Summary
Hier präsentieren wir ein Protokoll zur in Vivo Bestimmung der naiven CD4-T Zellaktivierung (T Cell), Proliferation und Th1 Differenzierung induziert durch GM-CSF Knochenmark (BM)-abgeleitete Dendritische Zellen (DCs). Darüber hinaus beschreibt dieses Protokolls BM und T-Zellen isoliert, DC-Generation und DC und T-Zell-Adoptiv-Transfer.
Abstract
Quantifizierung der naiven CD4-T-Zell-Aktivierung, Proliferation und Differenzierung zu T-Helfer 1 (Th1) Zellen ist eine nützliche Methode, um die Rolle der T-Zellen in einer Immunantwort zu beurteilen. Dieses Protokoll beschreibt die in Vitro Differenzierung von Knochenmark (BM) Stammväter Granulozyten Makrophagen Kolonie-stimulierende Faktor (GM-CSF) abgeleitet-Dendritische Zellen (DCs) zu erhalten. Das Protokoll beschreibt auch die Adoptiveltern Übertragung von Ovalbumin Peptid (OVAp)-GM-CSF-derived DCs und naive CD4-T-Zellen aus transgenen Mäusen OTII geladen, um die in-Vivo -Aktivierung, Verbreitung und Th1 Differenzierung zu analysieren die übertragenen CD4-T-Zellen. Dieses Protokoll umgeht die Begrenzung der rein in Vivo Methoden durch die Unfähigkeit, speziell zu manipulieren oder wählen die untersuchten Zellpopulation. Darüber hinaus ermöglicht dieses Protokolls Studien in einer in-Vivo -Umgebung, wodurch Veränderungen funktionale Faktoren, die in Vitro auftreten können sowie den Einfluss von Zelltypen und andere Faktoren, die nur in intakten Organe gefunden. Das Protokoll ist ein nützliches Werkzeug zur Erzeugung von Änderungen in DCs und T-Zellen, die adaptive Immunantworten, Bereitstellung von potenziell wichtige Ergebnisse zu verstehen, den Ursprung oder die Entwicklung von zahlreichen damit verbundenen Immunerkrankungen zu ändern.
Introduction
CD4-T-Zellen und antigenpräsentierende Zellen (APCs) wie DCs sind erforderliche Mediatoren der Immunität gegen mikrobiellen Krankheitserregern1,2. In den peripheren lymphatischen Organen werden CD4-T-Zellen bei der Anerkennung der spezifischen Antigene präsentiert von APCs3,4,5aktiviert. Aktivierte CD4-T-Zellen vermehren sich und differenzieren in verschiedene spezifische Th Effektorzellen, die notwendig sind für die Entwicklung eines korrekten adaptiven Immunantwort6,7. Kontrolle dieser Prozesse ist entscheidend für die Herstellung einer angemessenen adaptive Verteidigung, die den Erreger abtötet ohne schädliche Gewebe Schaden8zu produzieren. Th-Zellen werden nach den Ausdruck oder die Produktion von Oberflächenmoleküle, Transkriptionsfaktoren und Effektor Zytokine definiert und wesentliche und präzise Funktionen in Reaktion auf Krankheitserreger1. Zellen der Th1-Zelle Teilmenge Transkriptionsfaktors T-Bet und das Zytokin Interferon-γ (IFNγ) Ausdrücken und in der Wirt Verteidigung gegen intrazelluläre Erreger1teilnehmen. Quantifizierung der naiven CD4-T-Zell-Aktivierung, Proliferation und Differenzierung der Th1 ist ein nützliches Mittel zur Beurteilung der T Zellen Rolle bei einer Immunantwort.
