Summary
Onderzoek inzake behandelingsstrategieën voor pluripotente stamcel-afgeleide teratomas is belangrijk voor de klinische vertaling van stamcel therapie. Hier beschrijven we een protocol, ten eerste genereren van stamcellen cel afkomstige teratomas in muizen en vervolgens selectief doel en behandeling van deze tumoren in vivo met behulp van een kleine-dier-irradiator.
Abstract
Het groeiende aantal slachtoffers van "stamcel toerisme," de niet-gereglementeerde transplantatie van stamcellen wereldwijd, heeft hun bezorgdheid over de veiligheid van stamceltransplantatie. Hoewel de transplantatie van gedifferentieerde in plaats van de ongedifferentieerde cellen is gebruikelijk, teratomas nog kunnen voortvloeien uit de aanwezigheid van residuele ongedifferentieerde stamcellen op het moment van transplantatie of van spontane mutaties in gedifferentieerde cellen. Omdat stamcel-therapieën worden vaak geleverd in anatomisch gevoelige sites, kunnen zelfs kleine tumoren rampzalig zijn klinisch, resulterend in blindheid, verlamming, cognitieve afwijkingen en cardiovasculaire dysfunctie. Chirurgische toegang tot deze sites kan ook worden beperkt, waardoor patiënten met weinig therapeutische opties. Beheersing van wangedrag van de cel van de stam is, daarom, cruciaal voor de klinische vertaling van stamcel therapie.
Externe lichtbundel straling biedt een doeltreffend middel voor het leveren van gerichte therapie te verlagen van de lasten Teratoom terwijl het minimaliseren van schade aan het omringen van organen. Bovendien, deze methode voorkomt genetische manipulatie of virale transductie van stamcellen-die zijn gekoppeld aan de extra klinische veiligheid en werkzaamheid zorgen. Hier beschrijven we een protocol pluripotente stamcel afkomstige teratomas bij muizen te maken en toe te passen therapie van de straling van de externe straal om selectief lasertherapie deze tumoren in vivo.
Introduction
De ontwikkeling van stamcel-therapieën voor weefselregeneratie is opgetreden een aantal belemmeringen in de afgelopen decennia, hinderen inspanningen voor efficiënte klinische inzet. Deze hindernissen zijn arme cel retentie bij plaatsen van levering, stamcel immunogeniciteit en de neoplastische potentie om vorm teratomas1. Tumorigeniciteit is van bepaalde klinische zorg zoals het stamcel transplantatie ontvangers2kan beschadigen. Rekeningen van tumor vorming als gevolg van de cel van de stam van de niet-gereglementeerde injecties zijn al gemeld in meerdere klinische instellingen3,-4,5. Het potentieel voor Teratoom vorming is de meest vaak aangehaald klinische zorg in pluripotente stamcel (PSC) ontwikkeling en heeft geresulteerd in vertragingen en annuleringen van meerdere spraakmakende embryonale stamcellen (ESC) en geïnduceerde pluripotente stamcel (iPSC) proeven6,7,8,9. Er is dus een dringende noodzaak voor een translationeel onderzoek gewijd naar de juiste behandeling, moeten deze iatrogene tumoren ontstaan.
Tot op heden hebben de meeste strategieën ter controle van de stamcel wangedrag gericht op het verminderen van het aantal van de PSC's met tumorigene potentiële2,10. Helaas, slechts een klein aantal resterende cellen (.bijvoorbeeld 1 x 10,4 tot en met 1 x 105 cellen11) is vereist voor Teratoom formatie, die is ver beneden de detectiegrens geciteerd door de momenteel beschikbare testen12, 13. andere beperkingen van het gebruik van deze preseparation methoden bestaan uit lage efficiëntie en hoge kosten, afhankelijkheid van één cel schorsingen die mogelijk niet geschikt is voor nieuwere weefselengineering benaderingen, en de mogelijke bijzondere waardevermindering van cel overleving en engraftment.
