Summary
البحث عن استراتيجيات العلاج teratomas المستمدة من الخلايا الجذعية pluripotent مهم للترجمة السريرية للعلاج بالخلايا الجذعية. هنا، يمكننا وصف بروتوكول أولاً، تولد teratomas المستمدة من الخلايا الجذعية في الفئران، ومن ثم، إلى الهدف بشكل انتقائي وعلاج هذه الأورام المجراة الحيوانات الصغيرة إيرادياتور باستخدام.
Abstract
تزايد عدد ضحايا "الخلايا الجذعية السياحة،" زرع الأعضاء غير المنظم للخلايا الجذعية في العالم، أثارت مخاوف حول سلامة زرع الخلايا الجذعية. وبالرغم من أن زرع الأعضاء المتباينة بدلاً من خلايا غير متمايزة ممارسة شائعة، teratomas يمكن لا تزال تنشأ من وجود بقايا الخلايا الجذعية غير متمايزة في وقت زرع أو من الطفرات العفوية في التمييز بين الخلايا. لأنه غالباً ما يتم تسليمها علاجات الخلايا الجذعية في المواقع الحساسة تشريحيا، الأورام الصغيرة حتى يمكن أن يكون مدمراً سريرياً، أدى إلى العمى والشلل والتشوهات المعرفية، والخلل في القلب والأوعية الدموية. قد تكون العمليات الجراحية من الوصول إلى هذه المواقع أيضا محدودة، وترك المرضى مع عدد قليل من الخيارات العلاجية. السيطرة على الخلايا الجذعية سوء السلوك ولذا، حاسمة بالنسبة للترجمة السريرية للعلاج بالخلايا الجذعية.
الإشعاع شعاع خارجي يوفر وسيلة فعالة لإيصال العلاج المستهدفة لخفض عبء تيراتوما مع التقليل من الإصابة إلى المحيطة بالأجهزة. بالإضافة إلى ذلك، هذا الأسلوب يتجنب التلاعب بالجينات أو توصيل فيروسي للخلايا الجذعية، التي ترتبط بسلامة سريرية إضافية وفعالية الشواغل. هنا، نحن وصف بروتوكول إنشاء pluripotent teratomas المستمدة من الخلايا الجذعية في الفئران وتطبيق العلاج الإشعاعي الخارجي شعاع ليجتذ هذه الأورام في المجراة بشكل انتقائي.
Introduction
تطوير علاجات الخلايا الجذعية لتجديد الأنسجة واجه عددا من الحواجز في العقود العديدة الماضية، تعرقل الجهود المبذولة من أجل نشر الكفاءة السريرية. وتشمل هذه العقبات استبقاء خلية الفقراء في مواقع التسليم، الاستمناع الخلايا الجذعية، وإمكانات الورمية بشكل تيراتوماس1. توموريجينيسيتي مصدر قلق خاص السريرية كما أنها قد تكون ضارة لمتلقي زرع الخلايا الجذعية2. وأبلغ حسابات لتشكيل الورم بسبب حقن الخلايا الجذعية غير المنظم فعلا في عدة إعدادات السريرية3،،من45. إمكانية تشكيل تيراتوما هو الأكثر كثيرا ما استشهد القلق السريرية في pluripotent الخلايا الجذعية (PSC) التنمية وقد أدى إلى تأخيرات وإلغاءات متعددة الخلايا الجذعية الجنينية من رفيعة (ESC) والناجم عن الخلايا الجذعية pluripotent (اللجنة التوجيهية) المحاكمات6،7،،من89. ومن ثم، هناك حاجة ملحة لإجراء تحقيقات متعدية كرس نحو توفير العلاج المناسب، ينبغي أن تنشأ هذه الأورام علاجية المنشأ.
وحتى الآن، ركزت معظم استراتيجيات السيطرة على سوء سلوك الخلايا الجذعية على تخفيض عدد PSCs مع الورمية المحتملة2،10. للأسف، سوى عدد قليل من الخلايا المتبقية (.على سبيل المثال، 1 × 104 إلى 1 × 105 خلايا11) مطلوب من أجل تشكيل تيراتوما، الذي هو الآن أقل من حد الكشف قوله فحوصات المتاحة حاليا12، 13-تتضمن المحددات الأخرى لاستخدام هذه الأساليب بريسيباريشن انخفاض الكفاءة وارتفاع المصروفات، والاعتماد على تعليق خلية واحدة قد لا تكون مناسبة لأحدث نهج هندسة الأنسجة، والأضرار المحتملة للخلية البقاء على قيد الحياة وانجرافتمينت.