Dieses Protokoll ermöglicht in Vivo Analyse der Leistungsfähigkeit der in Vitro -generiert BM abgeleitet DCs die Aktivierung, Verbreitung und Th1 Differenzierung der naiven CD4-T-Zellen zu modulieren. Das Protokoll dient auch dazu, die Fähigkeit der naiven CD4-T-Zellen aktiviert, induzierte zu vermehren geprüft und Th1 differenziert (Abbildung 1). Dieses vielseitige Protokoll umgeht die Unfähigkeit, speziell zu manipulieren oder die Studium Zellpopulation in rein in Vivo Protokolle auswählen. Die Auswirkungen von unterschiedlichen Molekülen und Behandlungen auf Domänencontrollern können mit BM von genetisch veränderten Mäusen5 oder durch Behandlung oder genetisch manipulieren isoliert BM Zellen9untersucht werden. T-Zell-Antworten können ebenso erkundet werden, durch den Erwerb von T-Zellen für Adoptiv-Transfer aus unterschiedlichen Quellen oder nach mehreren Manipulationen3,8,10.
Die wichtigsten Vorteile dieses Protokolls sind von zweierlei Art. T-Zell-Aktivierung, Proliferation und Differenzierung der Th1 sind mit einem Flow Cytometry Ansatz analysiert; und dies wird kombiniert mit in Vivo Studien, somit Abwendung Veränderungen, die in Vitro auftreten können sowie Zelltypen und andere Faktoren, die nur in intakten Organe11gefunden.
Die Verwendung von lebenswichtigen Farbstoffen ist eine weit verbreitete Technik, Zellproliferation und vermeiden den Gebrauch von Radioaktivität zu verfolgen. Die Messung der Verbreitung mit dieser Reagenzien basiert auf Farbstoff Verdünnung nach der Zellteilung. Darüber hinaus diese Farbstoffe können bei mehreren Wellenlängen erkannt werden und sind leicht durch Durchflusszytometrie in Kombination mit mehreren fluoreszierende Antikörper oder Marker analysiert. Wir markieren die Nützlichkeit dieses Protokoll zeigt, wie die T-Zellaktivierung, Proliferation und Differenzierung der Th1 durch Durchflusszytometrie analysiert werden können.
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Protocol
Experimentelle Verfahren wurden genehmigt durch die Fundación Centro Nacional de Investigaciones Cardiovasculares Carlos III (CNIC) und der Comunidad Autónoma de Madrid nach spanischen und europäischen Richtlinien. Mäuse wurden in spezifischen Erreger frei (SPF) Bedingungen gezüchtet und durch Kohlendioxid (CO2) Inhalation eingeschläfert wurden.
1. Isolierung von Knochenmarkzellen Maus aus Gebeinen und Oberschenkelknochen
Hinweis: Der C57BL/6 Congenic Maus Stamm trägt die differenzierte Leukozyten Marker Ptprcein, allgemein anerkannt als CD45.1 oder Ly5.1, während Wildtyp C57BL Stämme der Ptprcb -Allel, bekannt als CD45.2 oder Ly5.2 tragen. CD45.1 und CD45.2 Varianten können durch Durchflusszytometrie mit Antikörpern unterschieden werden. CD45.1, CD45.2 und CD45.1/CD45.2 Mäuse können als Zelle Quellen oder als Empfänger für Adoptiveltern Transfer, schönem Ablaufverfolgung der unterschiedlichen Zellpopulationen durch Durchflusszytometrie verwendet werden. Bevorzugt verwenden Alter- und Geschlecht abgestimmt männlichen oder weiblichen Mäusen unter 12 Wochen alt.
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Vorbereitung der Oberschenkelknochen und Schienbeine
- Einschläfern Sie Mäuse, die mit dem Protokoll der institutionellen Tierbetreuung Ausschuss angenommene.
- Desinfizieren Sie den hinteren Gliedmaßen durch Besprühen der tierischen Oberfläche mit 70 % Ethanol.
- Verwenden Sie sterile Schere, Pinzette und Skalpell. Machen Sie mit einem Skalpell einen Schnitt in der Haut und entfernen Sie die Haut von den distalen Teil der Maus einschließlich der Haut über der hinteren Extremitäten. Schälen Sie die Haut rund um die untere Wadenmuskulatur und die Haut von den Beinen vollständig zu entfernen (Abb. 2A, 2 b).
