg di modellazione dell'argilla, pipetta di plastica, forcipe #5, camera di registrazione ellittica, cultura 35 mm piatto con fondo di vetro. (B) aderire pellicola di cera il diametro interno della fase, abbassare la camera ellittica nella piastra di coltura e appiattire l'argilla in strisce rettangolari. (C) Premere la piastra di coltura alla fase di pellicola-rivestiti di cera delicatamente e immobilizzare la camera di registrazione allungando l'argilla di modellistica oltre il bordo del piatto, dalla camera alla fase. Sciacquare dalle cellule EC con diversi volumi di soluzione extracellulare. (D) la fase tornare le staffe di montaggio sopra il microscopio invertito. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 3
Figura 3 : Risultati rappresentativi elettrofisiologia. (A) correnti di Na+ a cellula intera, registrate da un protocollo di tensione-morsetto in due fasi (inset). 50 ms depolarizzazioni da -120 mV attivare canali durante la fase 1 (●), mentre un'ulteriore depolarizzazione a 0 mV durante il passaggio 2 (○) attiva i canali che non avevano ancora inattivati (cioè, sono ancora disponibili per aprire). Traccia rossa, suscitata da tensione corrente passi da -120 da -40 a 0 mV. (B) relazione di corrente-tensione di correnti di picco di Na+ dal pannello A, fase 1 (●, attivazione allo steady-state) o fase 2 (○, inattivazione allo steady-state). L'intersezione delle curve allo steady-state attivazione e inattivazione rivela una piccola finestra corrente a -40 mV (simboli rossi). Potenziali di azione (C) suscitati da depolarizzanti stimoli correnti. Un potenziale di azione può sparare passato 0 mV (linea grigia) quando il potenziale di membrana raggiunge la tensione di corrente di finestra Na+ (linea rossa, -40 mV). Inset, protocollo corrente-morsetto, in cui 0 a + 8 pA è stato iniettato per 50-ms depolarizzazioni da una previsione di -3 PA. (D) i potenziali di azione del fuoco da in cima eventi spontanei che hanno depolarizzate fino a -40 mV. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 4
Figura 4 : Throughput di elettrofisiologia cellulare tutto. (A) la percentuale media di cellule intere per tentativo per n giorni di lavoro in assenza (-) o in presenza (+) dell'inibitore di roccia (10 µM). Cellule EC da digiuno non sono sopravvissuto 24 h nella cultura senza inibitore di roccia. (B) Na+ densità di corrente misurata in tensione-clamp da cellule EC n , in cui i potenziali di azione non ha il fuoco (Non-firing), licenziato solo quando suscitata da un protocollo di corrente-morsetto episodico (sola Elicited), o licenziato spontaneamente in modalità gap-libero corrente-morsetto (spontaneo) (barre di errore sono SEM). Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Comprendere appieno la funzione delle cellule CE richiede un metodo di coltura primaria di alta qualità per generare cellule per elettrofisiologia tutta la cella. Colture primarie di epitelio GI erano stata tradizionalmente difficile dovuto la bassa sopravvivenza. Alleviare questo fattore di confusione, il presente metodo produce colture di cellule EC singolare dall'intestino sia piccolo o grande che sono in grado di sopravvivere per diversi giorni.

Abbiamo trovato che erano critici per migliorare la qualità delle culture per essere adatto per elettrofisiologia: (1) invertendo la mucosa piuttosto che peeling, (2) aggiungendo una piccola quantità di BSA ai media di digestione e FBS per terreni di coltura, (3) abbassando il Concentrazione di collagenosi XI, (4) regolazione della durata e intensità dell'agitazione meccanica per aumentare il numero e la salute delle singole cellule, (5) placcatura tabella extracellulare, a una concentrazione bassa e (6), coltura con inibitore ROCK.

Allo stesso modo, erano critici per l'ottenimento di cellule intere durante il serraggio di patch i seguenti adattamenti: risciacquo (1) accuratamente le culture con soluzione extracellulare senza siero, (2) lasciando la CE cellule stanno nella soluzione extracellulare per almeno 4 h, (3). ri-purposing qualsiasi trascorso elettrodi-come quelli da guarnizioni non riuscite-per sgombrare il campo detriti lungo il percorso alla cella successiva CE, (4) aggiungendo 10 µM Gd3 + alla soluzione extracellulare di bloccare le correnti di perdita (se presente) e per facilitare l'adesione delle cellule di mammifero sospensioni al vetro. Cautela, tuttavia, che Gd3 + potrebbe bloccare scanalature tensione-gated Ca2 + e/o mechanosensitive espresse in cellule EC.