وتناولت دراسات قليلة خيارات العلاج عقب تشكيل تيراتوما. ربما هي استراتيجية مدروسة أكثر إدماج الجينات "انتحارية" في الخلايا الجذعية البالغة14،15. يتضمن هذا الأسلوب التلاعب وراثيا أن الخلايا الجذعية لإدراج جينات المبرمج-تفعيل إيندوسيبلي التي يمكن تفعيلها من خلال التحفيز الدوائي بوستينجيكشن، وبالتالي توفير نهج إنقاذ إذا حقن الخلايا تنتج تيراتوماس. إلا أن هذا النهج، تعاني من عيوب كبيرة، بما في ذلك الآثار خارج الهدف من التعديلات الوراثية لشركات الأمن الخاصة وإمكانات تنمية تدريجية ل مقاومة المخدرات16. ويستخدم نهج مماثل الجزيئات الصغيرة للحث على موت الخلايا الانتقائي الأمنية الخاصة عن طريق تثبيط مسارات مكافحة--أبوبتوتيك17. واستهدفت الجماعات الأخرى موت الخلية الأمنية الخاصة باستخدام الأجسام المضادة ضد علامات السطح بلوريبوتينسي، مثل بودوكاليكسين مثل البروتين-1 (بودكسل)18. يقف توقيت إنجاز جزيء صغير أو جسم أن يكون لها تأثير كبير على إمكانات PSCs العلاجية إذا سلمت في وقت مبكر جداً، وقد تفتقر إلى الفعالية العلاجية إذا سلمت في وقت متأخر جداً. وبالإضافة إلى ذلك، لم تدرس التأثيرات المنتظمة للجزيئات الصغيرة والأجسام المضادة المستخدمة في هذا الشكل.
وثمة نهج بديل لعلاج هذه الأورام يعتمد على استخدام العلاج بالإشعاع الخارجي شعاع (إبرت). إبرت إحدى الطرائق الرئيسية المستخدمة حاليا في علاج الأورام الصلبة19. وقد مكنت الابتكارات في إبرت، بما في ذلك تطوير شعاع بروتون والشعاعية المناظير باستخدام الأشعة، استهداف تعزيز هياكل المرضية مع تجنب الأضرار بأنسجة طبيعية، مما يجعل مثالية لمعالجة تيراتوما إبرت الامتثالي تشكيل هياكل تشريحيا الحساسة20. بالإضافة إلى ذلك، هذا الأسلوب يتجنب التلاعب بالجينات أو توصيل فيروسي للخلايا الجذعية، والذي على حد سواء محفوفة بالسلامة سريرية إضافية وفعالية الشواغل15. وأخيراً، قد مكنت السلف في الدقيقة-إيرادياتورس تطبيق إبرت في القوارض21.
في هذه المقالة، نحن لشرح كيفية إنشاء نموذج الحيوانات الصغيرة لتشكيل تيراتوما بالحقن إيبسكس البشرية في الفئران. ثم نعرض كيفية تطبيق إبرت لاستئصال هذه الأورام في المجراة مع الحد الأدنى من الضرر للأنسجة المحيطة بطريقة انتقائية. هذا النهج يوفر علاج مستهدفة ل teratomas المستمدة من PSC مع تجنب آثار خارج الهدف إيصال النظمية للجزيئات البيولوجية والببتيدات والتحوير الوراثي شركات الأمن الخاصة. لأغراض الفحص، نحن نقدم خطوة اختيارية ترانسدوسي الخلايا الجذعية مع الجينات مراسل لتعقب استجابة الورم للعلاج بالإشعاع عبر الإضاءة الحيوية التصوير (BLI).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
ووافقت هذه التجربة الحيوانية والمضطلع بها في إطار مجلس المراجعة المؤسسية والفريق الإداري في "مختبر رعاية الحيوان" في جامعة ستانفورد.
1-خلية ثقافة من إيبسكس
- تنمو إيبسكس البشرية المتأتية عن طريق إعادة برمجة لينتيفيرال على ألواح 6-بئر مغطاة بالغشاء مصفوفة (مثلاً، ماتريجيل المشار إليها كمصفوفة الممتلكات).
- تغيير يوميا وسائل إعلام إيبسكس مع إثراء الثقافة المتوسطة (انظر الجدول للمواد) حضانة في 37 درجة مئوية و 5% CO2.