- Den Quadrizeps-Muskel aus dem Oberschenkelknochen mit einem Skalpell zu trennen. Machtkonfiguration des Hüftgelenks ohne den Femur-Kopf. Entfernen Sie die Muskeln aus der Tibia mit einem Skalpell (Abbildung 2, 2D). Trennen Sie das Femur ohne die Knochenenden der Tibia.
- Halten Sie die Knochen in einer Petrischale mit 10 % fetalen bovine Serum (FBS) und 1 % Penicillin/Streptomycin im eiskalten 1 X Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 Medium.
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Zelle isoliert
Hinweis: Alle weiteren Schritte müssen unter einem Kultur-Haube und mit sterilem Material zur Vermeidung von Kontaminationen durchgeführt werden.- In eine sterile Petrischale, sorgfältig die proximalen und distalen Enden jedes Knochens mit einem Skalpell abgeschnitten.
- Spülen Sie die Knochen immer wieder mit einem Gesamtvolumen von 10 mL warme komplette RPMI Medium (RPMI + 10 % FBS, 2 mM EDTA, 1 % Penicillin/Streptomycin, 20 mM HEPES, 55 µM 2-Mercaptoethanol, Natrium Pyruvat 1 mM und 2 mM L-Glutamin). Spülen Sie die Knochen von beiden Enden mit einer 25 G Nadel befestigt eine 1 mL Spritze.
- Übertragen der Effluate auf eine 50 mL konische Rohr mit einem 70 µm-Nylon-Web-Filter ausgestattet. Entfernen Sie sorgfältig Schutt und Zelle Konglomerate von sanft umrühren und pipettieren.
- Zentrifugieren der Zellsuspension bei 250 X g für 10 min bei Raumtemperatur (RT).
- Aufschwemmen der Zelle Pellet in 1 mL kalten roten Blutzelle Lysis Puffer (0,15 M NH4Cl + 1 mM KHCO3 + 0, 1 mM EDTA, eingestellte pH-Wert auf 7.2 mit 1 N HCl, 0,4 µm steril filtriert und bei 4 ° C gelagert). Halten Sie für 5 min auf Eis mit dem Handbuch schütteln.
- Hinzugeben Sie 10 mL kaltem Puffer (1 x 2 % Rinderserumalbumin (BSA), Phosphat gepufferte Kochsalzlösung (PBS) + 2 mM EDTA) zu inaktivieren und Auswaschen der roten Blutzelle Lysis Puffer.
- Zentrifugieren der Zellsuspension bei 250 X g für 5 min bei 4 ° C.
- Zellen mit 25 mL des kompletten RPMI Medium und Zentrifuge bei 250 X g für 5 min bei 4 ° c zu waschen
- Die Zellen in 5 mL komplette RPMI Medium aufzuwirbeln. Mix 50 µL Zellsuspension 1:1 mit Trypan blau. Bestimmen Sie die Anzahl von Zellen in einer Zählkammer unter dem Mikroskop. Die Anzahl von Zellen mit der Formel zu berechnen: Zellen/mL = [(nicht-gefärbten Zelle Graf/4) x 2 x 10.000]12.
Hinweis: Diese Methode Erträge 40 x 106 bis 60 x 106 Knochen Knochenmarkzellen pro nicht infizierten 8 bis 12 Wochen alten C57BL/6-Maus. - Zentrifugieren der Zellsuspension bei 250 X g für 5 min bei 4 ° C.
2. DC Differenzierung, Reifung und Antigen beladen
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BM-Zelle, die Ernte
- Samen Sie die komplette Kultur auf 6-Well ultra-low-Anlage Richtplatten bei 106 Zellen pro mL des Mediums, in der Regel in 5 mL pro Bohrloch. Differenzierte Makrophagen werden zu den Kultur-Platten legen. Nach 12 h übertragen des Überstands, enthält vor allem Monozyten, um 6-Well-Platten, verwerfen die alten 6-Well-Platten mit eingehalten Makrophagen zu reinigen.
