Summary
在这里, 我们提出了一种在体内测定由 GM-脑脊液骨髓 (BM) 衍生树突状细胞 (CD4) 诱导的天真的 t 细胞 (t 细胞) 活化、增殖和 Th1 分化的方法。此外, 该协议还描述了 BM 和 t 细胞分离、dc 生成和 dc 和 t 细胞的移植。
Abstract
量化的天真 CD4 t 细胞活化, 增殖, 并分化为 t 帮助 1 (Th1) 细胞是一个有用的方法来评估 t 细胞在免疫应答中发挥的作用。本协议描述骨髓 (BM) 祖细胞的体外分化, 以获得粒细胞巨噬细胞集落刺激因子 (GM-脑脊液) 衍生树突状干细胞 (DCs)。该协议还介绍了蛋白蛋白肽 (OVAp) 负载的 GM-脑脊液衍生 DCs 和天真的 CD4 T 细胞 OTII 转基因小鼠的移植, 以分析体内活化、增殖和 Th1 分化的转移 CD4 T 细胞。这个协议绕过了纯粹的体内方法的限制, 因为无法专门操作或选择所研究的细胞群体。此外, 本议定书允许在体内环境中进行研究, 从而避免对可能发生在体外的功能性因素的改变, 包括细胞类型和其他仅在完整器官中发现的因素的影响。该协议是一个有用的工具, 以产生变化的 DCs 和 T 细胞, 修改适应性免疫反应, 有可能提供重要的结果, 以了解许多免疫相关疾病的起源或发展。
Introduction
CD4 T 细胞和抗原呈现细胞 (apc), 如 DCs 是需要的调解人免疫的微生物病原体1,2。在外周淋巴器官中, CD4 T 细胞在 apc3、4、5所提出的特异抗原识别后激活。活化 CD4 T 细胞增殖和分化为独特的特定效应细胞, 是必要的发展一个正确的适应性免疫应答6,7。控制这些过程是至关重要的, 以产生适当的适应性防御, 杀死病原体而不产生有害的组织损伤8。Th 细胞是根据表面分子、转录因子和效应细胞因子的表达或产生而定义的, 对病原体的反应执行必要和精确的功能1。细胞 Th1 细胞子集表达转录因子 T 打赌和细胞因子干扰素γ (IFNγ) 和参与宿主防御细胞内病原体1。量化 CD4 t 细胞的活化、增殖和 Th1 分化是评估 t 细胞在免疫应答中发挥作用的有用手段。
该协议能够在体内分析体外生成的 BM 衍生 DCs 的能力, 以调节天真 CD4 T 细胞的活化、增殖和 Th1 分化。该议定书还有助于评估幼稚 CD4 T 细胞被激活、诱导增殖和 Th1 分化的能力 (图 1)。这个多才多艺的协议绕过无法具体地操作或选择被研究的细胞人口在纯粹体内协议。利用基因修饰小鼠5的 BM, 或通过治疗或基因操作分离的 bm 细胞9, 可以研究不同分子和处理对 DCs 的影响。同样, t 细胞反应可以探索通过获得 t 细胞为领养转移从不同的来源或在几操作以后3,8,10。
该协议的主要优点有两个方面。用流式细胞仪分析 T 细胞活化、增殖和 Th1 分化;这与体内研究相结合, 从而避免了在体外可能发生的改变, 包括细胞类型和其他仅在完好器官中发现的因素11。
使用重要染料是一种广泛使用的技术来跟踪细胞增殖, 同时避免使用放射性。用这些试剂进行增殖的测量是基于细胞分裂后的染料稀释。此外, 这些染料可以在多波长检测, 并易于分析的流式细胞术与多种荧光抗体或标记。通过流式细胞术分析 T 细胞的活化、增殖和 Th1 分化, 我们强调了该协议的实用性。
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Protocol
根据西班牙和欧洲准则, 基金会 Investigaciones Cardiovasculares 卡洛斯 III (CNIC) 和 Comunidad 国立马德里批准了实验程序。小鼠在特定病原体游离 (SPF) 条件下繁殖, 并通过二氧化碳 (CO2) 吸入进行安乐死。
1. 从胫骨和股骨中分离小鼠骨髓细胞