Enkele studies hebben aangepakt behandelingsopties Teratoom vorming volgen. Misschien is de meest goed bestudeerde strategie de opneming van "zelfmoord" genen in stamcellen14,15. Deze methode houdt het genetisch manipuleren van de cellen van de stam te nemen een afleidbare activeren van apoptosis gene die kan worden geactiveerd door stimulatie van de farmacologische postinjection, waardoor een redding aanpak als ingespoten cellen teratomas produceren. Deze benadering hebben echter te lijden onder belangrijke nadelen, met inbegrip van uit-target effecten van genetische modificaties van PSC's en de mogelijkheden voor een geleidelijke ontwikkeling van drug weerstand16. Een soortgelijke aanpak maakt gebruik van kleine moleculen om selectieve celdood van PSC's via de remming van de anti-apoptotic trajecten17. Andere groepen zijn gericht op de dood van de cel van de PSC's met behulp van antilichamen tegen pluripotent oppervlakte markers, zoals podocalyxin-achtige eiwitten-1 (PODXL)18. De timing van de kleine-molecuul of antilichaam levering staat een aanzienlijke impact hebben op de therapeutische mogelijkheden van PSC's als geleverd te vroeg en therapeutische werking ontbreken mag als te laat geleverd. Daarnaast zijn de systemische effecten van kleine moleculen en antilichamen gebruikt in deze mode niet onderzocht.
Een alternatieve benadering voor de behandeling van deze tumoren, is afhankelijk van de lichtbundel externe radiotherapie (EBRT) gebruiken. EBRT is één van de primaire modaliteiten die momenteel werkzaam in de behandeling van solide tumoren19. Innovaties in EBRT, met inbegrip van de ontwikkeling van de proton en stereotactische radiochirurgie, hebt ingeschakeld de verbeterde afstemming van pathologische structuren terwijl het vermijden van schade aan normale weefsel, waardoor de hoekgetrouwe EBRT ideaal is voor het aanpakken van Teratoom vorming in anatomisch gevoelige structuren20. Bovendien, deze methode voorkomt de genetische manipulatie of virale signaaltransductie van cellen van de stam, die beide beladen met extra klinische veiligheid en werkzaamheid heeft betrekking op15. Tot slot hebben vooruitgang in micro-irradiators de toepassingvan EBRT in knaagdieren21ingeschakeld.
In dit artikel laten we zien hoe een kleine-dier om model te maken van Teratoom vorming door het injecteren van menselijke iPSCs in muizen. Vervolgens laten we zien hoe toe te passen van EBRT selectief uitroeiing van deze tumoren in vivo met minimale schade aan het omliggende weefsel. Deze aanpak biedt een gerichte therapie voor PSC-afgeleide teratomas terwijl het vermijden van de effecten van de af-target van de systemische afgifte van biologische moleculen en peptiden en de genetische manipulatie van de PSC. Voor experimentele doeleinden bieden wij een optionele stap om de cellen van de stam met reporter genen voor het bijhouden van tumor respons op stralingstherapie via bioluminescentie imaging (BLI) transduce.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Dit dier experiment werd goedgekeurd en uitgevoerd onder de institutionele Review Board en het administratieve Panel on Laboratory Animal Care aan Stanford University.
1. de celcultuur van iPSCs
- Menselijke iPSCs afgeleid door lentivirale herprogrammering op 6-Wells-platen bekleed met kelder membraan matrix (bv. matrigel, aangeduid als matrix tonkilometers) groeien.
- Dagelijks veranderen de media van de iPSCs met verrijkte kweekmedium (Zie Tabel van materialen) incuberen bij 37 ° C en 5% CO2.
- Zodra de cellen bereiken 80 – 90% samenvloeiing (ongeveer elke 4 dagen), voeg 1 mL van recombinante cel-dissociatie enzym (Zie Tabel van materialen) per goed en Incubeer bij 37 ° C gedurende 5 minuten.