- Zur Förderung der Zelldifferenzierung Kultur die nicht-anhaftende Zellen am 5 x 105 Zellen pro mL in der Regel 5 ml pro Bohrloch des kompletten RPMI Medium mit 20 ng/mL im Handel erhalten rekombinante murine GM-CSF bei 37 ° C und 5 % Kohlendioxid (CO2) und täglich zu beobachten.
- Alle 3 Tage, spin-down suspendierten Zellen und sammeln die adhärenten Zellen mit 5 mM EDTA mit PBS-Puffer und spin-down. Kombinieren und 5 x 105 Zellen/ml in frisches Medium mit 20 ng/mL Rm-GM-CSF aufzuwirbeln.
- Am 8. Tag sammeln Sie anhaftende und freistehende Zellen wie oben beschrieben zu und Aufschwemmen Sie am 5 x 105 Zellen/mL in mittlerer mit 20 ng/mL GM-CSF und 20 ng/mL Lipopolysaccharid (LPS) für 24 h in einer Gewebekultur-unbehandelte sterile Petrischale, induzieren hohe MHC-II , CD80 und CD86 Ausdruck.
- Check DC Differenzierung durch Durchflusszytometrie wie in Schritt 2.2 angegeben.
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Flow Cytometry Differenzierung und Reifung Analyse.
- Zentrifugieren der Zellsuspension bei 250 X g für 5 min bei 4 ° C. Wiederholen Sie diesen Schritt zweimal.
- Block-Fc-Rezeptoren durch Inkubation der Pellet resuspendierte Zelle in Maus Fc-Rezeptor-Blocker (anti-Maus IgG CD16/CD322 b Antikörper gereinigt) für 15 min bei 4 ° C nach den Anweisungen des Herstellers.
- Zentrifugieren der Zellsuspension bei 250 X g für 5 min bei 4 ° C.
- Aufschwemmen Sie für jede Sonde 250.000 Zellen in 300 µL Flow Cytometry Puffer (1 x PBS + 2 mM EDTA + 2 % BSA) bei 4 ° C.
- Übertragen Sie 30 µL Zelle Lösung pro Bohrloch auf einer 96-Well-Platte.
- Zentrifugieren der Zellsuspension bei 250 X g für 5 min bei 4 ° C.
- Den überstand verwerfen und hinzufügen 30 µL Antikörper enthaltende Puffer zu jeder gut Anschluss an die Anweisungen des Herstellers. Inkubieren Sie die Zellen mit Antikörpern für 20 min bei 4 ° c
Hinweis: In der Regel beschäftigt Markierungen für DCs, Monozyten und Makrophagen CD11b, CD64 CD115, CD11c, ARBEITSPLATZAUSSTATTUNG, CD80 und CD86 sind (Abbildung 3). - Zentrifugieren Sie die Proben bei 250 X g für 5 min bei 4 ° C und Aufschwemmen in 200 µL pro Bohrloch Kaltfluss zytometrie Puffer, enthält eine Markierung, um tote Zellen (z. B. Propidium Jodid, 4 ', 6-Diamidino-2-Phenylindole (DAPI) oder ein Amin Reaktivfarbstoffen ausschließen ) in der vom Hersteller empfohlenen Konzentration13.
- Monitor-Zell-Differenzierung durch Übertragung der Proben, zytometrie Messrohre und Flow Cytometry Analyse ausgenommen abgestorbene Zellen an Tagen 0, 3, 6 und 9.
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DC-Antigen beladen.
- Am 8. Tag, Zentrifugieren Sie die Proben bei 250 X g für 5 min bei 4 ° C und die Pellets in 200 µL Medium Aufschwemmen (RPMI + 10 % FBS ohne Antibiotika). Wiederholen Sie diesen Schritt zweimal.
