Summary
多能性幹細胞由来の奇形の治療戦略に関する研究は、幹細胞治療の臨床翻訳にとって重要です。ここでは、まず、マウスや、その後、選択的にターゲットに幹細胞由来の奇形を生成し、小動物照射を用いた生体内でのこれらの腫瘍を扱うのためのプロトコルについて述べる。
Abstract
「幹細胞ツーリズム、」無秩序な世界、幹細胞移植の犠牲者の数の増加は、幹細胞移植の安全性について懸念を調達していますいます。奇形移植の時にまだ残留未分化幹細胞の存在から生じるまたは区別の自発の突然変異から未分化細胞は一般的な方法ではなく、移植が区別されるがセルです。幹細胞療法はしばしば解剖学的に敏感なサイトに配信される、ので小さい腫瘍が臨床的に壊滅的な失明、麻痺、認知の異常、循環不全の結果することができます。これらのサイトへの手術は、いくつかの治療オプションを持つ患者を残して、制限もあります。幹細胞の不正行為を制御する、つまり、幹細胞治療の臨床の翻訳のために重大。
外照射療法は、周囲の臓器への損傷を最小限に抑えながら奇形負担を減少する標的療法を提供する効果的な手段を提供しています。さらに、このメソッドは、遺伝子操作を回避または幹細胞のウイルスの伝達は追加臨床安全性と有効性の問題に関連付けられています。ここでは、マウスで多能性幹細胞由来の奇形を作成し、生体内で腫瘍を選択的に切除する外部ビーム放射線療法を適用するプロトコルについて述べる。
Introduction
組織再生のための幹細胞療法の開発は過去数十年で効率的な臨床配置の努力を阻害する障壁の数を発生しました。これらのハードルには、配信、幹細胞の免疫原性とフォーム奇形1に腫瘍の可能性のサイトで悪いセルの保持が含まれます。腫瘍は、幹細胞移植の受信者2に悪影響特に臨床問題となります。無秩序な幹細胞注射による腫瘍形成のアカウントは、複数の臨床設定3,4,5で既に報告されています。奇形腫形成の可能性は最も頻繁多能性幹細胞 (PSC) の開発で臨床の懸念をあげている複数知名度の高い胚性幹細胞 (ESC) の延着及び取消の結果し、誘導多能性幹細胞 (iPSC)試験6,7,8,9。したがって、必要がありますこれらの医原性の腫瘍が発生する適切な治療の提供に向けた専用並進の調査のための急務があります。
日には、幹細胞の不正行為を制御するほとんどの戦略が発癌性の潜在的な2,10と Psc の数を減らすことに焦点を当てた。残念ながら、残留細胞 (例えば., 1 × 104 1 × 105セル11) の小さい数だけは検出限界値以下までには現在利用可能なアッセイ12,によって引用される奇形の形成に必要です13これらの preseparation メソッドを使用して他の制限、低効率と高い費用、新しい組織工学的アプローチ、と細胞の潜在的な障害のために適切ではないかもしれない単一細胞懸濁液への依存。生存率と生着。
いくつかの研究は、奇形腫形成、次の治療の選択肢を対処しています。おそらく最もよく研究戦略に幹細胞14,15「自殺」遺伝子の混入であります。この方法は、遺伝子操作により救助アプローチを提供する挿入された細胞は、奇形を生成する場合、薬理学的刺激これらによって活性化することができます誘導性のアポトーシス活性化遺伝子を組み込むための幹細胞を含みます。このアプローチでは、ただし、Psc、薬剤抵抗16の漸進的な開発のための潜在的な遺伝の修正のオフターゲット効果を含む重大な欠点苦しんでいます。同様のアプローチは、抗アポトーシス経路17の抑制を介して Psc の選択的細胞死を誘導する低分子を利用しています。他のグループは、psc ポドカリキシンのような蛋白質 1 (PODXL)18など、多能性表面マーカーに対する抗体を用いて細胞死をターゲットしています。小分子や抗体の配信のタイミングは、あまりにも早く配信され、配信遅すぎる場合に治療効果がない場合 Psc の治療の可能性に大きな影響を与えるに立っています。さらに、低分子化合物や抗体のこのファッションの全身の効果が検討されていません。
これらの腫瘍の治療への代替アプローチは、外部ビーム放射線療法 (照射線量) を使用に依存します。気管支腔内照射は腫瘍19の治療に現在採用されているプライマリの様相の 1 つです。気管支腔内照射、定位手術的照射、陽子ビームの開発などの技術革新は、等角気管支腔内照射を最適奇形に対処するため、正常組織への損傷を避けながら病理構造の強化されたターゲットを有効にしています。解剖学的に敏感な構造20で形成。さらに、このメソッドは、遺伝子操作またはどちらの追加の臨床安全性に満ちている幹細胞のウイルスの伝達を回避し、効果にかかわる15。最後に、マイクロ効果反射の進歩は、齧歯動物21気管支腔内照射のアプリケーションを有効にしています。