- حالما تصل الخلايا إلى التقاء 80 – 90% (تقريبا كل 4 أيام)، أضف 1 مل إنزيم تفكك خلية المؤتلف (انظر الجدول للمواد) كل جيدا واحتضان في 37 درجة مئوية لمدة 5 دقائق.
- بعد 5 دقائق، فصل الخلايا من البئر بيبيتينج ونقلها إلى أنبوب 15 مل والطرد المركزي في 300 x غ.
- وبعد الطرد المركزي، نضح المادة طافية وريسوسبيند بيليه الخلية في إثراء الثقافة المتوسطة (انظر الجدول للمواد) المخصب مع مثبط Y27632 في إضعاف 1:1,000.
- إجراء عد خلية من خلايا معزولة وريبلاتي الخلايا المغلفة بمصفوفة ألواح 6-جيدا في كثافة من 2 × 105 4 × 105.
2. توصيل إيبسكس مع "الجين المراسل" مزدوجة-الانصهار
- ممر إيبسكس في لوحات 6-جيدا وفقا للروتين وإضافة إثراء الثقافة المتوسطة (انظر الجدول للمواد) التي تحتوي على 6 ميكروغرام/مل هيكساديميثريني بروميد.
ملاحظة: حجم مستعمرة المثالي 200 – 400 خلايا/مستعمرة يحقق أعلى كفاءة توصيل. - تركز lentivirus الذاتي يخمد حمل اليراع لوسيفراس وأخضر نيون البروتين (فلك-اجفب) يقودها ubiquitin البشرية مروج-ج بالطرد المركزي الرواسب مع دوار SW-29 عند 50,000 س ز 2 ح في 4 درجات مئوية.
- إضافة الركاز الفيروسية إلى إيبسكس في لوحة 6-جيدا في عدد وافر عدوى (وزارة الداخلية) من 10 واحتضان بين عشية وضحاها في 37 درجة مئوية في شركة 5%2.
ملاحظة: كان يحددها تعدد الإصابة بالتعبير عن البروتين أحادي fluorescence تحليلها بواسطة خلية تنشيط fluorescence الفرز المسح الضوئي (نظام مراقبة الأصول الميدانية). - في اليوم التالي، إزالة الفيروس باستخدام الطرد المركزي ألواح 6-جيدا اللجنة التوجيهية في 300 x ز لمدة 6 دقائق في درجة حرارة الغرفة.
- تغيير وسائط الإعلام يوميا بإثراء الثقافة المتوسطة (انظر الجدول للمواد)، ومرور وفقا للبروتوكول. استخدام مجهر الأسفار لتحديد كفاءة توصيل التقريبي اجفب.
- كفاءة من 30-40% غير كافية لفرز نظام مراقبة الأصول الميدانية. الانتقال إلى نظام مراقبة الأصول الميدانية للتعبير عن اجفب إذا كان التعبير عن 30-40 في المائة على الأقل من الخلايا اجفب هيبسكس.
- للتأكد من نشاط فلك السابقين فيفو، لوحة الخلايا معربا عن التجارة والنقل حسب نظام مراقبة الأصول الميدانية في كثافة الخلايا 5,000 كل بئر.
- احتضان خلايا ترانسدوسيد وغير ترانسدوسيد الخلايا (والتي ستكون بمثابة عنصر التحكم السلبي) مع المراسل الإضاءة الحيوية التحقيق د-لوسيفرين (100 μmol/لتر) ل 6 h. قياس الإضاءة الحيوية مع سبيكتروفلوروميتير ميكروسكوبية.
3-زرع PSCs في الجهة الظهرية لتشكيل تيراتوما في الفئران العوز
- أضف 1 مل من تفكك خلية المؤتلف إنزيم ميكس كل لوح 6-البئر الذي يحتوي على إيبسكس البشرية ترانسدوسيد مع جين مراسل مزدوجة-الانصهار (فلك-التجارة والنقل) في الثقافة (انظر القسم 2) واحتضانها لمدة 5 دقائق.
- وبعد فترة الحضانة، تفريق الخلايا بتطلع ماصة والتعبير. إضافة وحدة تخزين مساوية للثقافة المتوسطة وثم الطرد المركزي في 250 x ز لمدة 4 دقائق.