注: C57BL/6 同类系小鼠菌株携带的差异白细胞标记Ptprca, 一般认为 CD45.1 或 Ly5.1, 而野生型 C57BL 菌株携带Ptprcb 等位基因, 称为 CD45.2 或 Ly5.2。CD45.1 和 CD45.2 变异可以用抗体的流式细胞术来区分。CD45.1、CD45.2 和 CD45.1/CD45.2 小鼠可作为细胞来源或接受移植, 允许通过流式细胞仪追踪不同细胞群。优先使用年龄和性别匹配的雄性或雌性小鼠低于12周的年龄。
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股骨和胫骨的制备
- 弄死老鼠使用由机构动物保育委员会批准的议定书。
- 用70% 乙醇喷洒动物表面, 对后肢进行消毒。
- 使用无菌剪刀, 镊子和手术刀。用手术刀, 做一个切口在皮肤和去除皮肤从老鼠的远端部分包括皮肤覆盖后四肢。剥下小腿肌肉周围的皮肤, 完全去除腿部的皮肤 (图 2A, 2B)。
- 用手术刀将股四头肌从股骨中分离出来。Disarticulate 髋关节不折断股骨头。用手术刀从胫骨上取出肌肉 (图 2C, 2D)。将股骨与胫骨分开, 不折断骨末端。
- 保持骨骼在一个培养皿中含有10% 胎牛血清 (血清) 和1% 青霉素/链霉素在冰冷的1x 罗斯威尔公园纪念研究所 (RPMI) 1640 中等。
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单元格隔离
注: 所有后续步骤必须在一个文化罩和无菌材料, 以避免污染。- 在无菌培养皿中, 用手术刀小心翼翼地切断每根骨头的近端和远端。
- 反复冲洗的骨骼与总容积10毫升的温暖完整的 RPMI 培养基 (RPMI + 10% 血清, 2 毫米 EDTA, 1% 青霉素/链霉素, 20 毫米 HEPES, 55 µM 2-巯基乙醇, 1 毫米丙酮酸钠, 2 毫米 l-谷氨酰胺)。用25克针附着在1毫升注射器上, 从两端冲洗骨头。
- 将 effluate 转移到装有70µm 尼龙网过滤器的50毫升锥形管上。通过温和搅拌和吹打, 小心地去除碎片和细胞企业集团。
- 在室温下, 将细胞悬浮在 250 x g处进行10分钟的离心。
- 并用重悬细胞颗粒在1毫升的冷红细胞裂解缓冲 (0.15 米 NH4Cl + 1 毫米 KHCO3 + 0.1 毫米 EDTA, 调整 pH 值7.2 与 1 N HCl, 0.4 µm 无菌过滤, 并储存在4°c)。用人工震动在冰上维持5分钟。
- 添加10毫升的冷缓冲 (1x 磷酸缓冲盐水 (PBS) + 2 毫米 EDTA + 2% 牛血清白蛋白), 以灭活和冲洗红细胞裂解缓冲液。
- 离心机细胞悬浮在 250 x g 5 分钟在4°c。
- 洗涤细胞与25毫升完全 RPMI 培养基和离心机在 250 x g 5 分钟在4°c。
- 并用重悬5毫升完全 RPMI 培养基中的细胞。混合50µL 的细胞悬浮1:1 与台盼蓝。在显微镜下确定计数室中的细胞数。使用公式计算单元格数: 细胞/mL = [(非染色细胞 count/4) x 2 x 1万]12。
注: 此方法产生 40 x 106到 60 x 106骨髓细胞每未感染8到12周老 C57BL/6 老鼠。 - 离心机细胞悬浮在 250 x g 5 分钟在4°c。
2. DC 分化、成熟和抗原加载
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BM 细胞采集
- 在6井超低附着面板上播种完整的培养基, 每毫升中等 106细胞, 通常在5毫升每井。分化的巨噬细胞将附着在培养板上。12小时后, 转移上清, 其中主要含有单核细胞, 以清洁6井板, 丢弃旧6井板与粘附巨噬细胞。
- 为了促进细胞分化, 培养非黏附细胞在 5 x 105细胞每毫升在典型地5毫升每 RPMI 媒介包含 20 ng/毫升商业上获得的重组小鼠 GM 脑脊液在37°c 和5% 二氧化碳 (CO2) 和每日观察。