この記事では、マウスにヒトの Ips を注入することにより奇形腫形成小動物モデルを作成する方法を示します。その後、選択的にこれらの腫瘍は周囲の組織に与えるダメージを最小限で体内を根絶するために気管支腔内照射を適用する方法を示します。このアプローチでは、生体分子やペプチドの全身の配信と、Psc の遺伝的操作のオフターゲット効果を回避しながら PSC 由来の奇形の標的療法を提供します。治験の目的へと生物発光イメージング (結合) を介して腫瘍に対して放射線療法を追跡するレポーター遺伝子を幹細胞を変換するオプションの手順を提供しています。
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Protocol
この動物実験は承認され、制度の検討委員会とスタンフォード大学の研究所動物愛護管理パネルの下で行われます。
1. Ips の培養
- 基底膜マトリックス (例えば、マトリゲル、ここに至ってマトリックスと呼ばれる) をコーティングした 6 ウェル プレートにレンチ ウイルス リプログラミングによる人間の Ips を成長します。
- 毎日濃縮培養液中で Ips のメディアの変更 (材料の表を参照) を 37 ° C、5% CO2でインキュベートします。
- セルが 80-90% 合流点 (約 4 日) に達すれば、遺伝子組換え細胞解離酵素の 1 つの mL を追加 (材料表参照) あたりも、5 分の 37 ° C で孵化させなさい。
- 5 分後にピペッティングで井戸から細胞を分離、15 mL チューブに移して、300 × gで遠心分離機します。
- 、遠心分離後、上清を吸引し、濃縮培養液中に細胞ペレットを再懸濁します縮尺希釈 Y27632 阻害剤の濃縮 (材料の表を参照してください)。
- 解離細胞の細胞数を実行し、2 x 105 4 x 105の密度でマトリックス コート 6 ウェル プレート上のセルを replate します。
2. 二重融合レポーター遺伝子で Ips の伝達
- ルーチンに従って 6 ウェル プレートで Ips を通過し、濃縮培養液を追加 (参照材料表) 含む 6 μ G/ml hexadimethrine ブロマイド。
注:理想的なコロニーのサイズは 200-400 のセル/植民地最高の伝達効率をもたらすためです。 - ホタル ルシフェラーゼと緑の蛍光蛋白質 (流 eGFP) 4 ° C で 2 時間 50,000 x gで SW 29 ローターと堆積物の遠心分離によって人間ユビキチン プロモーター-C によって駆動を運ぶ自己不活性のレンチ ウイルスを集中します。
- 10 の感染 (MOI) の多様性で 6 ウェル プレートで Ips にウイルスの集中を追加し、5% CO2で 37 ° C で一晩インキュベートします。
注:感染症の多様性は、蛍光活性化細胞 (FACS) スキャンを選別した単量体の蛍光タンパク質の発現によって決定されました。 - 次の日は、300 x g 6 分間室温で iPSC 6 ウェル プレートの遠心分離によってウイルスを削除します。
- 濃縮培養液で毎日メディアを変更 (材料の表を参照) とプロトコルに従って通路。EGFP の近似伝達効率を決定するための蛍光顕微鏡を利用します。
- 30-40% の効率で FACS の並べ替えに十分です。場合は、少なくとも 30-40% の細胞表現 eGFP eGFP を表現する hiPSCs の FACS に進みます。
- 前のヴィヴォ流活動を確認するには、順に FACS ウェルあたり 5,000 の細胞の密度で GFP を発現している細胞をプレートします。
- 導入された細胞を孵化し、非導入細胞 (負の制御として役立つ) 発光レポーターのプローブ D-ルシフェリン (100 μmol/L) 6 h の測定マイクロ プレート蛍光と発光します。
3. 移植免疫不全マウスにおける奇形腫形成の背側の麓の Psc の
- 組換え細胞解離酵素ミックス ダブル融合レポーターの遺伝子 (流 GFP) 文化 (セクション 2 を参照) で導入した人間の Ips を含む 6 ウェル プレートごとの 1 つの mL を追加し、5 分間インキュベートします。
- 潜伏期間後、ピペットと表現による細胞を分散します。培地の等しいボリュームを追加し、4 分間 250 × gで遠心分離します。
- 遠心分離が完了したら、上澄みを吸引、行列の 30 μ L で細胞ペレットを再懸濁します、注入前にその生存率を維持するために氷の上に置きます。診断 1 x 10 の6セルの収穫を確認します。
- 二重融合レポーター遺伝子導入細胞を利用する場合は、マトリックスの 30 μ L の (セクション 2) からダブル ポジティブ FACS セルを中断します。
- 無胸腺 8-10 週間 1 L/分の酸素と 2 %isoflurance を用いたヌードマウスにおける麻酔し、酸素 1 L/min とメンテナンス 2% イソフルランを使用します。
- セル ・ マトリックスの混合物を注入 28.5 G 注射器を使用して合計 5 x 103 5 x 10 の6セル (注射あたり約 100 ul) の注射を目指して、麓の皮下組織に (材料の表を参照) を懸濁液。