- بعد الانتهاء من استخدام الطرد المركزي، نضح الحل طافية، ريسوسبيند بيليه الخلية في 30 ميليلتر من المصفوفة، ووضعه على الجليد للحفاظ على قدرته على البقاء قبل الحقن. تأكيد حصادا من 1 × 106 الخلايا باستخدام هيموسيتوميتير.
- في حالة استخدام مزدوج-الانصهار مراسل-جين-transfected الخلايا، تعليق الخلايا إيجابية مزدوجة نظام مراقبة الأصول الميدانية (من القسم 2) في 30 ميليلتر من المصفوفة.
- حمل التخدير في الأسبوع 8-10 athymic الفئران عارية باستخدام إيسوفلورانسي 2% مع الأكسجين 1 لتر في الدقيقة ومن ثم استخدام الصيانة 2% إيسوفلوراني مع 1 لتر في الدقيقة للأوكسجين.
- استخدام المحاقن ز 28.5، حقن الخليط خلية/مصفوفة تعليق (انظر الجدول للمواد) في الفضاء تحت الجلد في الجناح، تهدف لحقن في مجموع 5 × 103 إلى 5 × 106 خلايا (ماي حوالي 100 كل الحقن).
- تنظر في موقع حقن والذيلية أكثر إذا كان التخطيط للحفاظ على الفئران لفترة طويلة وتوقع نمو الورم كبير.
- مسموح بالحيوانات تخديره لاسترداد على لوح ساخن حتى المتنقلة (عادة < ح 1) مع رصد معدل التنفس، الجلد لون من أصابع القدم حتى المتنقلة.
4-الإضاءة الحيوية التصوير (BLI) لزرع خلايا لتقييم خلية بقاء ونمو تيراتوما
- تيميبوينتس المرجوة بعد التطعيم، بإجراء حقنه (الملكية الفكرية) داخل 375 ملغ/كغ من التحقيق الصحفي لوسيفرين د في الفئران.
- إشارة 10 دقيقة بعد حقن IP، الصورة الإضاءة الحيوية في الحيوانات أنيسثيتيزيد (أداء كما هو موضح في الخطوة 3، 5) لاستخدام windows اقتناء 1 دقيقة على فترات 5-دقيقة و 30 دقيقة.
ملاحظة: وينصح الأسبوعية صورة التملك. التخدير يتم الاحتفاظ أثناء التصوير بتسليم استنشاقه isoflurane عبر مخروط الآنف. - لتحليل البيانات، ورسم طقة فائدة (ROI) أكثر من إشارة BLI، وتطبيع ثم، لشراء الوقت تقدير كمية الانبعاثات في وحدات للفوتونات الحد الأقصى في الثانية الواحدة سنتيمتر مربع كل ستراديان (خ الفوتونات/s/سم2).
5-تيراتوما التشعيع باستخدام الإكلينيكية إيرادياتور الموجهة بصورة (الشكل 1)
- تخدير بماوس في مربع ضربة قاضية باستخدام إيسوفلوراني 2% في الأكسجين 100% بمعدل تدفق من 1 لتر في الدقيقة. بعد أن يتم تخديره تماما من الماوس، نقله إلى السرير من إيرادياتور ما قبل السريرية الموجهة بصورة (انظر الجدول للمواد). المحافظة على التخدير بنسبة 2% إيسوفلوراني باستمرار عن طريق مخروط الآنف.
- الحصول على الصور المقطعية الصغرى كمجموعة من 400 الإسقاط الصور ما يزيد على 360° استخدام كفب 40، 2 mA شعاع الأشعة السينية، وإعادة بناء تلك إلى صور الحجمي مع الخواص بكسل بحجم 0.2 مم.
- خطة علاج الإشعاعي استخدام الصور المقطعية الصغرى باستخدام حزمة البرامج RT_Image (http://rtimage.sourceforge.net/)، والقيام العلاج.
ملاحظة: خطة العلاج المستخدمة تتكون من عوارض الأشعة السينية كفب 225 اثنين، الموجهة بالمرور عبر تيراتوما سطحية الهدف حين التفاف على سطح بقية الماوس وتجنيب الأحشاء الكامنة. يتم تعديل أوقات التعرض للحزم استناداً إلى نظام معايرة البيانات الفصلية حيث أن الجرعة في مركز الورم المستهدف كان غراي 6. - كرر عملية المعالجة في ثلاثة أيام متتالية لتقديم ما مجموعة 18 غراي للورم المستهدف.