- 每3天, 旋转下来悬浮细胞和收集的黏附细胞与5毫米 EDTA 在 PBS 和旋转下来。结合和并用重悬在 5 x 105细胞/毫升的新鲜培养基含有 20 ng/毫升 rm-脑脊液。
- 在8天, 在非组织培养处理的无菌培养皿中, 以 5 x 105细胞/毫升为单位, 在含有 20 ng/毫升的并用重悬和 20 ng/毫升脂多糖 (LPS) 的培养基上采集附着体和分离细胞, 以诱导高 MHC II。, CD80 和 CD86 表达。
- 用流式细胞术检查 DC 分化, 如步骤2.2 所示。
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流式细胞术的分化和成熟分析。
- 离心机细胞悬浮在 250 x g 5 分钟在4°c。重复此步骤两次。
- 阻断 fc 受体通过孵化悬浮细胞颗粒在小鼠 Fc 受体阻滞剂 (纯化的抗小鼠 CD16/CD32 IgG2b抗体) 15 分钟, 4 摄氏度根据制造商的指示。
- 离心机细胞悬浮在 250 x g 5 分钟在4°c。
- 对于每个探针, 并用重悬25万细胞在300µL 流式细胞仪缓冲 (1x PBS + 2 毫米 EDTA + 2% BSA) 在4°c。
- 将30µL 的细胞溶液转移到96井板上。
- 离心机细胞悬浮在 250 x g 5 分钟在4°c。
- 在制造商的指示之后, 丢弃上清, 并在每个井中添加30µL 的含抗体缓冲液。用抗体在4摄氏度孵育细胞20分钟。
注: 通常用于 DCs、单核细胞和巨噬细胞的标记为 CD11b、CD64、CD115、CD11c、MHCII、CD80 和 CD86 (图 3)。 - 离心样品在 250 x g 5 分钟在4°c 和并用重悬在200µL 每井的冷流式细胞术缓冲器包含标记排除死的细胞 (例如,碘碘化物, 4′-, 6-diamidino-2-苯基吲哚 (DAPI) 或胺反应染料) 在制造商推荐的浓度13。
- 通过将样本转移到流式细胞术管并进行流式细胞术分析, 在0、3、6和9天排除死细胞, 从而监测细胞分化。
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直流抗原加载。
- 在8天, 离心机样品在 250 x g为5分钟在4°c 和并用重悬药丸在200µL 媒介 (RPMI + 10% 没有抗生素的血清)。重复此步骤两次。
- 用10µg/毫升 OVAp (323-339) 孵化 DCs;ISQAVHAAHAEINEAGR) 每 1 x 107 DCs 在1毫升中等 (RMPI + 1%) 在塑料管为至少30分钟在37°c。使用非 OVAp 加载 DCs 作为负控制条件。
- 离心样品在 250 x g 5 分钟在4°c 和并用重悬小球在200µL 完全 RPMI 媒介。重复此步骤两次。
- 离心样品在 250 x g 5 分钟在4°c 和并用重悬小球在200µL 媒介 (RPMI + 10%) 在 2 x 106细胞/毫升。
3. OTII 小鼠天真 CD4 T 细胞的分离
注: 此方法产生约 100 x 106 spleenocytes 每未感染8至12周老 C57BL/6 老鼠。男性和女性都可以使用。CD4 T 细胞可与脾或淋巴结分离;CD4 T 细胞分别占到这些器官中大约25% 和50% 的细胞。在无菌条件下执行以下步骤。
- 从 OTII 转基因小鼠中分离腹股沟、腋、臂、颈、肠系膜淋巴结和脾脏 (图 4), 并将其转移到含有10毫升完整 RPMI 培养基的塑料培养皿中。
- 用2毫升完整的 RPMI 培养基冲洗细胞过滤器, 从50毫升管中取出。将淋巴结和脾脏转移到70µm 细胞过滤器放置在50毫升管。融汇使用注射器柱塞 (图 5), 并添加中等至15毫升。
- 离心样品在 250 x g 5 分钟在4°c 和并用重悬颗粒在15毫升完全 RPMI 媒介。重复此步骤两次。