- 長期間、大きな腫瘍の成長を期待してのマウスを維持するために計画する場合より尾側の注射部位を検討してください。
- 麻酔下の動物は外来まで加熱パッドで回復できる (通常 < 1 h) 呼吸の監視をすると爪先の色を皮膚外来まで。
4. 発光細胞生存率と奇形成長を評価するために移植細胞の (結合) をイメージング
- 接種後必要な縦長、マウスにレポーターのプローブ D-ルシフェリンの 375 mg/kg の腹腔内 (IP) 注入を実行します。
- IP 注射、イメージ、発光後 10 分は 5 分間隔で 1 分取得 windows を使用して 30 分間麻酔下の動物 (に記載されているステップ 3.5 として実行) 信号します。
注:毎週画像取得をお勧めします。麻酔はイソフルレンを介して鼻の円錐形の吸入を提供するによって維持イメージ投射の間。 - データ分析のためバリ信号上に利益 (率 ROI) の領域を描画し、集録時間単位で 1 秒毎ステラジアン (/sr 光子/s/cm2) 平方センチメートルあたり最大光子の排出量を定量化するため、正常化します。
5. 奇形照射前臨床画像誘導照射 (図 1) を使用して
- 100 %1 L/分の流量で酸素の 2% イソフルランを使用してノックダウンのボックスにマウスを麻酔します。マウス完全に麻酔をかけられ後、は、画像誘導の前臨床照射のベッドにそれを転送 (材料の表を参照してください)。2% イソフルレンで麻酔を維持継続を介して鼻の円錐形。
- 400 投影像 40 kVp、2 mA x 線ビームを使用して 360 ° のセットとしてマイクロ CT 画像を取得し、0.2 mm の等方性ピクセル サイズの体積のイメージにそれらを再構築します。
- RT_Image ソフトウェア パッケージ (http://rtimage.sourceforge.net/) を使用してマイクロ CT 画像を用いた放射線治療を計画し、治療を行います。
注:使用される治療計画は、2 つ 225 kVp x 線ビーム、マウスの残りの部分の表面を幅木と基になる臓器を温存しながら表面的なターゲットの奇形を通過する指向で構成されます。梁の露出時間は、ターゲット腫瘍部の線量が 6 Gy 四半期システム校正データに基づいて調整されます。 - ターゲット腫瘍に 18 Gy の合計を提供する 3 つの連続した日に治療のプロセスを繰り返します。
- 動物ケア標準後処理を維持します。
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Representative Results
注入されたマウスは通常 4-8 週間バリ (図 2) をイメージングによって確認された後奇形成長形成を示します。ルシフェラーゼ信号 (図 2) の重要な減少の結果セル配信後 1 ヶ月を与えられた 18 Gy の累積線量で照射したとき、腫瘍は大幅に縮小されます。重要なは、正常組織の放射線照射のサイトから 5 ミリメートルで撮影は重要な損害 (図 3) に表示されません。
図 1: 気管支腔内照射で腫瘍の治療プロトコルの概略図。(A) 麻酔下の動物は、照射に配置され、固定化しました。対象となる治療のため奇形をローカライズする (B) A スカウト画像が作成されます。(C) RT_Image ソフトウェア パッケージを使用して、x 線ビームは選択した腫瘍をターゲットに配置されます。照射前にコリメータや動物の位置を確認します。(D) の合計 6 Gy の放射線照射イベント22あたり腫瘍ターゲットに配信されます。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 2: 成功の播種細胞選択的に放射線を扱うことができるかなり大きい腫瘍の結果。(A) 代表バリの処理 (右)、未処理の (左) 奇形が表示されます。総数 1 x 106恒常流/eGFP を表現する人間の Psc を免疫不全マウスの両方の背側面に注入しました。一方、非照射側は成長を続け、照射側はルシフェラーゼ信号の低下が示すように、劇的に縮まった。(B) この線グラフは照射対非照射 PSC 由来腫瘍におけるルシフェラーゼ信号の減少を示しています。時間をかけて奇形の体内キャリパ測定 (C) 変化。奇形のサイズ減少を照射したに対し、非照射の奇形は、時間をかけてサイズが増加。(左) 未処理と処理 PSC 由来腫瘍 (右) の A (D) 総組織は、18 Gy 照射22の合計後サイズのマーク付きの減少を示しています。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 3: 肝臓、腸、筋肉などの周囲の組織に与えるダメージを最小限に納入実績を対象とします。周囲の組織は細胞拡散の保全と細胞の老化とアポトーシスの不在を含む照射損傷の兆候を持ってないです。組織は、14 日間 postirradiation で照射部位から 5 mm を採取しました。(A) ヘマトキシリン ・ エオジン染色隣接組織の通常のアーキテクチャを示しています。