- الحفاظ على معيار المعالجة اللاحقة رعاية الحيوانات.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
حقن الفئران عادة ما سوف تثبت تيراتوما تشكيل النمو بعد 4 – 8 أسابيع كما أكد BLI التصوير (الشكل 2). سوف تتقلص الأورام كبيرة عند تشعيعها بجرعة تراكمية غراي 18 نظراً لمدة شهر واحد بعد الولادة الخلية، أدى إلى انخفاض كبير في إشارة لوسيفراس (الشكل 2). الأهم من ذلك، لا تظهر الأنسجة العادية تؤخذ 5 ملم من موقع المشع لأي أضرار كبيرة (الشكل 3).
رقم 1: التخطيطي للبروتوكول لعلاج الأورام مع إبرت. (A) الحيوان أنيسثيتيزيد على إيرادياتور ومعطلة. يتم إنشاء صورة الكشفية (ب) إلى ترجمة تيراتوما للعلاج المستهدفة. (ج) استخدام حزمة البرامج RT_Image، تتم محاذاة الأشعة السينية لاستهداف الورم المحدد. قبل التشعيع، هو تأكيد موقف صيد تلسكوب والحيوان. (د) ما مجموعة 6 يتم تسليم غراي إشعاع إلى الهدف الورم كل تشعيع الحدث22. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
رقم 2: بذر ناجحة لخلايا النتائج في أورام كبيرة يمكن التعامل معها بشكل انتقائي مع الإشعاع. (A) الممثل BLI لتعامل (يمين) وتظهر teratomas (يسار) غير المعالجة. إجمالي 1 × 106 تم حقن PSCs البشرية مؤثرا معربا عن فلك/اجفب لكلا الجناحين الظهرية الماوس العوز. في حين أن الجانب غير المشععة لا يزال ينمو، انكمش الجانب المشع كبير كما يتضح من الانخفاض في إشارة لوسيفراس. (ب) هذا الرسم البياني الخطي يدل انخفاض إشارة لوسيفراس المشع مقابل الإشعاع الأورام المستمدة من PSC. (ج) التغيرات في القياسات المجراة في قدمه ذات الورنيّة من تيراتوماس على مر الزمن. Teratomas المشع عدم زادت في الحجم مع مرور الوقت، بينما المشع teratomas تناقص في الحجم. (د) علم الأنسجة الإجمالي للمعالجة وغير المعالجة (يسار) المستمدة من PSC الورم (يمين) يظهر انخفاضا ملحوظا في حجم بعد ما مجموعة 18 غراي التشعيع22. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الشكل 3: تستهدف إيصال النتائج في الحد الأدنى من الضرر للأنسجة المحيطة، بما في ذلك الكبد، والأمعاء، والعضلات. الأنسجة المحيطة بأي علامات من أضرار الإشعاع، بما في ذلك الحفاظ على انتشار الهاتف الخلوي، وغياب الشيخوخة الخلوية والمبرمج. أخذت عينات الأنسجة 5 ملم من مواقع المشع في بوستيرادييشن 14 يوما. (أ) توضع & ويوزين تلطيخ يبين الهيكل العادي للنسيج المجاور. (ب) Ki67 المصبوغة (هو موضح في أكوا) يشير إلى الحفاظ على انتشار الهاتف الخلوي في الكبد، والأمعاء، وخلايا العضلات. هي نواة كونتيرستينيد مع 4 ', 6-دياميدينو-2-فينيليندولي (DAPI)، يظهر باللون الأزرق. (ج) β-جالاكتوسيداسي الشيخوخة المقايسة يظهر أي دليل على الشيخوخة الخلوية (أي غياب لتلطيخ الخضراء). (د) المحطة الطرفية ديوكسينوكليوتيديل ترانسفيراز (TdT) dUTP نك-نهاية الوسم (TUNEL) يظهر لا المبرمج (أي عدم وجود بقع حمراء في نوى). هي نواة كونتيرستينيد مع DAPI، سيظهر في الزرقاء22. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
البيانات الإكلينيكية والحالات النادرة من ضحايا "الخلايا الجذعية السياحة" تؤكد أن خطر الإصابة تيراتوماس عيب خطير المقترنة PSC علاجات23. وضع نهج دقيق لمنع وعلاج الأورام المخاطر المرتبطة بالخلايا الجذعية العلاج ولذا، خطوة هامة في تيسير الترجمة السريرية للعلاج الخلايا الجذعية التجدد. في هذه المقالة، نحن وصف طريقة علاجية استهداف teratomas PSC المرتبطة باستخدام إبرت في طراز ماوس وأظهر ديناميكية ضمور الأورام المشع باستخدام التصوير BLI.