- 对于脾细胞悬浮, 并用重悬细胞颗粒, 并溶解在步骤1.2.5 中所示的红细胞。
- 离心机细胞悬浮在 250 x g 5 分钟在4°c。
- 用25毫升的完全 RPMI 培养基和离心机在 250 x g处冲洗细胞, 在 RT 上为5分钟。
- 并用重悬5毫升培养基中的细胞。混合50µL 的细胞悬浮1:1 与台盼蓝。用显微镜下的计数室确定细胞数。使用公式计算单元格数: 细胞/mL = [(非染色细胞 count/4) x 2 x 1万]12。
- 重复步骤2.2.2。
- 按照制造商的指示, 孵化细胞与1:800 稀释生物素化抗体 CD8α, IgM, B220, CD19, MHCII (I Ab), CD11b, CD11c, CD44, CD25 和 DX5 30 分钟的冰, 以后来阴性选择 CD4 T 细胞。
- 按照制造商的指示, 根据电池的数量和珠子的容量, 计算所需的链亲和素涂层磁性微球的数量和隔离 CD4 T 细胞使用磁性细胞分离器和适当的分离列。
- 并用重悬5毫升完整的 RPMI 培养基中的细胞, 并保持它们在冰上, 而计数活细胞如步骤3.7 所述。
- 提取 2 x 105细胞, 并检查收集细胞的纯度使用抗 CD4, CD3, B220 和 CD8 荧光抗体在流式细胞仪使用制造商推荐抗体稀释。
- 为了染色孤立的天真 CD4/OTII T 细胞, 并用重悬 106细胞500µL 缓冲 (1x PBS + 2 毫米 EDTA + 2% BSA)。准备500µL 缓冲器 (1x PBS + 2 毫米 EDTA + 2% BSA), 其中包含双最终制造商推荐浓度的关键细胞示踪染料。通过缓慢地将细胞示踪液添加到细胞悬浮液中, 混合这两种溶液。在37摄氏度孵化细胞5分钟。
- 用5毫升的完全 RPMI 培养基和离心机在 250 x g 处清洗细胞, 在4摄氏度时为5分钟。重复此步骤两次。并用重悬在 1 x 107细胞/毫升的1毫升完全 RPMI 培养基中的细胞。
4.体内活化、增殖和 Th1 分化试验
注: 生命细胞示踪染料羧基双乙酸琥珀酰亚胺酯 (CFSE) 和其他琥珀酰胺酯基染料, 它们在不同波长激发和发出荧光, 被广泛用于评估流动的淋巴细胞增殖。细胞仪由于其荧光强度高, 寿命长, 变异性低, 毒性低14。
- 过继转输转移静脉 (静脉注射) 1 x 106活细胞示踪染料染色的天真 CD4/OTII T 细胞100µL 的 PBS 每只老鼠。标记的 T 细胞可以过继转输转移的尾静脉或复古轨道注射15;在这两种情况下, 细胞会回到淋巴器官 (图 6A)。
- 一天后, 通过过继转输转移 10万 LPS 成熟的 OVAp 加载 DCs (s.i.) 在脚垫 (图 6B), 对接受者老鼠提出挑战。
- 从接受者小鼠那里收获腘淋巴结, 并处理它们, 直到获得单细胞悬浮后, 与先前在3.1 和3.2 中描述的步骤相同。这样做2天后免疫后, 以测量 CD4/OTII T 细胞活化, 并在5天测量增殖加上 Th1 分化。
- 为了分析2天的 T 细胞活化, 用荧光抗体对 CD4、CD69 和 CD25 (可选 CD45.1 和 CD45.2) 染色细胞, 并确定 C69 人口中CD25 + CD4+ T 细胞的百分比。用流式细胞仪分析 (图 7)。
- 为了检查5天的 T 细胞增殖, 染色细胞使用适当的荧光抗体对 CD4 和可选的 CD45.1 和 CD45.2。用流式细胞仪分析 CD4 种群中生命细胞示踪染料信号的衰减情况 (图 8)。在这些研究中可以确定几个参数, 例如, 细胞分裂的数量由标记与关键细胞示踪染料, 每个荧光峰中分裂细胞的百分比和总细胞的分裂细胞百分比人口。
- 为了确定5天的 Th1 分化, 40万个96井板中的200µL 的 RPMI 培养基中有1个µM ionomycin 和 10 ng/毫升佛波12酯13醋酸酯 (PMA), 在孵化箱6摄氏度的37小时。在过去的4小时, 添加3–10µg/毫升 brefeldin A 阻断细胞因子分泌的培养基。
