Summary
Denne protokollen gir en enkel og effektiv metode for å isolere, identifisere og kvantifisere immunceller bosatt i myokard mus i steady state eller betennelse. Protokollen kombinerer enzymatisk og mekanisk fordøyelsen for generering av en enkelt celle suspensjon som kan analyseres videre av flowcytometri.
Abstract
Immunsystemet er en vesentlig komponent i et sunt hjerte. Myocardium er hjem til en rik befolkning på ulike immun celle delsett med funksjonell compartmentalization både under steady state og under ulike former for betennelse. Inntil nylig studiet av immunceller i hjertet krevde bruk av mikroskopi eller dårlig utviklede fordøyelsen protokoller, som gitt nok følsomhet under alvorlig betennelse, men klarte ikke å trygt identifisere små, men viktige-av celler i løpet stabil state. Her diskuterer vi en enkel metode kombinere enzymatisk (collagenase, hyaluronidase og DNAse) og mekanisk fordøyelsen murine hjerter foran intravascular administrasjonen av fluorescently merket antistoffer å skille små men uunngåelig intravascular celle forurensninger. Denne metoden genererer en suspensjon av isolerte levedyktig celler som kan analyseres av flowcytometri for identifikasjon, phenotyping og kvantifisering eller ytterligere renset med fluorescens-aktivert celle sortering eller magnetiske perle separasjon for transcriptional analyse eller i vitro studier. Vi inkluderer et eksempel på en trinnvis flyt cytometric analyse å skille de viktige macrophage og dendrittiske celle populasjoner av hjertet. En middels størrelse eksperiment (10 hearts) krever fullført prosedyren 2-3 h.
Introduction
Ulike former for hjerteinfarkt stress eller skader, inkludert iskemiske (ischemia reperfusion eller hjerteinfarkt) og ikke-iskemiske (hypertensjon eller Myokarditt), fremme rekruttering av inflammatoriske celler med reparative og beskyttende, men også patogene egenskaper. Så tidlig som i 1891, beskrevet Romberg først tilstedeværelsen av mobilnettet infiltrerer i myokard pasienter infisert av tyfus og skarlagensfeber1. Den detaljerte studien av cardiac immunceller kreves imidlertid utviklingen av mer avanserte immunophenotyping teknikker. Som en konsekvens, har nylig vi begynt å forstå at et mangfoldig befolkning av immunceller med grunnleggende vedlikehold roller i løpet stabil state ligger innenfor myokard.
Histology har vært og fortsatt er, den vanligste metoden å karakterisere kardial immunceller ved betennelser. Men mens histology representerer en verdifull diagnoseverktøyet, har dens bruk i studiet av cardiac immunceller viktige begrensninger. Immunceller i myokard representerer en svært liten andel av de totale cellene og er mer eller mindre jevnt fordelt i løpet proporsjonalt enorme. Tilsvarende vise flere former for hjerte inflammasjon, som viral Myokarditt, fokal mønstre av betennelse. Dette betyr at nøyaktig analyse av immunsystemet til hjertet ofte krever høyere grader av histologiske sampling, øke kostnadene for å redusere bias. Videre gir histology et svært begrenset antall brukbare informasjon i cellen identifikasjon (f.eks antall parametere). Med en stadig økende antall celle undergrupper som krever bruk av flere uttrykk markører (inkludert overflate markører, transkripsjonsfaktorer eller utskilles molekyler), har flowcytometri etablert seg som det mest effektive verktøyet for immunophenotyping, på grunn av lav pris og høy gjennomstrømming.