نحن تستخدم إيبسكس البشرية وتم إنشاؤها بواسطة lentivirus إعادة برمجة أسلوب حقن في نموذج فئران عارية الخص تشكيل teratomas المجراة. يتجنب استخدام الفئران عارية رفض مكسبه مبكر عن طريق حقنه عدة أنواع من الخلايا. في حين يقوي استخدام الفئران التي تفتقر إلى المناعة التي تعالج الورمية المحتملة، يمكن تطبيق البروتوكول نفسه في الفئران الأشخاص استخدام PSCs مورين. كذلك نحن ترانسدوسيد الأمنية الخاصة المستخدمة في هذه الورقة مع جين مراسل مزدوجة-الانصهار مكن تصوير المسلسل الإضاءة الحيوية المجراة في خلايا تم تسليمها. تمكين استخدام التصوير الجينات مراسل تتبع المسلسل PSC أو PSC-مشتقات المجراة في دون الاضطرار إلى الاعتماد على نيكروبسي وعلم الأنسجة لتعقب حجم أو نمو الورم24. وقد أكدت دراسات سابقة العلاقة بين كثافة إشارة BLI وورم حجم25،26. وصف PSCs مع جين مراسل مزدوجة-فيوجن هو خطوة اختيارية يمكن تجاوزها صالح أساليب أخرى لتقدير حجم عبء الورم، مثل نيكروبسي.
لإدخال تعديلات على البروتوكول الإشعاع، يمكن تطبيق جرعات مختلفة لعلاج الأورام السريري. لأغراض هذه الورقة، قد انتخبنا لعلاج الحيوانات الممثل مع 18 غراي التي تديرها في ثلاث جرعات من غراي 6 نظراً لما يزيد على 3 أيام متواصلة. ميزة لا تدير جميع غراي 18 في إعداد واحد أن الجرعات المنخفضة من الإشعاع متباعدة تلف الأنسجة المجاورة عدا الحد والاعتلال الثانوية لابرت. المرضى الذين يتلقون إبرت في إعدادات السريرية غالباً ما تتلقى جرعات منخفضة متباعدة عبر العديد من العلاجات المختلفة لهذه الأسباب نفسها27. وينبغي اتباع خطوات أخرى من البروتوكول كما هو مبين.
تذرية الورم عن طريق تشعيع هو استراتيجية علاج واعدة ل teratomas المستمدة من الخلايا الجذعية، التي غالباً ما يتم تسليمها إلى مناطق لا يمكن الوصول إليها جراحيا. وتوفر هذه الدراسة الأدلة أن إبرت يشكل أداة فعالة لعلاج teratomas المستمدة من PSC. ويتطلب هذا النهج بسيطة الحصول على صور عالية الاستبانة الأشعة المقطعية لموضوع، وبعدها يمكن أن يشرع سلسلة من الحزم الإشعاعية تشعيع هدفا لجرعة المطلوب مع تجنب النسيج المجاور20. في هذه الدراسة، استخدمت عوارض عرضية اثنين لعلاج تيراتوما المستمدة من PSC تحت الجلد مع تجنيب الأنسجة المحيطة، فضلا عن تيراتوما التحكم كونترالاتيرال. علاج الورم إبرت على حد سواء فعالة وقوية وسريريا ممكناً، وعلى النقيض من الأساليب التي تعتمد على جزيئات صغيرة والأجسام المضادة وما قبل الانفصال لمنع تكون الورم.