- 离心板5分钟在 250 x g在4°c。通过快速反演96井板, 丢弃上清液。
- 重复步骤2.2.2。
- 在30µL (1x PBS + 2 毫米 EDTA + 2% BSA) 中孵化15分钟, 在4摄氏度处染色细胞膜, 其中含有 CD4 的抗体, 并可选择在制造商推荐的稀释上 CD45.1 和 CD45.2。通过添加150µL 缓冲细胞 (1x PBS + 2 毫米 EDTA + 2% BSA) 和离心板为5分钟在 250 x g在4°c 和放弃上清。
- 通过在 RT 中添加100µL 2% paraformaldehyde/1%sucrose 20 分钟来修复细胞. 离心机板材为5分钟在 1000 x g和4°c。放弃上清。
- Permeabilize 细胞增加50µL 胞内通透缓冲 (1x PBS + 0.1% BSA, 0.01 米 HEPES, 0.3% 皂苷) 和孵育30分钟在4摄氏度。
- 增加150µL 的 PBS 和离心机5分钟在 1000 x g在 RT. 丢弃上清。
- 在缓冲 (PBS + 0.1% 皂苷) 中加入30µL 的荧光共轭抗 IFNγ抗体, 在 RT 中孵化30分钟, 从而染色细胞内细胞因子。
- 通过添加150µL 的缓冲 (PBS + 0.1% 皂苷) 来洗涤细胞。将板材离心5分钟, 1000 x g在 RT 上, 然后丢弃上清。重复此步骤两次。
- 用流式细胞仪分析细胞数量 (图 8)。
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Representative Results
图 1说明了本协议中描述的步骤。图 2展示了小鼠 BM 细胞的分离和培养。在这些培养中加入了 GM-csf 和 LPS, 可使 dcs 的体外生成和成熟.图 3说明了流式细胞术对所获得 dcs 的分化和成熟的分析. OVAp 负载的 GM-脑脊液 BM 基 dcs分离的重要细胞微量染料染色 CD4/OTII T 细胞过继转输转移到小鼠身上。图 4显示了用于隔离 CD4/OTII T 细胞的淋巴结的位置。图 5显示了一个50毫升管装有70µm 尼龙过滤器和注射器柱塞用于融汇淋巴结和脾脏。图 6显示静脉注射的 CD4/OTII T 细胞进入复古眶丛和 OVAp 注射的都安的 GM-脑脊液 BM。CD4/OTII T 细胞分布到不同的淋巴器官, 而 gm-脑脊液 dcs 迁移到腘淋巴结, 其中 gm-csf dcs 激活幼稚的 CD4/OTII T 细胞的介绍 OVAp。天真的 CD4/OTII T 细胞然后增殖和分化为 Th1 表型。图 7说明了从膜 CD69 和 CD25 表达的分析中对天真 CD4/OTII T 细胞活化的量化。图 8显示了 CD4/OTII T 细胞增殖的量化。图 9说明了 CD4/OTII T 细胞分化为 Th1 表型的量化。
图 1: 协议方案.1) 从小鼠股骨和胫骨中分离 BM 细胞。2) 培养的 BM 细胞与 gm-脑脊液生成 gm-脑脊液 bm-dcs. 3) 检查 DC 分化和成熟的 gm-csf-dcs 与 LPS。4) 检查直流成熟度。5) 用 OVAp 加载 DCs。6) 分离 CD4/OTII T 细胞形成小鼠脾。7) 用生命细胞示踪染料染色 CD4/OTII T 细胞。8) 检查隔离 CD4/OTII T 细胞的分离纯度和生命细胞示踪染料染色。9) 过继转输转移隔离 CD4/OTII T 细胞静脉注射给受体小鼠。10). 过继转输转移 OVAp 加载和成熟的 DCs 到受体小鼠。11) 检查 CD4/OTII T 细胞激活。12) 检查 CD4/OTII T 细胞的增殖和分化。请单击此处查看此图的较大版本.