- Na 5 min, distantiëren van de cellen uit de put door pipetteren hen overbrengen in een tube van 15 mL en centrifugeer bij 300 x g.
- Na het centrifugeren, gecombineerd het supernatant en resuspendeer de pellet cel in verrijkte kweekmedium (Zie Tabel van materialen) verrijkt met Y27632-remmer bij een verdunning 1:1,000.
- Het uitvoeren van een telling van de cel van de gedissocieerde cellen en replate cellen in de matrix beklede 6-Wells-platen op een bevolkingsdichtheid van 2 x 10,5 tot en met 4 x 10,5.
2. signaaltransductie van iPSCs met een Double-fusion Reporter Gene
- Passage iPSCs in 6-Wells-platen per routine en verrijkte kweekmedium toevoegen (Zie Tabel van materialen) met 6 µg/mL hexadimethrine bromide (en).
Opmerking: De ideale kolonie grootte is 200-400 cellen/kolonie de hoogste transductie efficiëntie opleveren. - Concentreren zelf inactiveren lentivirus uitvoering firefly luciferase en groen fluorescent proteïne (FLuc-eGFP) gedreven door menselijke ubiquitin promotor-C door sediment centrifugeren met een SW-29-rotor bij 50.000 x g gedurende 2 uur bij 4 ° C.
- Het virale concentraat toevoegen aan de iPSCs in een 6-well plaat duikt met een veelheid aan infectie (MOI) van 10 en na een nacht bebroeden bij 37 ° C bij 5% CO2.
Opmerking: De veelheid van infectie werd bepaald door de uitdrukking van de monomere fluorescentie eiwit geanalyseerd door een fluorescentie-activated cell sorting (FACS) scan. - De volgende dag, wegnemen naar de virus door centrifugeren van de iPSC 6-Wells-platen bij 300 x g gedurende 6 min bij kamertemperatuur.
- Wijzigen van de media dagelijks met verrijkte kweekmedium (Zie Tabel van materialen) en passage volgens protocol. Gebruik een fluorescentie Microscoop om na te gaan van de efficiëntie van de geschatte transductie van eGFP.
- Een rendement van 30 – 40% volstaat voor het sorteren van FACS. Ga verder met de FACS van hiPSCs eGFP uitdrukken als ten minste 30 – 40% van de cellen express eGFP.
- Plaat om te bevestigen FLuc activiteit ex vivo, de cellen uiten GFP FACS gesorteerd bij een dichtheid van 5.000 cellen per putje.
- Incubeer de cellen getransduceerde en niet-getransduceerde cellen (die zal dienen als de negatieve controle) met de Bioluminescentie verslaggever sonde D-luciferine (100 μmol/L) voor 6 h. meten de Bioluminescentie met een microplate-spectrofluorometer.
3. transplantatie van PSC's in de dorsale Flank voor Teratoom vorming in immunodeficiëntie muizen
- Voeg vervolgens 1 mL van recombinante cel-dissociatie enzym mix per 6-well plaat met menselijke iPSCs getransduceerde met een dubbel-fusion verslaggever gen (FLuc-GFP) in cultuur (zie punt 2) en incubeer gedurende 5 min.
- Na de incubatieperiode, verspreiden de cellen door Pipetteer aspiratie en expressie. Voeg een gelijk volume kweekmedium en vervolgens Centrifugeer bij 250 x g voor 4 min.
- Na centrifugeren voltooid is, de bovenstaande oplossing gecombineerd, resuspendeer de pellet cel in 30 µL van matrix, en plaats deze op het ijs te behouden de levensvatbaarheid ervan vóór injectie. Bevestig een oogst van 1 x 106 cellen met behulp van een hemocytometer.
- Als met behulp van dubbel-fusion verslaggever-gen-transfected cellen, schorsen de dubbel-positieve FACS cellen (uit sectie 2) in 30 µL van matrix.
- Induceren van verdoving in 8-10 weekse athymic naakt muizen met behulp van 2% isoflurance met 1L/min zuurstof en gebruik vervolgens onderhoud 2% Isofluraan met 1L/min voor zuurstof.