- Inkubieren Sie die DCs mit 10 µg/mL OVAp (323-339; ISQAVHAAHAEINEAGR) pro 1 x 107 DCs in 1 mL des Mediums (RMPI + 1 % FBS) in Kunststoffhülse für mindestens 30 min bei 37 ° C. Unbelasteten OVAp DCs als Negativkontrolle Bedingung verwenden.
- Zentrifugieren Sie die Proben bei 250 X g für 5 min bei 4 ° C und aufzuwirbeln Sie die Pellets in 200 µL kompletten RPMI Medium. Wiederholen Sie diesen Schritt zweimal.
- Zentrifugieren Sie die Proben bei 250 X g für 5 min bei 4 ° C und die Pellets in 200 µL Medium Aufschwemmen (RPMI + 10 % FBS) 2 x 106 Zellen/ml.
3. Isolation von naiven CD4-T-Zellen von Mäusen OTII
Hinweis: Diese Methode führt ca. 100 x 106 Spleenocytes pro nicht infizierten 8 bis 12 Wochen alten C57BL/6-Maus. Männchen und Weibchen können verwendet werden. CD4-T-Zellen können von Milz oder Lymphknoten isoliert werden; CD4-T-Zellen machen etwa 25 % und 50 % der Zellen in diesen Organen bzw.. Führen Sie die folgenden Schritte unter sterilen Bedingungen.
- Leisten-, Axilläre, brachial, Gebärmutterhals- und mesenterialen Lymphknoten und der Milz von OTII transgenen Mäusen (Abbildung 4) zu isolieren und zu einem Kunststoff Petrischale mit 10 mL der kompletten RPMI Medium zu übertragen.
- Spülen Sie die Zelle-Sieb mit 2 mL des kompletten RPMI Medium und entfernen Sie es aus der 50 mL-Tube. Transfer-Lymphknoten und Milz, ein 70 µm Zelle Sieb platziert in einer 50 mL-Tube. Mit einer Spritzenkolben (Abbildung 5) zu homogenisieren und Medium hinzufügen bis zu 15 mL.
- Zentrifugieren Sie die Proben bei 250 X g für 5 min bei 4 ° C und Aufschwemmen der Pellets in 15 mL komplette RPMI Medium. Wiederholen Sie diesen Schritt zweimal.
- Für Milz Zellsuspension Aufschwemmen der Zelle Pellet und lyse der roten Blutkörperchen, wie in Schritt 1.2.5 angegeben.
- Zentrifugieren der Zellsuspension bei 250 X g für 5 min bei 4 ° C.
- Waschen Sie Zellen mit 25 mL des kompletten RPMI Medium und Zentrifuge bei 250 X g für 5 min bei RT
- Die Zellen in 5 mL Medium aufzuwirbeln. Mischen Sie mit Trypan blau 50 µL Zellsuspension 1:1. Bestimmen Sie die Anzahl von Zellen mit einer Zählkammer unter dem Mikroskop. Die Anzahl von Zellen mit der Formel zu berechnen: Zellen/mL = [(nicht-gefärbten Zelle Graf/4) x 2 x 10.000]12.
- Wiederholen Sie Schritt 2.2.2.
- Inkubieren Sie nach den Anweisungen des Herstellers die Zellen mit 1:800 Verdünnungen biotinylierte Antikörper gegen CD8α, IgM, B220, CD19, ARBEITSPLATZAUSSTATTUNG (I-Ab), CD11b, CD11c, CD44, CD25 und DX5 für 30 min auf Eis für später negative Auslese der CD4-T-Zellen.
- Nach den Anweisungen des Herstellers und basierend auf der Anzahl der Zellen und die Kapazität der Perlen, berechnen Sie die erforderliche Menge an Streptavidin beschichteten magnetische Microbeads und Isolieren von CD4-T-Zellen mit magnetischen Zelle Trennzeichen und den entsprechenden Trennsäulen.
- Aufschwemmen der Zellen in 5 mL komplette RPMI Medium und halten sie auf dem Eis beim lebenden Zellen zu zählen, wie unter Punkt 3.7 beschrieben.