图 2: 从小鼠股骨和胫骨的骨髓隔离过程.(A) 带剪刀的皮肤切口。(B) 清除肢体皮肤。(C) 带剪刀的肌肉切开术。(D) 用手术刀从肢体中取出肌肉。请单击此处查看此图的较大版本.
图 3: 流式细胞仪分析了 GM-脑脊液 BM 衍生 DCs 的成熟度.MHCII、CD80 和 CD86 在 lps 活化 (+ lps) 和非活化 (lps) 基因组中的表面表达. 数字显示任意单位 (天文单位) 的平均荧光强度。请单击此处查看此图的较大版本.
图 4: 小鼠腹股沟、腋、臂、颈、肠系膜淋巴结及脾的位置.请单击此处查看此图的较大版本.
图 5: 实验性设置为淋巴结和脾均质化.请单击此处查看此图的较大版本.
图 6: CD4/OTII T 细胞的领养转移和 OVAp 负载的 GM-脑脊液-DCs. (A) 静脉注射 CD4/OTII T 细胞进入复古眶丛。(B) 皮下注射 OVAp 负载的 GM-脑脊液 BM 都安。请单击此处查看此图的较大版本.
图 7:体内T 细胞活化的量化.流式细胞仪图和图形显示 CD69 在 CD4 T 细胞中的膜表达的分析和定量。CD45.1/CD45.2 小鼠被过继转输转移静脉注射与小鼠 CD45.1/CD4/OTII 和 CD45.1/CD4/OTII 细胞24小时之前, 在南卡罗来纳州收养转移 OVAp 负载的 GM-脑脊液 BM-DCs. 用流式细胞术检测2天后直流转导 T 细胞活化染色后, 荧光标记抗体的指示抗原。请单击此处查看此图的较大版本.
图 8:体内T 细胞增殖的量化.流式细胞仪图和图形显示了增殖 CD4 T 细胞中下降的关键细胞示踪染料染色的分析和量化。CD45.2 小鼠过继转输转移静脉注射与小鼠 CD45.1/CD4/OTII 细胞24小时之前, 在 OVAp 被装载的 GM-脑脊液 BM-DCs 的移植. 用流式细胞术检测5天后直流转移后的 T 细胞增殖显示荧光抗体。T 细胞增殖可以通过测量增殖细胞的百分比、每个除法峰中细胞的百分比, 或者通过计算图中所示的除法峰数来确定。请单击此处查看此图的较大版本.
图 9:在体内对 T 细胞分化为 Th1 表型的量化.流式细胞仪图和图形显示 IFNγ表达 CD4 T 细胞百分比的分析和量化。CD45.2 小鼠过继转输转移静脉注射与小鼠 CD45.1/CD4/OTII 细胞24小时之前, 在 OVAp 被装载的 GM-脑脊液 BM-DCs 的移植. 用流式细胞仪染色后, 在几天后直流转移的 T 细胞分化显示荧光抗体。t 细胞分化为 Th1 表型被确定为 IFNγ表达细胞占总 CD4 t 细胞和仅从增殖 CD4 t 细胞的百分比。请单击此处查看此图的较大版本.