(B) キ67 染色 (に示すようにアクア) は、肝臓、腸、および筋細胞の細胞増殖が保持されることを示します。核と 4', 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI)、青で示されている counterstained が。(C) A β-ガラクトシダーゼ老化アッセイは、細胞の老化 (すなわち、緑染色の不在) の証拠を示さない。(D) 遊離トランスフェラーゼ (TdT) dUTP ニック終わりラベリング (TUNEL) はアポトーシス (すなわち、赤核染色の不在) を示しています。核は、DAPI、青い22に示すように、counterstained が。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
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Discussion
前臨床データと「幹細胞ツーリズム」の犠牲者からの逸話的なケース奇形を発症するリスクが PSC 治療23に関連付けられている深刻な欠点であることを確認します。予防し、治療の幹細胞治療に関連付けられている悪性腫瘍のリスクに慎重なアプローチの開発は、したがって、再生幹細胞療法の臨床の翻訳を促進する上で重要なステップです。この記事では、マウス モデルにおける気管支腔内照射を用いた PSC 関連付けられている奇形の治療を特定する方法を説明し、バリ イメージングを用いた照射腫瘍の動的な萎縮を示した。
人間の Ips を活用、リプログラミング法レンチ ウイルスによって作成された、生体内で奇形の形成を要約するヌードマウス モデルで注入します。裸のマウスの使用は、細胞の異種間注入による初期免疫拒絶反応を回避できます。免疫欠損マウスの使用は、発癌性の可能性を増強する、間同じプロトコルはマウスの Psc を利用した免疫マウスにおける適用でした。我々 はさらに配信された細胞のシリアル生物発光イメージングを有効に二重融合レポーターの遺伝子のこのペーパーで使用される Psc を導入しました。レポーター遺伝子イメージングの使用には、剖検やサイズまたは腫瘍24の成長を追跡する組織に頼ることがなく PSC または PSC 誘導体の生体内でのシリアルの追跡が有効になります。先行研究は、バリの信号強度と腫瘍サイズ25,26との相関を確認しました。二重融合レポーター遺伝子と Psc をラベリングは腫瘍の負担定量化、剖検などの他の方法を支持してバイパスすることができますオプションのステップです。
放射のプロトコルへの変更、異なる用量も臨床腫瘍治療のため適用可能します。本稿の目的、18 Gy 6 Gy 以上 3 日間連続を与えられるの 3 つの用量で投与と代表的な動物を治療することとしました。1 つの設定ですべての 18 Gy のない管理の利点は、放射線の低用量の間隔を離れて制限隣接組織の損傷と二次気管支腔内照射の罹患率です。臨床現場でしばしば気管支腔内照射を受けている患者は、低用量のこれらの同じ理由から27の多くの異なった処置上の間隔を受け取る。プロトコルの他の手順は、とおりに従ってください。
照射により腫瘍焼灼は、しばしば外科的アクセスできない領域に配信される幹細胞由来の奇形に対する有望な治療戦略です。本研究では、気管支腔内照射が PSC 由来の奇形の治療のための効果的なツールを構成することの証拠を提供します。この単純なアプローチには、件名、その後放射線ビームのシリーズが隣接する組織20を回避しながら目的の線量をターゲットに照射する規定する高分解能 CT 画像の取得が必要です。本研究では 2 つの接線方向の梁は対コントロール奇形と同様に周囲の組織を温存しながら皮下 PSC 由来の奇形を治療するために使用されました。気管支腔内照射の腫瘍の治療は、効率的なと堅牢、かつ臨床的に実行可能な小さい分子、抗体、および腫瘍の形成を防ぐために事前の分離に依存するメソッドとは対照的です。
この方法の重要な利点があります。まず、外部ビーム放射線が生殖細胞腫瘍19を含む、多くの種類の腫瘍の治療に使用されている腫瘍の治療の臨床的に受け入れられているモダリティ。他の治療とは異なり、気管支腔内照射は携帯配信15時に前に幹細胞の機能特性を変更しません。また、気管支腔内照射はモードと干渉しないかセルの数が配信され、したがって、最小限の影響は、彼らの潜在的な効果。ターゲットを絞った照射は化学療法と比較して、他の臓器にもオフのターゲット損傷を軽減します。最後に、前処理方法に関係なく、気管支腔内照射は腫瘍形成が発生した場合に依存することができます「フェイル セーフ」オプションを提供します。それにもかかわらず、幹細胞の奇形を治療するため気管支腔内照射の今後の採用に制限があります。まず、繰り返しイメージングおよび療法は、臨床の立場からは、面倒なことの配信プロセスが必要です。また、幹細胞配達地域、に応じてこのアプローチかもしれないリスクが高い放射線感受性の組織がビーム経路にある場合。最後に、幹細胞は注入と多臓器に奇形をフォームのサイトを越えて全身発信する場合、重大な患者合併症なしこの戦略を適用することは困難があります。