- Extrahieren Sie 2 x 105 Zellen zu und überprüfen Sie die Reinheit der gesammelten Zellen mit anti-CD3, CD4 und CD8, B220 fluoreszierenden Antikörpern in einem Durchflusszytometer mit Antikörper-Verdünnungen Hersteller empfehlen.
- Um isolierte naive CD4/OTII T-Zellen zu beflecken, Aufschwemmen Sie 106 Zellen in 500 µL Puffer (1 x PBS + 2 mM EDTA + 2 % BSA). Bereiten Sie 500 µL Puffer (1 x PBS + 2 mM EDTA + 2 % BSA), enthält die vom Hersteller empfohlene Endkonzentration von lebenswichtige Zelle Tracer Farbstoff zu verdoppeln. Mischen Sie beide Lösungen, indem Sie langsam die Zelle-Tracer-Lösung zu der Zellsuspension. Inkubieren Sie die Zellen für 5 min bei 37 ° c
- Waschen Sie die Zellen mit 5 mL der kompletten RPMI Medium und Zentrifuge bei 250 X g für 5 min bei 4 ° C. Wiederholen Sie diesen Schritt zweimal. Die Zellen in 1 mL der kompletten RPMI Medium 1 x 107Zellen/ml aufzuwirbeln.
4. in Vivo Aktivierung, Proliferation und Differenzierung-Assay Th1
Hinweis: Der lebenswichtige Zelle Tracer Farbstoff Carboxyfluorescein Diacetat Succinimidyl Ester (CFSE-) und andere Succinimidyl Ester-Basis Farbstoffe, die aufgeregt und Fluoreszenz bei unterschiedlichen Wellenlängen emittieren, sind am meisten benutzt lymphozytenproliferation Bewertung durch Strömung zytometrie aufgrund ihrer hohen Fluoreszenzintensität, lange Lebensdauer, geringe Variabilität und geringe Toxizität14.
- Adoptively transfer intravenös (i.v.) 1 x 106 live lebenswichtige Zelle Tracer Farbstoff gefärbt naive CD4/OTII T-Zellen in 100 µL PBS per Mausklick. Beschriftete T-Zellen können adoptively durch Rute Vene oder Retro-Orbital Injektion15übertragen werden; in beiden Fällen werden die Zellen zu den lymphatischen Organen (Abb. 6A) nach Hause.
- Fordern Sie die Empfänger Mäuse einen Tag später durch die Übertragung von adoptively 100.000 LPS gereift OVAp geladen DCs durch subkutane Injektion (s.i.) in der Wegelagerer (Abb. 6 b).
- Ernten Sie popliteal Lymphknoten vom Empfänger Mäuse und verarbeiten sie bis die Einholung der einzelnen Zellsuspensionen die gleichen Schritte wie oben beschrieben in 3.1 und 3.2. Dazu am 2. Tag Post-Immunisierung, CD4/OTII T-Zell-Aktivierung zu messen, und am Tag 5, Proliferation und Differenzierung der Th1 zu messen.
- T-Zell-Aktivierung am 2. Tag zu analysieren, zu beflecken Zellen mit fluoreszierenden Antikörpern gegen CD4, CD69 und CD25 (optional CD45.1 und CD45.2) und bestimmen Sie den Prozentsatz der C69+CD25+ T-Zellen in der CD4-Bevölkerung. Analysieren von Durchflusszytometrie (Abbildung 7).
- Überprüfen der T-Zell-Proliferation am 5. Tag Beflecken Sie Zellen unter Verwendung von geeigneten fluoreszierende Antikörper gegen CD4 und optional CD45.1 und CD45.2. Analysieren Sie den Verfall des lebenswichtige Zelle Tracer Farbstoff Signals in der CD4-Bevölkerung durch Durchflusszytometrie (Abbildung 8). Mehrere Parameter lassen sich in diesen Studien, wie die Anzahl der Zellteilungen durchgemacht durch Zellen gekennzeichnet mit der lebenswichtige Zelle Tracer Farbstoff, der Prozentsatz der teilenden Zellen in jeder Fluoreszenz-Gipfel und der Prozentsatz der teilenden Zellen in der gesamten Zelle bestimmen Bevölkerung.