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Discussion
该协议允许对 BM 衍生 DCs 的能力进行表征, 以调节天真 CD4 T 细胞的活化、增殖和分化。此外, 它还可以用来评估 CD4 T 细胞的易感性, 由 BM 衍生 DCs。通过该协议, 可以在体内测量这些事件的变化。
根据调查的假设, 可以使用 T 细胞和 DCs 的几种组合。例如, 你可以分析敲或敲出特定基因的后果, 或者 CD4 T 细胞活化、增殖或 Th1 分化的特定刺激的效率。这些过程可以在 DCs 或 CD4 T 单元格或两个单元格类型上执行。因此, 野生型或基因修饰小鼠的 CD4 T 细胞可以与野生型小鼠的 DCs 相结合, 反之亦然。
该协议适用于使用流式细胞仪和抗体对抗 CD45.1 和 CD45.2, 以区分不同细胞群的来源。事实上, CD45.1/CD45.1 和 CD45.2/CD45.2 小鼠可以被用作任何一种细胞类型的来源, 或作为任何组合收养的接受者。例如, CD4 T 细胞可以从 CD45.1/CD45.1/OTII 小鼠获得, 而 CD45.2/CD45.2 小鼠可以是 BM 的起源为 DC 世代。在这个实验中, 两种细胞类型都可以过继转输转移到 CD45.1/CD45.2 小鼠身上。此外, CD4/OTII T 细胞从 CD45.1/CD45.1 型小鼠和 CD45.2/CD45.2 型两个小鼠可以结合在相同或不同的 CD45.1/CD45.2 三型接受者比较的行为和第二类 CD4 T 细胞群体的竞争和非竞争条件, 分别。
该方法描述了 GM-CSF BM 源 DCs 的生成。但是, 可用于 DC 的成熟和分化的替代协议;例如, 木瓜蛋白酶可以代替 LPS 或 fms 相关的酪氨酸激酶3配体 (Flt3-L) 而不是 GM-脑脊液, 允许研究表型不同的 DCs 能够激活 CD4 T 细胞自适应免疫能力。同样的目的, DCs 的抗原加载和表达可以直接与小鼠分离。这项协议与其他9的结合, 允许操纵天真的 CD4/OTII T 细胞的病毒感染16之前, 他们的收养转移到接受鼠。BM 也可以与逆转录9转基因, 研究控制细胞修改对 DCs 的影响, 然后再使用该协议。
此外, 该协议可适用于活体显微学研究17使用荧光蛋白表达细胞。例如, CD4/OTII 小鼠可以与 gfp 或樱桃表达小鼠交叉, 以获得 gfp 或樱桃/OTII CD4 小鼠。这些小鼠可以被用作 CD4 T 细胞的来源, 并且可以根据需要在活体实验中与来自樱桃或 GFP 表达小鼠的 BM 源 dc 结合使用。
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Disclosures
作者没有什么可透露的
Acknowledgments
我们感谢西蒙博士的英语编辑。这项研究得到了干杯研究所 (ISCIII) 的赠款的支持 (PI14/00526;PI17/01395;CP11/00145;CPII16/00022), 米格尔 Servet 计划和基金会拉蒙 Areces;Fondo Europeo de 收复与发展区域 (菲德) 共同出资。CNIC 得到经济、工业和竞争力部 (经济) 和 CNIC 基金会的支持, 是 Severo 奥乔亚卓越中心 (SEV-2015-0505)。RTF 是由基金会拉蒙 Areces 和 CNIC, VZG 由 ISCIII, BHF 由 Investigación 疗养院医院 12 de Octubre (imas12) 和 JMG G ISCIII 的 Servet 计划和 imas12。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Ethanol | VWR Chemicals | 20,824,365 | 5 L |
| Scissors | Fine Science Tools (F.S.T.) | 14001-12 | |
| Forceps | Fine Science Tools (F.S.T.) | 11000-13 | |
| Fine Forceps | Fine Science Tools (F.S.T.) | 11253-20 | |
| Scalpel | Fine Science Tools (F.S.T.) | 10020-00 | Box of 100 blades |
| Fetal Bovine Serum | SIGMA | F7524 | |
| Penicillin/streptomycin | LONZA | DE17-602E | |
| Roswell Park Memorial Institute medium (RPMI) | GIBCO | 21875-034 | |
| Sterile Petri dishes | Falcon | 353003 | |
| 25-gauge needle | BD Microlance 3 | 300600 | |
| 1 ml syringe | Novico | N15663 | |
| 15 ml conical tubes | Falcon | 352096 | |
| 50 ml conical tubes | Falcon | 352098 | |
| 70 μm nylon web filter | BD Falcon | 352350 | |
| Red blood lysis buffer | SIGMA | R7757 | 100 Ml |
| EDTA | SIGMA | ED2SS-250 | |
| Bovine Serum Albumin | SIGMA | A7906 | 100 g |
| Trypan blue | SIGMA | 302643-25G | |
| Culture-plates | Falcon | 353003 | |
| 4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid (HEPES) | Cambrex | BE17-737E | |
| Beta-mercaptoethanol | Merck | 8-05740-0250 | |
| Sodium pyruvate | LONZA | BE13-115E | |
| L-glutamine | LONZA | BE17-605E | |
| Recombinant murine Granulocyte Macrophage colony-stimulating factor (GM-CSF) | Prepotech | 315-03 | |