結論として、我々 はマウス モデルにおける PSC 由来の奇形の作成のモデルを提供してマイクロ CT 照射腫瘍負荷の削減の目標を可能にする信頼性の高い方法を実演します。他の奇形腫の治療戦略と気管支腔内照射の治療効果を比較するまたは他のタイプの腫瘍を根絶することで気管支腔内照射の値を評価するため、これらのメソッドを使用できます。
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Disclosures
著者が明らかに何もありません。
Acknowledgments
著者は国家機関の健康 R01 HL134830 (PKN)、K08 HL135343 (KS)、および 5F32HL134221 を感謝したい (JWR);ハワード ヒューズ医学研究所 (ASL);彼らのサポートのためスタンフォード大学心臓血管研究所 (ASL)。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Induced Pluripotent Stem Cell Control Line | Stanford University | Nguyen Lab | Cell culture of iPSC |
| Corning matrigel basement membrane matrix 354234 | Fisher Scientific | CB-40234 | Cell culture of iPSC |
| Essential 8 culture medium | ATCC-The global bioresource center | 30-2203 | Cell culture of iPSC |
| Tryple E | Gibco | 12605-036 | Cell culture of iPSC |
| Y27632 inhibitor 2 HCL (ROCK Inhibitor) | Fisher Scientific | S104950MG | Cell culture of iPSC |
| Lentivirus | Cyagen | P170721-1001cjn | Transduction of iPSC with double fusion reporter gene |
| Polyrbrene Infection/Transfection Reagent | Millipore Sigma | TR-1003-G | Transduction of iPSC with double fusion reporter gene |
| Fluc-eGFP reporter gene driven by ubiquitin promoter | Stanford University | Sam Gambhir lab | Transduction of iPSC with double fusion reporter gene |
| D-luciferin | Perkin Elmer | 122799 | Transduction of iPSC with double fusion reporter gene and BLI |
| Flow cytometer (BD FACSARIA III) | BD Biosciences | FACSAria | Transduction of iPSC with double fusion reporter gene |
| microplate spectrofluorometer (Glomax Navigator System) | Promega Bio Systems, Sunnyvale, CA | GM2000 | Transduction of iPSC with double fusion reporter gene |
| Xenogen IVIS 200 | Perkin Elmer | 124262 | BLI |
| Isoflurane | Sigma-Aldrich | CDS019936 | irradiation |
| X-Rad SmART image-guided irradiator | Precision X-ray Inc., North Branford, CT | X-Rad SmART | irradiation |
| RT_Image software package | Stanford University (http://rtimage.sourceforge.net/) | RT_Image v0.2β | Irradiation |
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