وهناك مزايا كبيرة لهذا النهج. أولاً، الإشعاع شعاع خارجي هو طريقة مقبولة سريرياً لعلاج الأورام التي تم استخدامها في معالجة العديد من أنواع الأورام، بما في ذلك أورام الخلية الجرثومية19. خلافا لسائر استراتيجيات العلاج، لا إبرت بتعديل الخصائص الوظيفية للخلايا الجذعية قبل أو أثناء تسليم خلية15. وعلاوة على ذلك، إبرت لا تتداخل مع الوضع أو تسليم عدد الخلايا، وهكذا، له تأثير ضئيل على فعاليتها المحتملة. تشعيع المستهدفة يقلل أيضا من الضرر خارج الهدف للأجهزة الأخرى، مقارنة بالعلاج الكيميائي. وأخيراً، بغض النظر عن استراتيجية المعالجة المسبقة، إبرت يوفر خيار "الإخفاق" التي يمكن الاعتماد عليها في حالة تشكيل الأورام. ومع ذلك، هناك قيود على مستقبل اعتماد إبرت لعلاج تيراتوما المرتبطة بالخلايا الجذعية. أولاً، يتطلب العملية التصوير المتكرر وتقديم العلاج، والتي، من ناحية سريرية، ويمكن أن تكون مرهقة. أيضا، اعتماداً على موقع إيصال الخلايا الجذعية، هذا النهج قد يثبت خطر أكبر إذا كانت الأنسجة راديوسينسيتيفي في مسار الشعاع. أخيرا، إذا كانت الخلايا الجذعية نشر عناصره خارج مواقع الحقن والنموذج تيراتوماس في أجهزة متعددة، فقد يصبح من صعوبة تطبيق هذه الاستراتيجية دون الاعتلال المرضى كبير.
وفي الختام، نحن نقدم نموذجا لخلق teratomas المستمدة من PSC في طراز ماوس وتبين طريقة موثوقة التشعيع CT الدقيقة التي تمكن من تخفيض عبء الورم المستهدفة. يمكن استخدام هذه الأساليب لمقارنة الفعالية العلاجية لابرت مع استراتيجيات العلاج تيراتوما أخرى أو لتقييم قيمة إبرت في القضاء على أنواع أخرى من الأورام.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
الكتاب ليس لها علاقة بالكشف عن.
Acknowledgments
الكتاب يود أن يشكر الوطنية معاهد للصحة R01 HL134830 (المعر) و K08 HL135343 (KS) 5F32HL134221 (جور)؛ معهد هوارد هيوز الطبي (ASL)؛ وفي "جامعة ستانفورد" القلب والأوعية الدموية المعهد (ASL) لدعمهم.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Induced Pluripotent Stem Cell Control Line | Stanford University | Nguyen Lab | Cell culture of iPSC |
| Corning matrigel basement membrane matrix 354234 | Fisher Scientific | CB-40234 | Cell culture of iPSC |
| Essential 8 culture medium | ATCC-The global bioresource center | 30-2203 | Cell culture of iPSC |
| Tryple E | Gibco | 12605-036 | Cell culture of iPSC |
| Y27632 inhibitor 2 HCL (ROCK Inhibitor) | Fisher Scientific | S104950MG | Cell culture of iPSC |
| Lentivirus | Cyagen | P170721-1001cjn | Transduction of iPSC with double fusion reporter gene |
| Polyrbrene Infection/Transfection Reagent | Millipore Sigma | TR-1003-G | Transduction of iPSC with double fusion reporter gene |
| Fluc-eGFP reporter gene driven by ubiquitin promoter | Stanford University | Sam Gambhir lab | Transduction of iPSC with double fusion reporter gene |
| D-luciferin | Perkin Elmer | 122799 | Transduction of iPSC with double fusion reporter gene and BLI |
| Flow cytometer (BD FACSARIA III) | BD Biosciences | FACSAria | Transduction of iPSC with double fusion reporter gene |
| microplate spectrofluorometer (Glomax Navigator System) | Promega Bio Systems, Sunnyvale, CA | GM2000 | Transduction of iPSC with double fusion reporter gene |
| Xenogen IVIS 200 | Perkin Elmer | 124262 | BLI |
| Isoflurane | Sigma-Aldrich | CDS019936 | irradiation |
| X-Rad SmART image-guided irradiator | Precision X-ray Inc., North Branford, CT | X-Rad SmART | irradiation |
| RT_Image software package | Stanford University (http://rtimage.sourceforge.net/) | RT_Image v0.2β | Irradiation |
References
- Sallam, K., Wu, J. C. Embryonic stem cell biology: insights from molecular imaging. Methods in Molecular Biology. 660, 185-199 (2010).
- Lee, A. S., Tang, C., Rao, M. S., Weissman, I. L., Wu, J. C. Tumorigenicity as a clinical hurdle for pluripotent stem cell therapies. Nature Medicine. 19 (8), 998-1004 (2013).
- Amariglio, N., et al. Donor-derived brain tumor following neural stem cell transplantation in an ataxia telangiectasia patient. PLOS Medicine. 6 (2), e1000029 (2009).
- Kuriyan, A. E., et al. Vision Loss after Intravitreal Injection of Autologous "Stem Cells" for AMD. The New England Journal of Medicine. 376 (11), 1047-1053 (2017).