- Cel/matrix mengsel met een injectiespuit 28.5 G, injecteren (Zie Tabel van materialen) schorsing in de subcutane ruimte op de flank, streven naar een injectie van in totaal 5 x 10,3 tot 5 x 106 cellen (ongeveer 100 ul per injectie).
- Overweeg een meer caudal injectieplaats als plan om muizen langdurig en anticiperende maatregelen kunnen grote tumorgroei.
- Narcose dieren zijn toegestaan om te herstellen op een verwarmde pad tot ambulant (meestal < 1h) met monitoring van ademhaling, huid kleur van tenen tot ambulant.
4. de Bioluminescentie Imaging (BLI) van getransplanteerde cellen te beoordelen van de overleving van de cel en Teratoom groei
- Uitvoeren op de gewenste timepoints na inoculatie, een intraperitoneale injectie (IP) van 375 mg/kg van de verslaggever sonde D-luciferine in de muizen.
- 10 minuten na de injectie van een IP-, beeld de Bioluminescentie signaal in de narcose dieren (uitgevoerd als beschreven in stap 3.5) voor 30 min 1 min overname windows 5-min tussenpozen gebruikt.
Opmerking: Per afbeelding overnames worden aanbevolen. Anesthesie wordt gehandhaafd tijdens beeldvorming door het leveren van Isofluraan via een neus ingeademd. - Voor data-analyse, trekken van een regio van belang (ROI) over het BLI-signaal en vervolgens te normaliseren voor de Acquisitietijd te kwantificeren van uitstoot in eenheden van de maximale fotonen per seconde per vierkante centimeter per steradiaal (fotonen/s/cm2/sr).
5. Teratoom bestraling met behulp van een preklinische Image-guided Irradiator (Figuur 1)
- Anesthetize een muis in een vechtpartij doos met behulp van 2% Isofluraan in 100% zuurstof op een debiet van 1 L/min. Nadat de muis is volledig verdoofd, deze overbrengen aan het bed van een pre-klinisch beeld-geleide-irradiator (Zie Tabel van materialen). Handhaven van verdoving door 2% Isofluraan continu via een neus kegel.
- Verwerven van micro-CT-beelden als een verzameling van 400 projectie beelden meer dan 360° met behulp van een 40 kVp, 2 mA X-ray-balk, en die in de volumetrische beelden met een isotrope pixelgrootte van 0,2 mm reconstrueren.
- Plan een behandeling van de straling met behulp van de micro-CT-beelden met behulp van het softwarepakket RT_Image (http://rtimage.sourceforge.net/) en het uitvoeren van de behandeling.
Opmerking: Het behandelingsplan gebruikt bestaat uit twee 225 kVp X-ray balken, gericht om het passeren van de oppervlakkige doel Teratoom terwijl plinten van het oppervlak van de rest van de muis en de onderliggende ingewanden sparen. De belichtingstijden voor de balken worden aangepast op basis van elk kwartaal kalibratie systeemgegevens zodat de dosis in het midden van de doel-tumor 6 Gy was. - Herhaal de behandelingsproces op drie opeenvolgende dagen te leveren van een totaal van 18 Gy aan de target-tumor.
- Standaard nabehandeling verzorging van de dieren te handhaven.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Ingespoten muizen meestal demonstreer Teratoom groei vorming na 4 – 8 weken zoals bevestigd door BLI imaging (Figuur 2). Tumoren zal krimpen dramatisch wanneer bestraald met een cumulatieve dosis van 18 Gy gegeven van een maand na levering van de cel, wat resulteert in een aanzienlijke afname van de luciferase signaal (Figuur 2). Belangrijker, lijken normale weefsels 5 mm ontleend aan de bestraalde site niet te hebben significante schade (Figuur 3).