Nonostante avendo attentamente ottimizzate le condizioni di coltura, abbiamo trovato alcune limitazioni: cellule EC bisogno 24 h a completamente allegare ancora scadono dopo ~ 72 h nella cultura; di conseguenza, hanno una finestra di 48 ore, quando sarebbero adatti per esperimenti elettrofisiologici. Perché cellule ragruppate introducono spesso transitori di capacità che non possono essere compensate da registrazioni, generazione di singole cellule EC sono critici. Tuttavia, separando le cellule CE dall'epitelio, le cellule quindi vivono in un ambiente non-nativi (cioè, media alto glucosio con siero bovino fetale e inibitore di roccia in cima la matrice extracellulare come un'artificiale della membrana dello scantinato) e potrebbero rispondere agli stimoli non completamente rappresentativi della cella CE funziona in vivo. Nonostante queste limitazioni, la coltura primaria di cellule EC fornisce ancora spaccato loro fisiologia.

CE le cellule svolgono un ruolo critico nel mantenimento di un buon funzionamento del tratto GI e corpo e come tale, ci sono stati molti metodi sviluppati per acquisire una comprensione sull'elettrofisiologia cellulare CE. Elettrofisiologia delle cellule enteroendocrine e CE è stata studiata in cellule immortalizzate modelli5,8,13, colture primarie di cellule CE da cavia11e mouse3,4, nostro Metodo si avvale di metodi di qualità-conservazione delle cellule per creare una cultura che ha stato minimamente trasformata e riflette le cellule CE native. Utilizziamo un modello di topo transgenico, Tph1-CFP, che mostra una fluorescenza ciano nel citoplasma quando Tph1 è presente9. Questo metodo può essere utilizzato anche per altri reporter o tipi di cellule enteroendocrine Tracing lignaggio. Il nostro metodo compie anche l'isolamento di singole cellule EC in un tempo minimo e trattamento enzimatico, come le cellule sono esposti solo per una delicata XI collagenasi ad una concentrazione minima ma efficace di 0,1 mg/mL (digiuno) e 0,6 mg/mL (due punti) per meno di un'ora. Il risultato di queste modifiche è una cultura che è stata ottimizzata per gli studi elettrofisiologici delle cellule EC.

Abbiamo utilizzato con successo questo metodo per studiare il rilascio di elettrofisiologia e serotonina in murino CE celle3. La capacità di isolare correttamente, identificare e cultura CE celluli facilita importanti direzioni future negli studi sulla fisiologia cellulare CE. Questo metodo può essere utilizzato per determinare ulteriori percorsi critici e canali coinvolti nell'esocitosi di cella CE di serotonina e altri CE trasmettitori cellula-specifico. Il metodo potrebbe anche essere modificato per isolare e caratterizzare la fisiologia della cellula umana CE unitamente all'utilizzo di arancio di acridina per CE cella identificazione13.

Come con lo sviluppo di protocollo più scientifico, comunicazione e imparziali osservazioni erano fondamentali per la risoluzione dei problemi del presente protocollo. Quando abbiamo testato nuovi metodi di coltura per la sopravvivenza delle nostre culture, era utile per contare il numero di cellule fluorescenti come una misura della redditività, stimare la densità delle cellule in ogni piatto e raccogliere rappresentativo di foto e video delle culture attraverso molte volte punti. Dopo che le cellule erano in grado di sopravvivere oltre 24 h nella cultura, abbiamo lavorato sulla modifica nostre culture per esperimenti di elettrofisiologia. Insieme a raccogliere immagini e dettagliate osservazioni, fu importante mantenere una comunicazione chiara tra personale di laboratorio riguardanti regolazioni per digestione meccanica e supplemento e/o concentrazioni di substrato, così che le cellule sane CE erano pronte per caratterizzazione elettrofisiologica.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Nessuno