Bruk av immunophenotyping teknikker er tett avhengige av utviklingen av effektiv fordøyelse protokoller som tillates for single-celler analyse av stort antall celler. Utviklingen av uttømmende protokoller celle utvinning åpnet et nytt vindu av muligheter i studiet av cardiac immunologi. Gjennom en kombinasjon av fordøyelsen, flowcytometri og transcriptomics, har store bestander av makrofager og dendrittiske celler i hjertet vært preget2,3. Den rikeste befolkningen i cardiac immunceller i løpet stabil state er CD64+MerTK+ makrofager, som kan deles basert på deres gjengivelsen av CCR2 eller CD11c2. CCR2+ makrofager kommer fra voksen benmarg hematopoiesis, mens fleste av CCR2- makrofager, som kan uttrykke høyt eller lavt nivå av MHC-II, er hovedsakelig av prenatal opprinnelse. Makrofager utføre viktige funksjoner som reparasjon4 og fjerning av rusk5 under skade eller støtte elektrisk tilkobling6 i steady state. Under ulike former for betennelse en viktig strøm av Ly6CHei MHC-IIlo CD64int monocytter oppstår, som senere skille ut Ly6CHei CCR2+ makrofager2,7 . Betydelig mindre, men viktig innbyggere bor i myokard av friske individer består av dendrittiske celler8,9. De to store delsettene av cardiac konvensjonelle DCs (cDCs) har vært nylig preget: cDC1 (CD103+ DCs) og cDC2 (CD11b+ DCs). DCs spille en viktig rolle i forsvaret mot infeksjon8 , men kan også fremme Selvskading ved betennelser, spesielt under hjerteinfarkt9.
Her beskriver vi en enkel metode for isolering av levedyktig cardiac immunceller fra musen myokard. Metoden kombinerer enzymatisk og mekanisk fordøyelsen med en celle-sil filtrering for å få en enkeltcelle suspensjon som kan analyseres, eller videre renset, ved flyt cytometri sortering eller magnetiske perle berikelse. Nøyaktige målinger av ekstravaskulær overvåking av hjerteinfarkt celler krever cardiac perfusjon for å fjerne mulige forurensninger fra blodet av cardiac microvasculature. I tillegg presenterer vi et valgfritt trinn av intravascular merking av immunceller som kan brukes til å fremme skille ut hjerteinfarkt celler fra intravascular forurensning, basert på Galkina et al. protokollen10. Til slutt presenterer vi en grunnleggende flyt cytometri analyse for å identifisere de store macrophage og cDC subpopulasjoner.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Etikk uttalelse: denne protokollen er vurdert og godkjent av dyr omsorg komiteen på universitetet helse Network (Toronto, Canada) og er i overensstemmelse med kanadiske Rådet for Animal Care.
1. buffer forberedelse
- Forberede HBB buffer (Hanks balansert Salt løsning (HBSS), 2% varme inaktivert bovin serum, 0,2% bovin serum albumin). Legge 10 mL av varme inaktivert bovin serum og 1 g bovin serum albumin til 500 mL av HBSS. Filteret sterilisere gjennom en 0,2 µm og lagre på 4 ° C.
- Forberede FACS buffer (fosfat bufret saltvann (PBS), 2% varme inaktivert bovin serum, 1 mM Ethylenediaminetetraacetic syre (EDTA, pH 8.0)). Legge 10 mL varme inaktivert bovin serum og 1 mL av 0,5 M EDTA til 500 mL PBS. Filteret sterilisere gjennom en 0,2 µm og lagre på 4 ° C.
Merk: Løsninger kan lagres på 4 ° C i opptil 1 måned.
2. merking av sirkulerende leukocytter
- Tas aseptisk forberede anti-musen CD45 injeksjon med 1 µg antistoff fortynnet i sterilt fosfat bufret saltvann (PBS) for et siste injeksjon volum av 200 µL/mus. Laste inn volumet i 28,5 G insulinsprøyte og holde unna lys.
Merk: Bruke to forskjellige fluorochrome-merket anti-CD45 antistoffer for å skille den intravascular (farget gjennom IV administrasjon) fra den intracardiac flekker (farget etter fordøyelsen, se trinn 4). -
Forvarm mus (8-12 uker gamle) ved å utsette halen til en rød varmelampe i 5 min.
FORSIKTIG: Ikke overopphetes dyret. Hold lampen på trygg avstand (> 30 cm).- Holde dyr i sternal posisjon ved hjelp av en passende enhet. Avdekke og stabilisere halen med ikke-dominante hånd ved immobilizing foten av halen med indeksen og langfingeren og midt-distale regionen av halen med tommelen og ring finger.
Advarsel: Ikke bruk for mye kraft på spissen av halen som huden kan trekkes ut. Sett inn nålen med skråkanten vender i venen. Holde nålen parallelt fotsporene til enhver tid som det er lett å punktere venen.
Merk: Blod inn sprøyten oppstå og er et tegn på en god injeksjon. Bøyd nålen til en 90-graders vinkel kan lette IV administrasjon. Bekrefte med sikkerhet kontoret som bøying nåler kan representere en fare. - Injisere 200 µL intravenøst i halen venen. Væsken skal flyte lett og midlertidig fjerne venen.
FORSIKTIG: Ikke press væske i hvis motstand er oppfylt. Dette er tegn på misplacement nålen. - Tillate antistoff å sirkulere i 5 minutter før Human euthanizing musen.
- Holde dyr i sternal posisjon ved hjelp av en passende enhet. Avdekke og stabilisere halen med ikke-dominante hånd ved immobilizing foten av halen med indeksen og langfingeren og midt-distale regionen av halen med tommelen og ring finger.
3. hjertet isolere og fordøyelse
-
Euthanize mus bruker CO2 eller av andre institusjonelt akseptert euthanasia.
- For CO2 dødshjelp, plasserer musen i CO2 kammeret og sette fyll hastigheten til 20% av kammeret volum per minutt (dvs. hvis kammeret er 10 L, fyll på 2 L/min). Løpe 2 min og dataskjerm musen til puste har opphørt.
- Slå av CO2 og drar musen for en ytterligere 1-2 min. sikre puste har opphørt åpne kammeret og utføre en tå knipe for å bekrefte musen er død før du fortsetter å behandle musen.
- Spray musen med 70% etanol. Løft huden på magen og dissekere musen ved å kutte langs ventrale midtlinjen begynnelsen på nivået av hoftene til sternum. Åpne magen og Flytt leveren til å utsette mellomgulvet.
-
Kuttet membranen og ribbeina på begge sider av midtlinjen, forsiktige for å unngå punktering lungene og hjertet.
- Utsett hjertet av peeling tilbake ribbeina, deretter kuttet første til venstre atria etterfulgt av de høyre atria.
FORSIKTIG: Vær forsiktig når du atria, sikrer ingen arterier eller årer er skadet, så dette kan redusere effektiviteten av flushing blodet i organer. - Perfuse hjertet med 15 – 20 mL kaldt PBS bruker en 60 mL sprøyte med en 21 G nål og kalde PBS. Forsiktig Grip bunnen av hjertet med tang og sett inn nålen i venstre ventrikkel nær toppen. Gjenta i høyre ventricle. En skikkelig injeksjon resulterer i hvite lungene og blek leveren.
Merk: Perfusjonsmåling skal utføres innen 5 minutter etter euthanasia for å unngå blodpropp, som kan forurense organer interesse med sirkulerende celler.
- Utsett hjertet av peeling tilbake ribbeina, deretter kuttet første til venstre atria etterfulgt av de høyre atria.
-
Holde bunnen av hjertet med tang og forsiktig løft hjertet, deretter koble hjertet ved å kutte store pulmonary arteries og årer, aorta og perikard sekk.
- Rense hjertet ved å forsiktig holde hjertet mellom tommelen og indeksen fingrene i et rent lofri papirhåndkle og trekk av atria og restene av store arterier og vener og eventuelle andre forurensninger med tang.
Merk: Kontroller helheten av atria fjernes, og ingen andre vev, som lungekreft eller blodkar, finnes disse vev har sine egne bosatt immunceller. Lungene har særlig store immun celle innbyggere som kan maskere mindre bestander av dem i myokard.
- Rense hjertet ved å forsiktig holde hjertet mellom tommelen og indeksen fingrene i et rent lofri papirhåndkle og trekk av atria og restene av store arterier og vener og eventuelle andre forurensninger med tang.
-
Legg hjertet i 5 cm plast parabol med 50 µL av kaldt PBS.
- Hakke hjertet med buet dissecting saks før det er ingen synlige stykker og har en glatt konsistens.
Merk: Prøv å holde hjertet i et inneholdt rett under hakke for å unngå tap av vev. - Overføre thetrituratedheart vev med buet tang inn 2 mL microcentrifuge røret med 800 µL kaldt Dulbeccos endret Eagle Medium (DMEM).
- Hakke hjertet med buet dissecting saks før det er ingen synlige stykker og har en glatt konsistens.
-
Legge til 450 U/mL ofcollagenase jeg 60 U/mL av hyaluronidase type jeg-S og 60 U/mL av DNase-jeg til hvert utvalg.
- Inkuber samples ved 37 ° C på en rocking shaker på 50 rpm i 45-60 minutter.
-
Etter fordøyelsen, kort vortex prøver (20 s) og umiddelbart på is for å holde eksempler på 4 ° C.
- Bruker en 1 mL hindre, Pipetter prøver opp og ned til vevsprøver er homogen og ikke tetter pipette spissen.
Merk: Definere et bestemt antall ganger Pipetter kan øke reproduserbarhet. Hvis hjerter ikke er optimalt digested, kan biter av myokard hindre pipette. Forsiktig sliping pipette spissen mot microcentrifuge røret vil hjelpe homogenize større biter av vev.
- Bruker en 1 mL hindre, Pipetter prøver opp og ned til vevsprøver er homogen og ikke tetter pipette spissen.
-
Pre våt en 40 µm celle sil plassert på en 50 mL konisk tube med 1 mL kaldt HBB.
- Legge til homogenisert utvalg i filteret og vask gjennom ved å langsomt helle 12 – 14 mL kaldt HBB.
- Overføre filtrerte prøver til et merket 15 mL konisk rør og holde på 4 ° C.
-
Sentrifuger eksempler på 400 x g i 5 min på 4 ° C. Sug opp av nedbryting.
- Lyse røde blod celler ved å legge 1 mL av Ammonium klor kalium (ACK) lyseringsbuffer til hvert utvalg. Resuspend prøver av vortexing og ruge ved romtemperatur for 5 min.
- Når lysis er fullført, kan du legge til 5-8 mL av kaldt Hanks balansert Salt løsning (HBSS) å stoppe hemolyse.
- Sentrifuge eksempler på 400 x gfor 5 min på 4 ° C. Sug opp av nedbryting.
- Legge 1 mL av FACS buffer til hver prøve og overføring til et merket 1,5 mL microcentrifuge rør.
Merk: Protokollen kan pauses her for opptil 2 timer med prøver lagret på 4 ° C.
4. strømme cytometri flekker og analyse
-
Sentrifuger eksempler på 400 x g i 5 min på 4 ° C.
- For å redusere ikke-spesifikke antistoffer bindende, fortynnes 1: 100 anti-CD16/CD32 og monocytt blokkering (1:20) (se Tabell for materiale) regnskap for 50 µL FACS per prøve. Inkuber ved romtemperatur i 15 min.
- Forberede antistoff fortynning (1:250 for hver antistoff) regnskap for 50 µL av FACS per prøve.
Merk: En levedyktighet fargestoff kan inkluderes i antistoffer cocktail for å utelukke døde celler. Liten størrelse utelukkelse av flyt analyse kan eventuelt brukes (figur 1C og D). - Uten å vaske, legger du til 50 µL av antistoff master mix hver og bland.
- Inkuber samples ved 4 ° C i 30 min i mørket.
- Legge til 600 µL FACS hver prøve å vaske og sentrifuge eksempler på 400 x g i 5 min på 4 ° C.
- Sug opp av nedbryting og resuspend pellets i 300 µL FACS. Hold eksempler på 4 ° C i mørket.
Merk: Noen levedyktighet fargestoffer, som DAPI, krever flekker i 10 min før du kjører flowcytometri. - Analyser av flowcytometri (se figur 1 og 2) i neste 3 h. Hvis lengre tid er nødvendig, kortsiktige fiksering bruker en lav konsentrasjon paraformaldehyde (0,5-1% i PBS) anbefales å bevare flekker.
Merk: Det anbefales sterkt å filtrere prøver gjennom en 40 µm celle sil før initiere flyt cytometri analyse for å hindre obstruksjon av fluidics av flyt-cytometer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Hittil er ingen god metode utviklet isolere immunceller fra andre cardiac celle komponenter, for eksempel cardiomyocytes. Dermed krever analyse av cardiac enkeltcelle suspensjon av flowcytometri en pre gating med CD45 identifiserer immun celle, etterfulgt av én celle og liten størrelse utelukkelse gating (figur 1A). Alternativt kan en levedyktighet flekker utføres for å utelate døde celler. Liten størrelse eksklusjon og levedyktighet fargestoffet flekker representerer nesten tilsvarende metoder å ekskludere døde celler (figur 1B og 1 D). Det anbefales sterkt å fortsette antistoffer flekker snart etter fordøyelsen prosedyren og alltid holde celle suspensjon på 4 ° C, som levedyktigheten til cellene kan forfalle. Denne prosedyren gir vanligvis ca 80-90% av levedyktig immunceller.
Myokard huser en mangfoldig koloni av immunceller, hvorav mange er fortsatt ventende identifikasjon og karakteristikk. Makrofager, identifisert som CD64+ celler, er store immun befolkningen i hjertet, som representerer 60-70% av alle immunceller (figur 1C, topp). Fordøyelsen av en voksen murine hjerte gir om 3 – 5 x 104 makrofager, avhengig av hjertet størrelse. CARDIAC makrofager kan videre deles basert på deres uttrykk for CD11c eller CCR2 og deres nivå av MHC-II-2.
Den andre cardiac immun subpopulasjon som har vært godt preget er konvensjonelle dendrittiske celler. Konvensjonelle DCs er CD64- celler som uttrykker middels høye nivåer av MHC-II og høye nivåer av CD11c (figur 1 C, bunnen). Disse cellene kan deles basert på deres gjengivelsen av CD103 eller CD11b8,9. DCs representerer en mye mindre hjerte subpopulasjon forhold til makrofager. Fordøyelsen av en voksen murine hjerte gir mellom 150 og 500 DCs av hver delsett.
Perfusjon av hjertet med kaldt PBS er viktig å identifisere immun celle populasjoner i myokard. Imperfektum perfusjon kan imidlertid øke beløpene av intravascular miljøgifter i prøvene, fører til betydelig skjevhet som kan være basert på eksterne endringer (blod) endringer i cardiac infiltrerer. I slike tilfeller kan intravascular administrasjon av fluorescerende-merket anti-CD45 antistoffer, hvilke merker alle immunceller sirkulerer gjennom makro- og microvasculature (figur 2A), hjelpe skille hjerteinfarkt celler fra intravascular forurensninger. Figur 2 B viser et eksempel på en ufullkommen perfused hjerte som er 20% av immunceller intravascular forurensninger. Viktigere, har dette nivået av forurensning liten effekt på macrophage og DC analyse, siden disse cellene er sjelden funnet i blodet (figur 2D).
Bruk av flowcytometri av en enkelt celle suspensjon av myocardium tillater for studiet av de små subpopulasjoner av hjertet. For eksempel mangelen av transkripsjon faktor BATF3 har vist seg å forebygge utviklingen av eldre CD103+ DCs i flere vev11. For å studere Hvis dette gjelder også i myokard, ble enkeltcelle suspensjoner av cardiac celler fra 8-15-uke-gamle BATF3-mangelfull eller kontroll littermates (i C57BL/6 bakgrunnen) analysert ved hjelp av flowcytometri. På grunn av liten befolkning størrelse og antall markører for å skille DC delsettene, kunne histology ikke ha gitt nok strøm til analyse til et endelig svar. Bruker imidlertid flyt cytometri analyse sammenligne immunceller i myokard av vill-type versus en Batf3- / - mus, mangel på CD103+ DCs kan bekreftes i sistnevnte (Figur 3A og B). Dessuten, observerte vi at BATF3-mangel ikke betydelig endre sammensetningen av andre cardiac befolkninger (Figur 3C og D). Disse resultatene eksemplifiserer graden av følsomhet som kan oppnås ved hjelp av denne kombinerte metoden enzymatisk og mekanisk fordøyelsen for å oppnå en enkeltcelle suspensjon.
Figur 1 : Gating strategi for cardiac makrofager og DCs. Isolert hjerter fra C57BL/6 mus ble fordøyd som beskrevet, og enkelt celle suspensjon ble analysert av flowcytometri. (A) Gating CD45 + live singlet cardiac celler. Bruk CD45 merking for å identifisere immunceller fra hjerte enkelt celle homogenate, som inneholder svært høye nivåer av ikke-immune celler (dvs. cardiomyocytes, endotelceller og fibroblaster). Utelukke doublets ved å sammenligne SSC-H vs SSC-A etterfulgt av FSC-H vs FSC-A. Merk: Noen andre sammenligning mellom SSC-A, SSC-H og SSC-W eller FSC-A, FSC-H og FSC-W er like nyttig. Utvalg av levende celler kan utføres ved å ekskludere liten celler (SSC-H vs FSC-H gate). (B) sammenligning av død celle utelukkelse bruker størrelse vs levedyktighet flekker (DAPI). (C) Gating strategi for identifikasjon av cardiac makrofager (CD11b+ CD64+ celler) og DCs (CD64- MHC-IIHei CD11c+). CARDIAC makrofager kan videre klassifiseres basert på deres gjengivelsen av MHC-II og CD11c. Cardiac DCs kan deles basert på deres uttrykk for CD103 eller CD11b (D) representant tomter DAPI + døde celler i macrophage og DC seksjoner etter lille størrelse eksklusjon. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2 : Merking av intravascular celler forurensninger. (A) sammenligning av intravascular CD45 merking av blodet nøytrofile og Ly6CHei monocytter i anti-CD45 antistoff behandlet (rød) eller ikke-behandlet (blå) mus. (B) identifikasjon av intravascular forurensninger i en cardiac forberedelse av intravascular CD45 merking. (C) representant flyt tomter av hjerteinfarkt og intravascular celler. (D) representant tomter merket celleområde i macrophage og DC rom etter anti-CD45 IV administrasjon. Merk at makrofager og DCs er utelukkende ekstravaskulær overvåking av. Intravascular forurensninger er vanligvis lymfocytter, monocytter og nøytrofile2. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 3 : Kvantifisering av cardiac makrofager og DCs i BATF3 dårlig mus. (A) representant flyt tomter cardiac DCs i Batf3+/ + og Batf3- / - mus. (B) kvantifisering av cardiac DCs i Batf3+/ + og Batf3- / - mus. Merk at CD103+ DCs i Batf3- / - mus. (C og D) kvantifisering av cardiac makrofager (MF) i Batf3+/ + og Batf3- / - mus. Feilfelt representerer SEM. røde symboler representerer enkelte dyr. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Hjerteinfarkt betennelse eller Myokarditt, er en funksjon av mest hjerte-og karsykdommer. Myocardium er imidlertid ikke uten sin egen immun komponenter i ikke-sykdom stater. I steady state, mange immunceller ligge i myokard og spille viktige roller av vedlikehold og beskyttelse. Karakterisering av disse forskjellige befolkningsgrupper celleområde ville ikke vært mulig uten metoder som den som presenteres i denne protokollen.
En kombinasjon av mekanisk og enzymatiske fordøyelsen av myokard tillater isolering av en enkelt celle suspensjon som kan brukes i kombinasjon med andre metoder for analyse, som flyt cytometri eller immunomagnetic perle isolasjon. Metoden finnes flere hensyn må tas i betraktning. Først, alle våre analyser referere til befolkningen i myokard; Vi utelukke atria fra vår analyse som disse er spesialisert vev med sin egen særegenheter. Andre uttrykkes mengder enzymer brukes som aktivitet enheter å hjelpe av digestions bruker enzymer fra andre kilder. Imidlertid anbefales empirisk optimalisering siste konsentrasjonen av enzymer og fordøyelsen, som begrenser enzymet kan redusere den celle avkastningen og mye fordøyelsen kan drastisk påvirker levedyktighet. Tredje anbefales valgfrie trinnet involverer intravascular administrasjon av merket antistoffer spesielt når studere uvanlig populasjoner i normal myokard (for eksempel lymfocytter, monocytter og nøytrofile)2 eller under omstendigheter Når antall populasjoner i blodet kan endre (monocytosis, granulocytosis eller lymphocytosis) som kan gi et falskt inntrykk av endringer i myokard som må bekreftes ved hjelp av denne metoden eller alternativt mikroskopi. Men er dette trinnet av begrenset nytte når du analyserer makrofager eller eldre DCs, disse cellene er sjelden funnet i store mengder i blodet (figur 2D). Det er viktig å optimalisere antall antistoff administrert og inkubasjon tiden før ofre musen, som langsiktig inkubasjon kan tillate noen antistoff spredning i hjertet, spesielt i en betent myokard. Endelig, er det svært viktig å være grundig i isolasjon av hjertet, fjerne restene av store arterier, vener og eller andre vev, som lunger. Disse miljøgifter vev har svært forhøyet antall immunceller som lett kan skjule den hjerteinfarkt innfødte befolkningen.
Det er svært viktig å utføre utelukkelse av døde celler, enten ved hjelp av levedyktighet fargestoffer eller liten størrelse utelukkelse under flyt cytometri analyse, som fordøyelse (eller vevsskade sykdom modeller) kan forårsake en relativt stor mengde døde celler. Vi har sammenlignet effektiviteten av død celle utelukkelse av størrelse og bruke en levedyktighet etikett (figur 1B og D), demonstrere deres nær ekvivalens. Viktigere, kan ikke størrelse utelukkelse brukes etter fiksering og permeabilization som denne fremgangsmåten reduserer Cellestørrelse.
Selv om autofluorescence er sjelden et problem å identifisere cardiac makrofager bruker flowcytometri, representerer dette et viktig problem når du prøver å karakterisere uttrykk for noen markører, spesielt med fluorochromes opphisset av høy energi ( kortere) lys bølgelengder (350-500 nm). I disse eksperimentene, det anbefales å bruke isotype kontroller, unngå de blå og fiolett lasere (fluorescein isothiocyanate, phycoerythrin, Pacific Blue/briljante Violet 421) og bruke fluorochromes med utslipp over 600 nm, som allophycocyanin.
Bruk av protokoller som presenteres her er stadig viktigere som en økende mengde litteratur er å identifisere rollen intensitet og type betennelse i evaluering og karakterisere utfallet av hjerte-og karsykdommer. Denne metoden gir høyere nivåer av cellen karakterisering enn histology. For eksempel bruk av avstamning sporing tillatt for identifisering av ontogenically forskjellige undergrupper av makrofager med deres programmerte ulike funksjoner2. Tilsvarende kan denne metoden brukes til å studere T celle svar under hjerteinfarkt betennelse og kombinert med ex vivo stimulering å studere T celle polarisering8.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne ikke avsløre.
Acknowledgments
Dette arbeidet ble støttet av den kanadiske institutter for helseforskning (148808 og 148792), SE ble støttet av en Heart og Stroke Foundation, personell award fra Ontario Provincial Office, mars Dimes, Ted Rogers senter for hjertet forskning og Peter Munk Hjerte sentrum. XCC har en CIHR Banting Fellowship. LA har et hjerte og slag/Richard Lewar Studentship Award.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Phosphate buffered saline | Wisent | 311-010-CL | 1x PBS |
| 21 G x 1 1/2 (0.8 mm x 40 mm) PrecisionGlide Needle | BD | 305167 | |
| Hank’s Balanced Salt Solution | Wisent | 311-511-CL | 1x HBSS |
| Bovine serum albumin | Sigma-Aldrich | A4503-50G | |
| Bovine serum | Sigma | B9433 | |
| 0.5 M Ethylenediaminetetraacetic acid | BioShop | EDT111 | |
| Vacuum filter , 0.2 µm Filtropur V50 | Sarstedt | 83.1823.001 | |
| 28 G 1/2 1 cc insulin syringe | BD | 329424 | |
| 60 mL syringe | BD | 309653 | |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium | Wisent | 319-005-CL | 1x DMEM with 4.5 g/L glucose and L-Glutamine and Sodium Pyruvate |
| Collagenase I | Sigma | C0130 | from Clostridium histolyticum |
| Hyaluronidase type I-S | Sigma | H3506 | |
| DNase-I | Sigma | D4513 | from bovine pancreas |
| Cell strainer, 40 µm Nylon | Falcon | 352340 | |
| Ammonium-Chloride- Potassium (ACK) lysis buffer | Lonza | 10-546E | |
| Alexa Fluor 700 anti-mouse/human CD11b | Biolegend | 101222 | 1:250 dilution |
| APC/Cy7 anti-mouse Ly-6c | Biolegend | 128025 | 1:250 dilution |
| APC anti-mouse CD103 | Biolegend | 121414 | 1:250 dilution |
| Brilliant Violet 605 anti-mouse CD11c | Biolegend | 117334 | 1:250 dilution |
| PE anti-mouse Ly-6G | Biolegend | 127607 | 1:250 dilution |
| Pacific Blue anti-mouse I-Ab | Biolegend | 116422 | 1:250 dilution |
| FITC anti-mouse CD64 (FcgRI) | Biolegend | 139315 | 1:250 dilution |
| PE/Cy7 anti-mouse CD45 | Biolegend | 103113 | 1:250 dilution |
| PerCP/Cy5.5 anti-mouse CD45 | Biolegend | 103132 | 1:40 dilution |
| TruStain fcX (anti-mouse CD16/32) | Biolegend | 101320 | 1:100 dilution |
| True-Stain Monocyte Blocker | Biolegend | 426101 | 1:20 dilution |
| FlowJo V10 | TreeStar Inc | https://www.flowjo.com/solutions/flowjo | |
| Mouse: Batf3-/- | The Jackson Laboratory | JAX: 013755 |
References
- Marboe, C. C., Fenoglio, J. J. Pathology and natural history of human myocarditis. Pathology and Immunopathology Research. 7 (4), 226-239 (1988).
- Epelman, S., et al. Embryonic and adult-derived resident cardiac macrophages are maintained through distinct mechanisms at steady state and during inflammation. Immunity. 40 (1), 91-104 (2014).
- Pinto, A. R., et al. An abundant tissue macrophage population in the adult murine heart with a distinct alternatively-activated macrophage profile. PLoS One. 7 (5), 36814 (2012).
- Lavine, K. J., et al. Distinct macrophage lineages contribute to disparate patterns of cardiac recovery and remodeling in the neonatal and adult heart. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (45), 16029-16034 (2014).
- Fujiu, K., Wang, J., Nagai, R. Cardioprotective function of cardiac macrophages. Cardiovascular Research. 102 (2), 232-239 (2014).
- Hulsmans, M., et al. Macrophages Facilitate Electrical Conduction in the Heart. Cell. 169 (3), 510-522 (2017).
- Nahrendorf, M., et al. The healing myocardium sequentially mobilizes two monocyte subsets with divergent and complementary functions. Journal of Experimental Medicine. 204 (12), 3037-3047 (2007).
- Clemente-Casares, X., et al. A CD103(+) Conventional Dendritic Cell Surveillance System Prevents Development of Overt Heart Failure during Subclinical Viral Myocarditis. Immunity. 47 (5), 974-989 (2017).
- Van der Borght, K., et al. Myocardial Infarction Primes Autoreactive T Cells through Activation of Dendritic Cells. Cell Reports. 18 (12), 3005-3017 (2017).
- Galkina, E., et al. Preferential migration of effector CD8+ T cells into the interstitium of the normal lung. Journal of Clinical Investigation. 115 (12), 3473-3483 (2005).
- Edelson, B. T., et al. Peripheral CD103+ dendritic cells form a unified subset developmentally related to CD8alpha+ conventional dendritic cells. Journal of Experimental Medicine. 207 (4), 823-836 (2010).