Figuur 1: schematische van het protocol voor de behandeling van tumoren met EBRT. (A) het narcose dier is geplaatst op de irradiator en geïmmobiliseerd. (B) een scout image is gemaakt om te lokaliseren de Teratoom voor gerichte behandeling. (C) het gebruik van het RT_Image softwarepakket, de X-ray balken te richten op de geselecteerde tumor worden uitgelijnd. Voorafgaand aan de bestraling, wordt de positie van de collimator en het dier bevestigd. (D) een totaal van 6 Gy van straling wordt geleverd aan de doelstelling van de tumor per bestraling evenement22. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 2: succesvol zaaien van cellen als resultaat grote tumoren die selectief kunnen worden behandeld met straling. (A) vertegenwoordiger BLI van behandeld (rechts) en onbehandelde (links) teratomas worden weergegeven. Een totaal van 1 x 106 menselijke PSC's constitutively uiten FLuc/eGFP aan beide dorsale flanken immunodeficiëntie muizen werden ingespoten. Terwijl de bestraalde kant groeien blijft, kromp de bestraalde kant dramatisch zoals blijkt uit de daling van het luciferase signaal. (B) deze lijngrafiek toont de afname van het signaal van de luciferase in bestraalde vs. onbestraald PSC afkomstige tumoren. (C) wijzigingen in de in vivo remklauw metingen van teratomas na verloop van tijd. Niet-bestraalde teratomas verhoogd in grootte na verloop van tijd, terwijl bestraalde teratomas daalde in grootte. (D) een bruto histologie van de onbehandelde (links) en behandelde PSC afkomstige tumor (rechts) toont een duidelijke vermindering in grootte na een totaal van 18 Gy van bestraling22. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 3: gerichte levering resultaten in minimale schade aan omliggende weefsel, met inbegrip van de lever-, darm- en spier. Omliggende weefsels hebben geen tekenen van bestraling schade, met inbegrip van het behoud van cellulaire proliferatie en het ontbreken van cellulaire senescentie en apoptosis. Weefsels zijn bemonsterd 5 mm van de bestraalde sites in 14 dagen postirradiation. (A) de haematoxyline en eosine kleuring toont de normale architectuur van het aangrenzende weefsel. (B) Ki67 kleuring (getoond in aqua) geeft aan dat cellulaire proliferatie bewaard in de lever, intestinale, en spiercellen gebleven is. Kernen zijn counterstained met 4', 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI), weergegeven in blauw. (C) A β-galactosidase senescentie assay toont geen bewijs van cellulaire veroudering (dat wil zeggen, gebrek aan groene kleuring). (D) Terminal deoxynucleotidyl transferase (TdT) dUTP Nick-End Labeling (TUNEL) toont geen apoptosis (dat wil zeggen, gebrek aan rode vlekken in de kernen). Kernen zijn counterstained met DAPI, weergegeven in blauwe22. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Bevestigen dat het risico van het ontwikkelen van teratomas een ernstig nadeel verbonden met PSC behandelingen23 ispreklinische gegevens en anekdotische gevallen van slachtoffers van "stamcel toerisme". Ontwikkeling van een zorgvuldige benadering te voorkomen en behandelen van de neoplastische risico met stamcellen therapieën is daarom een belangrijke stap bij het bevorderen van de klinische vertaling van regeneratieve stamcel-therapieën. In dit artikel, we een methode van therapeutische targeting van PSC-geassocieerde teratomas met behulp van EBRT in een muismodel beschreven en toonde dynamische atrofie van bestraalde tumoren met behulp van BLI imaging.
Wij menselijke iPSCs gebruikt, gemaakt door een lentivirus herprogrammering methode en geïnjecteerd in een naakte muizen model te recapituleren de vorming van teratomas in vivo. Het gebruik van naakt muizen vermijdt een vroege immunogene afwijzing door een kruis-soorten injectie van cellen. Terwijl het gebruik van immuun-deficiënte muizen potentiates tumorigene potentieel, kan hetzelfde protocol in immunocompetent muizen met behulp van lymfkliertest PSC's worden toegepast. We transduced verder de PSC's gebruikt in dit document met een dubbel-fusion verslaggever gen waardoor seriële bioluminescentie beeldvorming van de geleverde cellen in vivo. Het gebruik van reporter gene imaging ingeschakeld de seriële tracking van de PSC of PSC-derivaten in vivo zonder te hoeven vertrouwen op necropsie en histologie de grootte of de groei van de tumor24bijhouden. Voorafgaande studies hebben bevestigd dat de correlatie tussen BLI signaal intensiteit en25,26van de grootte van de tumor. Labelen van de PSC's met een dubbele-fusion verslaggever-gen is een optionele stap die in het voordeel van andere methoden van tumor last kwantificering, zoals necropsie kan worden omzeild.
Voor wijzigingen in het protocol van straling, kunnen verschillende doseringen worden toegepast voor preklinische tumor behandelingen. Voor de toepassing van dit artikel, hebben wij gekozen de vertegenwoordiger om dieren te behandelen met 18 Gy in drie doses van 6 Gy gegeven van meer dan 3 continue dagen toegediend. Het voordeel van het niet het beheer van alle 18 Gy in één instelling is dat lagere doseringen van straling spaced apart limiet aangrenzende weefselschade en morbiditeit secundaire met EBRT. Patiënten die van EBRT in klinische instellingen vaak ontvangen lage doseringen verdeeld over veel verschillende behandelingen voor deze dezelfde redenen27. Andere stappen van het protocol moeten worden gevolgd zoals beschreven.
Tumor ablatie via bestraling is een veelbelovende behandeling strategie voor stamcel afkomstige teratomas, die vaak in chirurgisch ontoegankelijke gebieden worden geleverd. Deze studie levert het bewijs dat EBRT een effectief instrument voor de behandeling van PVC-afgeleide teratomas is. Deze eenvoudige aanpak vereist de aankoop van hoge resolutie CT-beelden van een onderwerp, waarna een serie van straling balken kan worden voorgeschreven om te bestralen een doel aan een gewenste dosis terwijl het vermijden van aangrenzende weefsel20. In deze studie werden twee tangentiële balken gebruikt voor de behandeling van een subcutane PSC afkomstige Teratoom terwijl het sparen van het omringende weefsel, evenals de contralaterale controle Teratoom. EBRT tumor behandeling is efficiënte en robuuste, zowel klinisch haalbaar is, in tegenstelling tot methoden die afhankelijk zijn van kleine molecules, antilichamen en pre scheiding tumor vorming te voorkomen.
Er zijn aanzienlijke voordelen aan deze aanpak. Eerst, externe lichtbundel straling is een klinisch aanvaarde modaliteit van oncologische behandeling die is gebruikt bij de behandeling van vele soorten van de tumor, met inbegrip van kiemcel tumoren19. In tegenstelling tot andere behandelingsstrategieën wijzigt EBRT de functionele eigenschappen van de cellen van de stam voorafgaand aan of tijdens de cel levering15niet. Bovendien EBRT interfereert niet met de mode of aantal cellen geleverd en, dus, heeft minimale impact op hun mogelijke werkzaamheid. Gerichte bestraling vermindert ook de schade af-target naar andere organen, in vergelijking met chemotherapie. Tot slot, ongeacht de voorbehandeling strategie, EBRT biedt een "fail-safe" optie die kan worden ingeroepen in het geval van vorming van tumor. Er zijn echter beperkingen aan de toekomstige aanneming van EBRT voor de behandeling van de stamcel-geassocieerde Teratoom. Ten eerste, het proces vereist herhaalde beeldvorming en levering van therapie, die vanuit een klinisch oogpunt, kan erg onhandig zijn. Ook, afhankelijk van de locatie van de cel van de stam-levering, deze aanpak blijken hoger risico als radiosensitive weefsel in het traject van de lichtbundel. Ten slotte, als stamcellen systemisch buiten de sites van injectie en vorm teratomas in meerdere organen verspreiden, het kan moeilijk geworden om toe te passen deze strategie zonder significante morbiditeit van de patiënt.
Kortom, wij bieden een model van het creëren van PSC afkomstige teratomas in een muismodel en demonstreren van een betrouwbare methode voor micro-CT bestraling, waarmee de gerichte vermindering van de lasten van de tumor. Deze methoden kunnen worden gebruikt om het vergelijken van de therapeutische effectiviteit van EBRT met andere Teratoom behandelingsstrategieën of ter beoordeling van de waarde van EBRT in het uitroeien van de andere soorten tumoren.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben niets te onthullen.
Acknowledgments
De auteurs bedank de nationale instituten van gezondheid R01 HL134830 (PKN), K08 HL135343 (KS) en 5F32HL134221 (JWR); het Howard Hughes Medical Institute (ASL); en de Stanford cardiovasculaire Instituut (ASL) voor hun steun.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Induced Pluripotent Stem Cell Control Line | Stanford University | Nguyen Lab | Cell culture of iPSC |
| Corning matrigel basement membrane matrix 354234 | Fisher Scientific | CB-40234 | Cell culture of iPSC |
| Essential 8 culture medium | ATCC-The global bioresource center | 30-2203 | Cell culture of iPSC |
| Tryple E | Gibco | 12605-036 | Cell culture of iPSC |
| Y27632 inhibitor 2 HCL (ROCK Inhibitor) | Fisher Scientific | S104950MG | Cell culture of iPSC |
| Lentivirus | Cyagen | P170721-1001cjn | Transduction of iPSC with double fusion reporter gene |
| Polyrbrene Infection/Transfection Reagent | Millipore Sigma | TR-1003-G | Transduction of iPSC with double fusion reporter gene |
| Fluc-eGFP reporter gene driven by ubiquitin promoter | Stanford University | Sam Gambhir lab | Transduction of iPSC with double fusion reporter gene |
| D-luciferin | Perkin Elmer | 122799 | Transduction of iPSC with double fusion reporter gene and BLI |
| Flow cytometer (BD FACSARIA III) | BD Biosciences | FACSAria | Transduction of iPSC with double fusion reporter gene |
| microplate spectrofluorometer (Glomax Navigator System) | Promega Bio Systems, Sunnyvale, CA | GM2000 | Transduction of iPSC with double fusion reporter gene |
| Xenogen IVIS 200 | Perkin Elmer | 124262 | BLI |
| Isoflurane | Sigma-Aldrich | CDS019936 | irradiation |
| X-Rad SmART image-guided irradiator | Precision X-ray Inc., North Branford, CT | X-Rad SmART | irradiation |
| RT_Image software package | Stanford University (http://rtimage.sourceforge.net/) | RT_Image v0.2β | Irradiation |
References
- Sallam, K., Wu, J. C. Embryonic stem cell biology: insights from molecular imaging. Methods in Molecular Biology. 660, 185-199 (2010).
- Lee, A. S., Tang, C., Rao, M. S., Weissman, I. L., Wu, J. C. Tumorigenicity as a clinical hurdle for pluripotent stem cell therapies. Nature Medicine. 19 (8), 998-1004 (2013).
- Amariglio, N., et al. Donor-derived brain tumor following neural stem cell transplantation in an ataxia telangiectasia patient. PLOS Medicine. 6 (2), e1000029 (2009).
- Kuriyan, A. E., et al. Vision Loss after Intravitreal Injection of Autologous "Stem Cells" for AMD. The New England Journal of Medicine. 376 (11), 1047-1053 (2017).
- Berkowitz, A. L., et al. Glioproliferative Lesion of the Spinal Cord as a Complication of "Stem-Cell Tourism". The New England Journal of Medicine. 375, 196-198 (2016).
- Zhang, W. Y., de Almeida, P. E., Wu, J. C. Teratoma formation: A tool for monitoring pluripotency in stem cell research. StemBook. , The Stem Cell Research Community. (2012).