| lipopolysaccharide (LPS) | SIGMA-ALDRICH | L2018 | |
| 96-well-plate | Costar | 3799 | |
| v450 anti-mouse CD11b antibody | BD Biosciences | 560455 | |
| PE anti-mouse CD64 antibody | BioLegend | 139303 | |
| PE anti-mouse CD115 antibody | BioLegend | 135505 | |
| FITC anti-mouse CD11c antibody | BioLegend | 117305 | |
| FITC anti-mouse MHCII antibody | BioLegend | 125507 | |
| APC anti-mouse CD86 antibody | BioLegend | 105011 | |
| APC anti-mouse CD80 antibody | BioLegend | 104713 | |
| Flow Cytometry tubes | Zelian | 300800-1 | PS 12X75 5mL |
| OTII Ovoalbumine peptide | InvivoGen | 323-339 | |
| anti-mouse biotinylated CD8α antibody | Tonbo Biosciences | 30-0081-U500 | |
| anti-mouse biotinylated IgM antibody | BioLegend | 406503 | |
| anti-mouse biotinylated B220 antibody | Tonbo Biosciences | 30-0452-U500 | |
| anti-mouse biotinylated CD19 antibody | Tonbo Biosciences | 30-0193-U500 | |
| anti-mouse biotinylated MHCII (I-Ab) antibody | BioLegend | 115302 | |
| anti-mouse biotinylated CD11b antibody | Tonbo Biosciences | 30-0112-U500 | |
| anti-mouse biotinylated CD11c antibody | BioLegend | 117303 | |
| anti-mouse biotinylated CD44 antibody | BioLegend | 103003 | |
| anti-mouse biotinylated CD25 antibody | Tonbo Biosciences | 30-0251-U100 | |
| anti-mouse biotinylated DX5 antibody | BioLegend | 108903 | |
| streptavidin-coated magnetic microbeads | MACS Miltenyi Biotec | 130-048-101 | |
| Magnetic cell separator | MACS Miltenyi Biotec | 130-090-976 | QuadroMACS Separator |
| Separation columns | MACS Miltenyi Biotec | 130-042-401 | |
| PE anti-mouse CD4 antibody | BioLegend | 100408 | |
| APC anti-mouse CD3 antibody | BioLegend | 100235 | |
| FITC anti-mouse CD8 antibody | Tonbo Biosciences | 35-0081-U025 | |
| Cell Violet Tracer | Thermofisher | C34557 | |
| APC anti-mouse CD25 antibody | Tonbo Biosciences | 20-0251-U100 | |
| Alexa647 anti-mouse CD69 antibody | BioLegend | 104518 | |
| PerCPCY5.5 anti-mouse CD45.1 antibody | Tonbo Biosciences | 65-0453 | |
| APC anti-mouse CD45.1 antibody | Tonbo Biosciences | 20-0453 | |
| PECY7 anti-mouse CD45.1 antibody | Tonbo Biosciences | 60-0453 | |
| FITC anti-mouse CD45.2 antibody | Tonbo Biosciences | 35-0454 | |
| Ionomycin | SIGMA-ALDRICH | I0634 | |
| Phorbol 12 Myristate 13 Acetate (PMA) | SIGMA | P8139 | |
| Brefeldin A (BD GolgiPlug) | BD | 555029 | |
| Paraformaldehyde | Millipore | 8-18715-02100 | |
| Intracellular permeabilization buffer | eBioscience | 00-8333 | |
| APC anti-mouse IFNg antibody | Tonbo Biosciences | 20-7311-U100 | |
| Fc-block (anti-mouse CD16/CD32) | Tonbo Biosciences | 70-0161-U100 | |
| B6.SJL CD45.1 mice | The Jackson Laboratory | 002014 | |
| BD LSRFortessa™ Cell Analyzer | BD Biosciences | 649225 | |
| DAPI Solution | Thermofisher | 62248 |
References
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