- Berkowitz, A. L., et al. Glioproliferative Lesion of the Spinal Cord as a Complication of "Stem-Cell Tourism". The New England Journal of Medicine. 375, 196-198 (2016).
- Zhang, W. Y., de Almeida, P. E., Wu, J. C. Teratoma formation: A tool for monitoring pluripotency in stem cell research. StemBook. , The Stem Cell Research Community. (2012).
- Scott, C. T., Magnus, D. Wrongful termination: lessons from the Geron clinical trial. STEM CELLS Translational Medicine. 3 (12), 1398-1401 (2014).
- Strauss, S. Geron trial resumes, but standards for stem cell trials remain elusive. Nature Biotechnology. 28 (10), 989-990 (2010).
- Coghlan, A. Unexpected mutations put stem cell trial on hold. New Scientist. 227 (3033), 9 (2015).
- Tang, C., et al. An antibody against SSEA-5 glycan on human pluripotent stem cells enables removal of teratoma-forming cells. Nature Biotechnology. 29 (9), 829-834 (2011).
- Lee, A. S., et al. Effects of cell number on teratoma formation by human embryonic stem cells. Cell Cycle. 8 (16), 2608-2612 (2009).
- Tano, K., et al. A novel in vitro method for detecting undifferentiated human pluripotent stem cells as impurities in cell therapy products using a highly efficient culture system. PLoS One. 9 (10), e110496 (2014).
- Kuroda, T., et al. Highly sensitive in vitro methods for detection of residual undifferentiated cells in retinal pigment epithelial cells derived from human iPS cells. PLoS One. 7 (5), e37342 (2012).
- Cao, F., et al. In vivo visualization of embryonic stem cell survival, proliferation, and migration after cardiac delivery. Circulation. 113 (7), 1005-1014 (2006).
- Cao, F., et al. Molecular imaging of embryonic stem cell misbehavior and suicide gene ablation. Cloning Stem Cells. 9 (1), 107-117 (2007).
- Kotini, A. G., de Stanchina, E., Themeli, M., Sadelain, M., Papapetrou, E. P. Escape Mutations, Ganciclovir Resistance, and Teratoma Formation in Human iPSCs Expressing an HSVtk Suicide Gene. Molecular Therapy - Nucleic Acids. 5, e284 (2016).
- Smith, A. J., et al. Apoptotic susceptibility to DNA damage of pluripotent stem cells facilitates pharmacologic purging of teratoma risk. STEM CELLS Translational Medicine. 1 (10), 709-718 (2012).
- Choo, A. B., et al. Selection against undifferentiated human embryonic stem cells by a cytotoxic antibody recognizing podocalyxin-like protein-1. Stem Cells. 26 (6), 1454-1463 (2008).
- Yorke, E., Gelblum, D., Ford, E. Patient safety in external beam radiation therapy. American Journal of Roentgenology. 196 (4), 768-772 (2011).
- Zhou, H., et al. Development of a micro-computed tomography-based image-guided conformal radiotherapy system for small animals. International Journal of Radiation Oncology • Biology • Physics. 78 (1), 297-305 (2010).
- Slatkin, D. N., Spanne, P., Dilmanian, F. A., Gebbers, J. O., Laissue, J. A. Subacute neuropathological effects of microplanar beams of x-rays from a synchrotron wiggler. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 92 (19), 8783-8787 (1995).
- Lee, A. S., et al. Brief Report: External Beam Radiation Therapy for the Treatment of Human Pluripotent Stem Cell-Derived Teratomas. Stem Cells. 35 (8), 1994-2000 (2017).
- Berkowitz, A. L., et al. Glioproliferative Lesion of the Spinal Cord as a Complication of "Stem-Cell Tourism". The New England Journal of Medicine. 375 (2), 196-198 (2016).
- Swijnenburg, R. J., et al. In vivo imaging of embryonic stem cells reveals patterns of survival and immune rejection following transplantation. Stem Cells and Development. 17 (6), 1023-1029 (2008).
- Cao, F., et al. Noninvasive de novo imaging of human embryonic stem cell-derived teratoma formation. Cancer Research. 69 (7), 2709-2713 (2009).
- Priddle, H., et al. Bioluminescence imaging of human embryonic stem cells transplanted in vivo in murine and chick models. Cloning and Stem Cells. 11 (2), 259-267 (2009).
- Dale, R. G.