Acknowledgments

Gli autori ringraziano la signora Lyndsay Busby per l'assistenza amministrativa e Mr. Robert Highet Mayo il clinica divisione di ingegneria per la progettazione e la stampa 3D dell'inserto piatto cultura. Questo lavoro è stato supportato da NIH K08 AB (DK106456), pilota e fattibilità Grant a AB da Mayo Clinic Center per la segnalazione delle cellule in gastroenterologia (NIH P30DK084567) e 2015 American Gastroenterological Association Research Scholar Award (AGA RSA) AB e NIH R01 GF (DK52766).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
100 mm x 15 mm culture dish Corning (Falcon) 351029
Transfer Pipette Fisherbrand 13-711-7M
10 mL serological pipette Corning (Falcon)  357551
50 mL Conical Corning (Falcon)  352098
15 mL Conical Corning (Falcon)  352097
1,000 mL Barrier Pipet Tips Thermo Scientific (Art) 2079E Keep sterile
MatTek Glass Bottom Dishes MatTek Corporation P35G-1.5-14-C Keep sterile
Micro-dissection Forceps - Very Fine, Extra-Long Points Fine Science Tools SB12630M
Surgical Scissors-Sharp Nasco 14002-14
Micro-Dissection Scissors Nasco SB46568M
Monoject Hypo Needle, 21 G x 1" A, 100/BX Covidien 8881250172
 Tg(Tph1-CFP)1Able/J Mice Jackson Stock # 028366 Use male or female mice between the ages of 4-7 weeks
Microfil nonmetallic syringe needles (34 gauge, 67 mm) World Precision Instruments MF34G-5
Parafilm "M" Laboratory Film Pechiney Plastic Packaging
R6101 Dow Corning
6 mL syringe with regular luer tip Monoject
3 mL syringe with regular luer tip Monoject
Electrophysiology Equipment
Amplifier Molecular Devices Axopatch 200B
Data acquisition system (daq) Molecular Devices Digidata 1440A
Signal conditioner Molecular Devices CyberAmp 320
Software Molecular Devices pClamp 10.6

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Rindi, G., Leiter, A. B., Kopin, A. S., Bordi, C., Solcia, E. The "normal" endocrine cell of the gut: changing concepts and new evidences. Annals of the New York Academy of Sciences. 1014, 1-12 (2004).
  2. Rogers, G. J., et al. Electrical activity-triggered glucagon-like peptide-1 secretion from primary murine L-cells. The Journal of Physiology. 589, Pt 5 1081-1093 (2011).
  3. Strege, P. R., et al. Sodium channel NaV1.3 is important for enterochromaffin cell excitability and serotonin release. Scientific Reports. 7 (15650), (2017).
  4. Bellono, N. W., et al. Enterochromaffin cells are gut chemosensors that couple to sensory neural pathways. Cell. 170 (1), 185-198 (2017).
  5. Alcaino, C., Knutson, K., Gottlieb, P. A., Farrugia, G., Beyder, A. Mechanosensitive ion channel Piezo2 is inhibited by D-GsMTx4. Channels. 11 (3), 245-253 (2017).
  6. Kim, M., Javed, N. H., Yu, J. G., Christofi, F., Cooke, H. J. Mechanical stimulation activates Galphaq signaling pathways and 5-hydroxytryptamine release from human carcinoid BON cells. Journal of Clinical Investigation. 108 (7), 1051-1059 (2001).
  7. Modlin, I. M., Kidd, M., Pfragner, R., Eick, G. N., Champaneria, M. C. The functional characterization of normal and neoplastic human enterochromaffin cells. The Journal of Clinical Endocrinology and Metabolism. 91 (6), 2340-2348 (2006).
  8. Wang, F., et al. Mechanosensitive ion channel Piezo2 is important for enterochromaffin cell response to mechanical forces. The Journal of Physiology. 595 (1), 79-91 (2017).
  9. Li, H. J., et al. Distinct cellular origins for serotonin-expressing and enterochromaffin-like cells in the gastric corpus. Gastroenterology. 146 (3), 754-764 (2014).
  10. Psichas, A., Tolhurst, G., Brighton, C. A., Gribble, F. M., Reimann, F. Mixed primary cultures of murine small intestine intended for the study of gut hormone secretion and live cell imaging of enteroendocrine cells. Journal of Visualized Experiments. (122), 55687 (2017).
  11. Raghupathi, R., et al. Identification of unique release kinetics of serotonin from guinea-pig and human enterochromaffin cells. The Journal of Physiology. 591, Pt 23 5959-5975 (2013).
  12. Nozawa, K., et al. TRPA1 regulates gastrointestinal motility through serotonin release from enterochromaffin cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (9), 3408-3413 (2009).
  13. Reimann, F., et al. Characterization and functional role of voltage gated cation conductances in the glucagon-like peptide-1 secreting GLUTag cell line. The Journal of Physiology. 563, Pt 1 161-175 (2005).

Tags

Biologia problema 139 Apparato gastrointestinale epitelio cellule enterocromaffini colture primarie elettrofisiologia della cellula intera morsetto di tensione pinza amperometrica
A cellula intera elettrofisiologia di cellule enterocromaffini murino coltura primaria
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Knutson, K., Strege, P. R., Li, J.,… More

Knutson, K., Strege, P. R., Li, J., Leiter, A. B., Farrugia, G., Beyder, A. Whole Cell Electrophysiology of Primary Cultured Murine Enterochromaffin Cells. J. Vis. Exp. (139), e58112, doi:10.3791/58112 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter