Summary
Ricerca sulle strategie di trattamento per i teratomas derivati da cellule staminali pluripotenti è importante per la traduzione clinica della terapia cellulare. Qui, descriviamo un protocollo per, in primo luogo, generare teratomi derivati da cellule staminali in topi e, quindi, a selettivamente bersaglio e curare questi tumori in vivo usando un irradiatore di piccoli animali.
Abstract
Il crescente numero di vittime del "turismo delle cellule staminali," il trapianto non regolamentato delle cellule staminali in tutto il mondo, ha sollevato preoccupazioni circa la sicurezza del trapianto di cellule staminali. Sebbene il trapianto di differenziato piuttosto che cellule indifferenziate è pratica comune, i teratomas possono ancora derivano dalla presenza di cellule staminali indifferenziate residuale al momento del trapianto o da mutazioni spontanee in differenziato cellule. Perché terapie con cellule staminali sono spesso trasportate in siti anatomicamente sensibili, anche i piccoli tumori possono essere clinicamente devastanti, con conseguente cecità, paralisi, cognitive anomalie e disfunzioni cardiovascolari. L'accesso chirurgico a questi siti potrebbe essere ridotte, lasciando i pazienti con poche opzioni terapeutiche. Controllo comportamento scorretto della cellula formativa è, quindi, critico per la traduzione clinica della terapia cellulare.
Radiazione esterna del fascio offre un mezzo efficace di erogare la terapia mirata a diminuire l'onere di teratoma, riducendo al minimo lesioni di organi circostanti. Inoltre, questo metodo evita la manipolazione genetica o trasduzione virale di cellule staminali, che sono associati con clinici supplementari di sicurezza ed efficacia. Qui, descriviamo un protocollo per creare i teratomas derivati da cellule staminali pluripotenti in topi e applicare la radioterapia esterna del fascio per ablazione selettivamente questi tumori in vivo.
Introduction
Lo sviluppo di terapie con cellule staminali per la rigenerazione tissutale ha rilevato un numero di barriere in parecchi decenni passati, che ostacola gli sforzi per la distribuzione efficiente di clinica. Questi ostacoli sono conservazione scadente delle cellule ai luoghi di consegna, l'immunogenicità delle cellule staminali e il potenziale neoplastico a forma i teratomas1. Carcinogenicità è di particolare interesse clinico in quanto può potenzialmente danneggiare cellule staminali trapianto destinatari2. Conti di formazione del tumore a causa di iniezioni di cellule staminali non regolamentata sono già stati segnalati in molteplici contesti clinici3,4,5. Il potenziale per la formazione di teratoma è il più frequentemente citati preoccupazione clinica nello sviluppo delle cellule staminali (PSC) pluripotenti e ha provocato ritardi e cancellazioni di più alto profilo sulle cellule staminali embrionali (ESC) e indotta da cellule staminali pluripotenti (iPSC) prove6,7,8,9. Così, c'è una necessità urgente per una ricerca traslazionale dedicata verso fornendo trattamento appropriato, dovrebbero sorgere questi tumori iatrogenici.
Ad oggi, la maggior parte delle strategie per controllare il comportamento scorretto di cellule staminali si sono concentrati sulla riduzione del numero degli sportelli unici con potenziale cancerogeno2,10. Purtroppo, solo un piccolo numero di cellule residue (ad es.., 1 x 104 a 1 x 105 celle11) è necessario per la formazione di teratoma, che è molto di sotto del limite di rilevazione citata da saggi attualmente disponibili12, 13. altre limitazioni di utilizzo di questi metodi preseparazione includono bassa efficienza e costi elevati, dipendenza dalle sospensioni unicellulari che potrebbe non essere appropriato per più recenti approcci di ingegneria dei tessuti e il danno potenziale della cella sopravvivenza e l'attecchimento.
Pochi studi hanno affrontato le opzioni di trattamento seguendo la formazione di teratoma. Forse la strategia più ben studiata è l'incorporazione di geni di "suicidio" in cellule staminali14,15. Questo metodo consiste nel manipolare geneticamente le cellule staminali per incorporare un gene d'attivazione apoptosi inducibile che può essere attivato da postinjection di stimolazione farmacologica, fornendo così un approccio di salvataggio se iniettato le cellule producono i teratomas. Questo approccio, tuttavia, soffre di notevoli inconvenienti, tra cui gli effetti delle modificazioni genetiche di sportelli unici e il potenziale per uno sviluppo graduale di farmaco resistenza16fuori bersaglio. Un simile approccio utilizza piccole molecole per indurre la morte selettiva delle cellule degli sportelli unici via l'inibizione di anti-apoptotici vie17. Altri gruppi hanno preso di mira la morte delle cellule degli sportelli unici usando gli anticorpi contro marcatori di pluripotenza superficie, come Podocalixina-come proteina-1 (PODXL)18. I tempi di consegna della piccolo-molecola o anticorpo si trova ad avere un impatto significativo sul potenziale terapeutico degli sportelli unici, se consegnato troppo presto e può alcuna efficacia terapeutica, se consegnato troppo tardi. Inoltre, non sono stati studiati gli effetti sistemici di piccole molecole e gli anticorpi usati in questo modo.
Un approccio alternativo per il trattamento di questi tumori si basa sull'utilizzo di radioterapia esterna del fascio (EBRT). Radioterapia esterna è una delle modalità primaria attualmente impiegata nel trattamento di tumori solidi19. Innovazioni nella radioterapia esterna, compreso lo sviluppo del fascio di protoni e radiosurgery di stereotactic, hanno permesso l'ottimizzazione avanzata delle strutture patologiche, evitando danni al tessuto normale, rendendo conformal EBRT ideale per affrontare il teratoma formazione in strutture anatomicamente sensibili20. Inoltre, questo metodo evita la manipolazione genetica o trasduzione virale delle cellule staminali, che sono entrambi irto di ulteriore sicurezza clinica e l'efficacia riguarda15. Infine, gli avanzamenti in micro-irradiatori hanno permesso l'applicazione di EBRT in roditori21.
In questo articolo, dimostriamo come creare un modello di piccoli animali di formazione di teratoma iniettando iPSCs umane in topi. Abbiamo quindi illustrato come applicare EBRT per sradicare selettivamente questi tumori in vivo con minimo danno al tessuto circostante. Questo approccio fornisce una terapia mirata per i teratomas PSC-derivati, evitando gli effetti fuori bersaglio della consegna sistemica di molecole biologiche e peptidi e la manipolazione genetica degli sportelli unici. Ai fini d'investigazione, offriamo un passaggio facoltativo per trasdurre cellule staminali con geni reporter di monitorare la risposta del tumore alla radioterapia via bioluminescenza imaging (BLI).
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Protocol
Questo esperimento sugli animali è stato approvato ed eseguito sotto l'Institutional Review Board e il pannello di amministrazione su Laboratory Animal Care presso la Stanford University.
1. cella cultura di iPSCs
- Crescere umano iPSCs derivate riprogrammando lentivirali su piastre da 6 pozzetti rivestite con matrice della membrana basale (ad es., matrigel, indicato come matrice hereon).
- Cambio quotidiano di media di iPSCs con terreno di coltura arricchito (Vedi Tabella materiali) incubando a 37 ° C e 5% CO2.
- Una volta che le cellule raggiungono la confluenza di 80 – 90% (circa ogni 4 giorni), aggiungere 1 mL di enzima ricombinante cella-dissociazione (Vedi Tabella materiali) al pozzetto ed incubare a 37 ° C per 5 min.
- Dopo 5 min, dissociare le cellule dal pozzo di pipettaggio, trasferirli in una provetta da 15 mL e centrifugare a 300 x g.
- Dopo la centrifugazione, aspirare il supernatante e risospendere il pellet cellulare in terreno di coltura arricchito (Vedi Tabella materiali) arricchita con inibitore di Y27632 ad una diluizione di 1:1,000.
- Eseguire un conteggio delle cellule delle cellule dissociate e replate le celle rivestite con matrice piastre da 6 pozzetti ad una densità di 2 x 105 a 4 x 105.
2. trasduzione di iPSCs con un Gene Reporter Double-fusione
- Passaggio iPSCs in piastre da 6 pozzetti secondo routine e aggiungere il terreno di coltura arricchito (Vedi Tabella materiali) contenente bromuro di hexadimethrine µ g/mL 6.
Nota: Il formato della Colonia ideale è di 200 – 400 cellule/Colonia per produrre la massima efficienza di trasduzione. - Concentrarsi self-inattivazione dei lentivirus che trasportano firefly luciferase e verde proteina fluorescente (FLuc-eGFP) guidata da ubiquitina umana promotor-C mediante centrifugazione di sedimento con un rotore SW-29 a 50.000 x g per 2 ore a 4 ° C.
- Aggiungere il concentrato virale iPSCs in una piastra a 6 pozzetti ad una molteplicità di infezione (MOI) di 10 e incubare per una notte a 37 ° C 5% CO2.
Nota: La molteplicità di infezione è stata determinata l'espressione della proteina monomerica fluorescenza analizzata da una cella di fluorescenza-attivato l'ordinamento di scansione (FACS). - Il giorno seguente, rimuovere il virus mediante centrifugazione delle piastre 6 pozzetti iPSC a 300 x g per 6 min a temperatura ambiente.
- Cambiare il supporto quotidiano con terreno di coltura arricchito (Vedi Tabella materiali) e passaggio secondo il protocollo. Utilizzare un microscopio a fluorescenza per determinare l'efficienza di trasduzione approssimativo per eGFP.
- Un'efficienza del 30 – 40% è sufficiente per l'ordinamento di FACS. Procedere al FACS di hiPSCs che esprimono eGFP se almeno 30 – 40% delle cellule esprimono eGFP.
- Per confermare il FLuc attività ex vivo, le cellule che esprimono GFP filtrate FACS ad una densità di 5.000 cellule per pozzetto della piastra.
- Incubare le cellule trasdotte e non trasdotte cellule (che serviranno come controllo negativo) con il reporter di bioluminescenza sonda D-luciferina (100 μmol/L) per 6 h. misurare la bioluminescenza con una micropiastra spettrofluorimetro.
3. trapianto degli sportelli unici in versante dorsale per la formazione di Teratoma in topi immunodeficienti
- Aggiungere 1 mL di miscela enzima ricombinante cella-dissociazione per piastra 6 pozzetti contenenti umano iPSCs trasformata con un gene reporter di doppio-fusione (FLuc-GFP) nella cultura (cfr. sezione 2) e incubare per 5 min.
- Dopo il periodo di incubazione, disperdere le cellule mediante pipetta aspirazione ed espressione. Aggiungere un volume equivalente di terreno di coltura e poi Centrifugare a 250 x g per 4 min.
- Al termine della centrifugazione, aspirare il supernatante, risospendere il pellet cellulare in 30 µ l di matrice e posizionarlo sul ghiaccio per preservare la sua redditività prima dell'iniezione. Confermare un raccolto di 1 x 106 celle utilizzando un emocitometro.
- Se utilizzando double-fusione reporter-gene-transfettati, sospendere le cellule di FACS double-positive (dalla sezione 2) in 30 µ l di matrice.
- Indurre l'anestesia in topi nudi athymic di 8-10 settimane con 2% isoflurance 1L/min di ossigeno e quindi utilizzare manutenzione 2% isoflurane con 1L/min di ossigeno.
- Utilizzando una siringa di 28,5 G, iniettare la miscela di cellula/matrice (Vedi Tabella materiali) sospensione nello spazio sottocutaneo al fianco, con l'obiettivo per un'iniezione di totale 5 x 10 da3 a 5 x 106 cellule (circa 100 ul per iniezione).
- Prendere in considerazione un sito di iniezione più caudale se intendono mantenere topi per periodo prolungato e anticipando la crescita del tumore di grandi dimensioni.
- Sono ammessi animali anestetizzati per recuperare su un pad riscaldato fino al deambulatorio (tipicamente < 1h) con monitoraggio della frequenza respiratoria, il colore della pelle delle dita dei piedi fino al deambulatorio.
4. bioluminescenza (BLI) di Imaging delle cellule trapiantate per valutare la sopravvivenza delle cellule e la crescita di Teratoma
- Timepoints desiderato dopo l'inoculazione, eseguire un'iniezione intraperitoneale (IP) di 375 mg/kg della sonda del reporter D-luciferina in topi.
- 10 min dopo un'iniezione di IP, immagine la bioluminescenza segnale negli animali anestetizzati (eseguite come descritto nel passo 3.5) per 30 min utilizzando windows acquisizione 1min a intervalli di 5 min.
Nota: Acquisizioni di immagine settimanale sono raccomandati. L'anestesia è effettuata durante la formazione immagine fornendo inalato isoflurano tramite un cono di naso. - Per l'analisi dei dati, disegnare una regione di interesse (ROI) sopra il segnale BLI e, quindi, normalizzare per il tempo di acquisizione quantificare le emissioni in unità di massime fotoni al secondo per centimetro quadrato per steradiante (/sr fotoni/s/cm2).
5. teratoma irradiazione utilizzando un irradiatore preclinici di immagine-guida (Figura 1)
- Anestetizzare un mouse nella finestra di atterramento utilizzando 2% isoflurane in 100% di ossigeno ad un flusso di 1 L/min. Dopo che il mouse è completamente anestetizzato, trasferirlo al letto di un irradiatore pre-clinica guidata da immagini (Vedi Tabella materiali). Mantenere l'anestesia da 2% isoflurane continuamente tramite un cono di naso.
- Acquisire immagini micro-CT come un insieme di 400 immagini di proiezione oltre 360° utilizzando un 40 kVp, fascio di raggi x 2 mA e ricostruire quelle in immagini volumetriche con una dimensione di pixel isotropo di 0,2 mm.
- Pianificare un trattamento di radiazione usando le immagini di micro-CT usando il pacchetto di software di RT_Image (http://rtimage.sourceforge.net/) ed eseguire il trattamento.
Nota: Il piano di trattamento utilizzato è costituito da fasci di raggi x due 225 kVp, orientati a passare attraverso il teratoma superficiale destinazione mentre costeggiando la superficie del resto del mouse e con parsimonia i visceri sottostanti. I tempi di esposizione per le travi vengono regolati in base il trimestrale dei dati di calibrazione di sistema affinché la dose al centro del tumore bersaglio era 6 Gy. - Ripetere il processo di trattamento per tre giorni consecutivi di consegnare un totale di 18 Gy al tumore di destinazione.
- Mantenere standard di post-trattamento cura degli animali.
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Representative Results
Topi iniettati in genere dimostrerà la formazione di teratoma crescita dopo 4 – 8 settimane come confermato da BLI imaging (Figura 2). I tumori si ridurranno drasticamente quando irradiati con una dose cumulativa di 18 Gy dato un mese dopo la consegna delle cellule, provocando una diminuzione significativa nel segnale di luciferasi (Figura 2). D'importanza, tessuti normali prelevati 5 mm dal sito irradiato non sembrano avere alcun danno significativo (Figura 3).
Figura 1: schema del protocollo per il trattamento dei tumori con la radioterapia esterna. (A), l'animale anestetizzato è inserita l'irradiatore e immobilizzata. (B) una scout immagine viene creata per localizzare il teratoma per trattamento mirato. (C) utilizzando il pacchetto di software di RT_Image, i fasci di raggi x sono allineati per impostare come destinazione il tumore selezionato. Prima di irradiamento, è confermata la posizione del collimatore e l'animale. Totale (D) A 6 Gy di radiazione è consegnato al tumore ogni irradiazione evento22. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 2: successo semina delle cellule risultati nei tumori consistenti che possono essere trattati in modo selettivo con radiazione. (A) rappresentante BLI di trattati (a destra) e sono mostrati i teratomas non trattati (a sinistra). Un totale di 1 x 106 sportelli unici umani costitutivamente esprimendo FLuc/eGFP sono stati iniettati per entrambi i fianchi dorsali di un mouse immunodeficiente. Mentre il lato torio continua a crescere, il lato irradiato ha ristretto drammaticamente come mostrato dal declino del segnale di luciferasi. (B) questo grafico linea dimostra il declino del segnale luciferasi in tumori irradiati vs torio PSC-derivati. (C) variazioni della misura pinza in vivo dei teratomas nel corso del tempo. I teratomas irradiati non è aumentato di formato nel corso del tempo, considerando che irradiati teratomas è diminuito nel formato. (D) A lordo istologia del trattati e non trattato (a sinistra) PSC-derivati tumore (a destra) Mostra una marcata riduzione in dimensioni dopo un totale di 18 Gy di irradiazione22. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 3: consegna risultati in danni minimi ai tessuti circostanti, tra cui il fegato, intestino e muscolo mirati. Tessuti circostanti non hanno segni di danni di irradiazione, tra cui la conservazione della proliferazione cellulare e un'assenza di senescenza cellulare e apoptosi. Tessuti sono state campionate 5mm dai siti irradiati presso dopo irradiazione di 14 giorni. (A) ematossilina ed eosina che macchia è illustrata l'architettura normale del tessuto adiacente. Ki67 (B) colorazione (mostrato in aqua) indica che la proliferazione cellulare è conservata nel fegato, intestinale e cellule muscolari. I nuclei sono controcolorati con 4', 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI), mostrato in blu. (C) A analisi di β-galattosidasi senescenza non mostra prova di invecchiamento cellulare (vale a dire, assenza di colorazione verde scura). (D) Terminal deoxynucleotidyl transferase (TdT) dUTP Nick End Labeling (TUNEL) non mostra nessun apoptosi (cioè, assenza di colorazione rossa nei nuclei). I nuclei sono controcolorati con DAPI, indicato in blu22. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
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Discussion
I dati preclinici e casi aneddotici da vittime del "turismo delle cellule staminali" confermano che il rischio di sviluppare i teratomas è un grave inconveniente associato PSC trattamenti23. Sviluppo di approcci attenti per prevenire e trattare il rischio neoplastico associato a terapie con cellule staminali è, pertanto, un passo importante nel facilitare la traduzione clinica delle terapie rigenerative delle cellule staminali. In questo articolo, abbiamo descritto un metodo di targeting terapeutico dei teratomas PSC-collegata mediante radioterapia esterna in un modello murino ed ha mostrato l'atrofia dinamico dei tumori irradiati usando la formazione immagine di BLI.
Abbiamo utilizzato iPSCs umane, creato da un lentivirus riprogrammazione metodo e iniettato in un modello di topi nudi di ricapitolare la formazione di teratomi in vivo. L'uso di topi nudi evita un rifiuto iniziale immunogeno da un'iniezione di cross-specie delle cellule. Mentre l'uso di topi immune-carenti rafforza il potenziale cancerogeno, lo stesso protocollo potrebbe essere applicato in topi immunocompetenti che utilizzano sportelli unici murini. Abbiamo ulteriormente trasdotte sportelli unici utilizzati in questa carta con un gene reporter di doppio-fusion che possibile l'imaging di bioluminescenza seriale delle cellule trasportate in vivo. L'uso di formazione immagine del gene reporter abilitato il monitoraggio seriale del PSC o PSC-derivati in vivo senza dover fare affidamento su autopsia e istologia per monitorare la dimensione o la crescita del tumore24. Precedenti studi hanno confermato la correlazione tra l'intensità del segnale BLI e tumore dimensioni25,26. Gli sportelli unici con un gene reporter double-fusione di etichettatura è un passaggio facoltativo che può essere ignorato a favore di altri metodi di quantificazione degli oneri del tumore, quali l'autopsia.
Per le modifiche del protocollo di radiazione, dosaggi differenti possono essere applicati per i trattamenti di tumore preclinico. Ai fini di questa carta, abbiamo scelto di trattare gli animali rappresentativi con 18 Gy somministrati in tre dosi di 6 Gy dato oltre 3 giorni consecutivi. Il vantaggio di non amministrare tutti i 18 Gy in una sola impostazione è che i dosaggi più bassi di radiazione distanziati apart limitare i danni del tessuto adiacente e morbosità secondaria a radioterapia esterna. Pazienti che ricevono radioterapia esterna nelle regolazioni cliniche spesso ricevono dosaggi bassi equidistanti molti trattamenti diversi per questi stessi motivi27. Altri passaggi del protocollo dovrebbero essere seguite come indicato.
Ablazione del tumore attraverso l'irradiazione è una promettente strategia di trattamento per i teratomas derivati da cellule staminali, che sono spesso trasportati nei chirurgicamente inaccessibili. Questo studio fornisce la prova che la radioterapia esterna costituisce uno strumento efficace per il trattamento dei teratomas PSC-derivato. Questo semplice approccio richiede l'acquisizione di immagini ad alta risoluzione di CT di un soggetto, dopo che una serie di fasci di radiazioni potrebbero essere prescritti per irradiare un bersaglio ad una dose desiderata, evitando di tessuto adiacente20. In questo studio, due fasci tangenziali sono stati utilizzati per trattare un teratoma PSC-derivato sottocutaneo risparmiando il tessuto circostante, come pure il teratoma controlaterale controllo. Trattamento del tumore alla radioterapia esterna è sia efficiente e robusto e clinicamente fattibile, contrariamente ai metodi che si basano su piccole molecole, anticorpi e pre-separatore per impedire la formazione del tumore.
Ci sono notevoli vantaggi di questo approccio. In primo luogo, radiazione esterna del fascio è una modalità clinicamente accettata del trattamento oncologico che è stato utilizzato nel trattamento di molti tipi di tumore, compreso le cellule germinali tumori19. A differenza di altre strategie di trattamento, EBRT non modifica le proprietà funzionali delle cellule staminali prima o durante delle cellule consegna15. Inoltre, radioterapia esterna non interferisce con la modalità o numero di celle consegnato e, quindi, ha un impatto minimo sulla loro potenziale efficacia. Irradiazione mirata riduce anche il danno fuori bersaglio ad altri organi, rispetto alla chemioterapia. Infine, indipendentemente dalla strategia di pretrattamento, EBRT fornisce un'opzione "fail-safe" che può essere invocata in caso di formazione del tumore. Tuttavia, ci sono limitazioni per la futura adozione di radioterapia esterna per il trattamento di cellule staminali-collegato il teratoma. In primo luogo, il processo richiede formazione immagine ripetuta e consegna della terapia, che, da un punto di vista clinico, può essere ingombrante. Inoltre, a seconda della posizione della consegna della cellula formativa, questo approccio può risultare elevato rischio se radiosensibile tessuto è nella via del fascio. Infine, se le cellule staminali diffondere sistematicamente di là dei siti di iniezione e i teratomas forma negli organi multipli, può diventare difficile applicare questa strategia senza morbosità significativa di pazienti.
In conclusione, forniamo un modello di creazione teratomi PSC-derivato in un modello murino e dimostrare un metodo affidabile di irradiazione di micro-CT che consente la riduzione mirata del carico del tumore. Questi metodi possono essere utilizzati per confrontare l'efficacia terapeutica della radioterapia esterna con altre strategie di trattamento di teratoma o per valutare il valore di EBRT nello sradicamento altri tipi di tumori.
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Disclosures
Gli autori non hanno nulla a rivelare.
Acknowledgments
Gli autori vorrei ringraziare la nazionale istituti di salute R01 HL134830 (PKN), K08 HL135343 (KS) e 5F32HL134221 (JWR); Howard Hughes Medical Institute (ASL); e l'Istituto cardiovascolare di Stanford (ASL) per il loro sostegno.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Induced Pluripotent Stem Cell Control Line | Stanford University | Nguyen Lab | Cell culture of iPSC |
| Corning matrigel basement membrane matrix 354234 | Fisher Scientific | CB-40234 | Cell culture of iPSC |
| Essential 8 culture medium | ATCC-The global bioresource center | 30-2203 | Cell culture of iPSC |
| Tryple E | Gibco | 12605-036 | Cell culture of iPSC |
| Y27632 inhibitor 2 HCL (ROCK Inhibitor) | Fisher Scientific | S104950MG | Cell culture of iPSC |
| Lentivirus | Cyagen | P170721-1001cjn | Transduction of iPSC with double fusion reporter gene |
| Polyrbrene Infection/Transfection Reagent | Millipore Sigma | TR-1003-G | Transduction of iPSC with double fusion reporter gene |
| Fluc-eGFP reporter gene driven by ubiquitin promoter | Stanford University | Sam Gambhir lab | Transduction of iPSC with double fusion reporter gene |
| D-luciferin | Perkin Elmer | 122799 | Transduction of iPSC with double fusion reporter gene and BLI |
| Flow cytometer (BD FACSARIA III) | BD Biosciences | FACSAria | Transduction of iPSC with double fusion reporter gene |
| microplate spectrofluorometer (Glomax Navigator System) | Promega Bio Systems, Sunnyvale, CA | GM2000 | Transduction of iPSC with double fusion reporter gene |
| Xenogen IVIS 200 | Perkin Elmer | 124262 | BLI |
| Isoflurane | Sigma-Aldrich | CDS019936 | irradiation |
| X-Rad SmART image-guided irradiator | Precision X-ray Inc., North Branford, CT | X-Rad SmART | irradiation |
| RT_Image software package | Stanford University (http://rtimage.sourceforge.net/) | RT_Image v0.2β | Irradiation |
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