- Scott, C. T., Magnus, D. Wrongful termination: lessons from the Geron clinical trial. STEM CELLS Translational Medicine. 3 (12), 1398-1401 (2014).
- Strauss, S. Geron trial resumes, but standards for stem cell trials remain elusive. Nature Biotechnology. 28 (10), 989-990 (2010).
- Coghlan, A. Unexpected mutations put stem cell trial on hold. New Scientist. 227 (3033), 9 (2015).
- Tang, C., et al. An antibody against SSEA-5 glycan on human pluripotent stem cells enables removal of teratoma-forming cells. Nature Biotechnology. 29 (9), 829-834 (2011).
- Lee, A. S., et al. Effects of cell number on teratoma formation by human embryonic stem cells. Cell Cycle. 8 (16), 2608-2612 (2009).
- Tano, K., et al. A novel in vitro method for detecting undifferentiated human pluripotent stem cells as impurities in cell therapy products using a highly efficient culture system. PLoS One. 9 (10), e110496 (2014).
- Kuroda, T., et al. Highly sensitive in vitro methods for detection of residual undifferentiated cells in retinal pigment epithelial cells derived from human iPS cells. PLoS One. 7 (5), e37342 (2012).
- Cao, F., et al. In vivo visualization of embryonic stem cell survival, proliferation, and migration after cardiac delivery. Circulation. 113 (7), 1005-1014 (2006).
- Cao, F., et al. Molecular imaging of embryonic stem cell misbehavior and suicide gene ablation. Cloning Stem Cells. 9 (1), 107-117 (2007).
- Kotini, A. G., de Stanchina, E., Themeli, M., Sadelain, M., Papapetrou, E. P. Escape Mutations, Ganciclovir Resistance, and Teratoma Formation in Human iPSCs Expressing an HSVtk Suicide Gene. Molecular Therapy - Nucleic Acids. 5, e284 (2016).
- Smith, A. J., et al. Apoptotic susceptibility to DNA damage of pluripotent stem cells facilitates pharmacologic purging of teratoma risk. STEM CELLS Translational Medicine. 1 (10), 709-718 (2012).
- Choo, A. B., et al. Selection against undifferentiated human embryonic stem cells by a cytotoxic antibody recognizing podocalyxin-like protein-1. Stem Cells. 26 (6), 1454-1463 (2008).
- Yorke, E., Gelblum, D., Ford, E. Patient safety in external beam radiation therapy. American Journal of Roentgenology. 196 (4), 768-772 (2011).
- Zhou, H., et al. Development of a micro-computed tomography-based image-guided conformal radiotherapy system for small animals. International Journal of Radiation Oncology • Biology • Physics. 78 (1), 297-305 (2010).
- Slatkin, D. N., Spanne, P., Dilmanian, F. A., Gebbers, J. O., Laissue, J. A. Subacute neuropathological effects of microplanar beams of x-rays from a synchrotron wiggler. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 92 (19), 8783-8787 (1995).
- Lee, A. S., et al. Brief Report: External Beam Radiation Therapy for the Treatment of Human Pluripotent Stem Cell-Derived Teratomas. Stem Cells. 35 (8), 1994-2000 (2017).
- Berkowitz, A. L., et al. Glioproliferative Lesion of the Spinal Cord as a Complication of "Stem-Cell Tourism". The New England Journal of Medicine. 375 (2), 196-198 (2016).
- Swijnenburg, R. J., et al. In vivo imaging of embryonic stem cells reveals patterns of survival and immune rejection following transplantation. Stem Cells and Development. 17 (6), 1023-1029 (2008).
- Cao, F., et al. Noninvasive de novo imaging of human embryonic stem cell-derived teratoma formation. Cancer Research. 69 (7), 2709-2713 (2009).
- Priddle, H., et al. Bioluminescence imaging of human embryonic stem cells transplanted in vivo in murine and chick models. Cloning and Stem Cells. 11 (2), 259-267 (2009).
- Dale, R. G.