- Th1-Differenzierung am 5.Tag, Platte 400.000 Zellen pro Bohrloch einer 96-Well-Platte in 200 µL kompletten RPMI Medium mit 1 µM Ionomycin und 10 ng/mL Phorbol 12 Myristate 13-Acetat (PMA) für 6 h bei 37 ° C im Brutschrank bestimmen. Fügen Sie für die letzten 4 h 3 – 10 µg/mL Brefeldin A bis Zytokin-Sekretion auf das Medium zu blockieren.
- Zentrifugieren Sie die Platten für 5 min bei 250 X g bei 4 ° C. Den Überstand durch raschen Umkehrung der 96-Well-Platte zu verwerfen.
- Wiederholen Sie Schritt 2.2.2.
- Zellmembranen durch Inkubation für 15 min bei 4 ° C in 30 µL Puffer (1 x PBS + 2 mM EDTA + 2 % BSA) enthält Antikörper CD4 und optional CD45.1 und CD45.2 bei vom Hersteller empfohlenen Verdünnungen zu beflecken. Waschen der Zellen durch Zugabe von 150 µL Puffer (1 x PBS + 2 mM EDTA + 2 % BSA) und die Platten für 5 min bei 250 X g bei 4 ° C zentrifugiert und überstand verwerfen.
- Beheben der Zellen durch Zugabe von 100 µL der 2 % paraformaldehyde/1% Saccharose für 20 min bei RT. Zentrifuge die Platten für 5 min bei 1000 X g und 4 ° C. Verwerfen Sie den überstand.
- Permeabilize der Zellen durch Zugabe von 50 µL der intrazellulären Permeabilisierung Puffer (1 x PBS + 0,1 % BSA, 0,01 M HEPES, 0,3 % Saponin) und 30 min bei 4 ° c inkubieren
- Fügen Sie 150 µL PBS und Zentrifuge für 5 min auf 1.000 X g bei RT verwerfen der Überstand.
- Färben von intrazellulären Zytokinen durch Zugabe von 30 µL Fluorophor-konjugierten anti-IFNγ Antikörper im Puffer (PBS + 0,1 % Saponin) und 30 min bei RT inkubieren
- Waschen Sie die Zellen durch Zugabe von 150 µL Puffer (PBS + 0,1 % Saponin). Zentrifugieren Sie die Platten für 5 min bei 1000 X g bei RT und verwerfen Sie den überstand. Wiederholen Sie diesen Schritt zweimal.
- Analysieren Sie Zell-Populationen durch Durchflusszytometrie (Abbildung 8).
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Representative Results
Abbildung 1 zeigt die in diesem Protokoll beschriebenen Schritte. Abbildung 2 veranschaulicht die Isolation und die Kultur der BM Mauszellen. Die Zugabe von GM-CSF und LPS zu diesen Kulturen ermöglicht die in-vitro- Erzeugung und Reifung der DCs. Abbildung 3 veranschaulicht die Flow-zytometrie-Analyse der Differenzierung und Reifung der erhaltenen DCs. OVAp geladen GM-CSF BM abgeleitet DCS und isolierte lebenswichtige Zelle Spur Farbstoff gefärbt CD4/OTII T-Zellen sind adoptively auf Mäuse übertragen. Abbildung 4 zeigt die Lage der Lymphknoten für die Isolierung von CD4/OTII T-Zellen verwendet. Abbildung 5 zeigt eine 50 mL-Tube mit 70 µm-Nylon-Filter ausgestattet und ein Spritzenkolbens verwendet, um die Lymphknoten und die Milz zu homogenisieren. Abbildung 6 zeigt i.v. Injektion der CD4/OTII T-Zellen in der Retro-Orbital-Plexus und die s.c. Injektion von OVAp geladen GM-CSF BM abgeleitet DCs in der Straßenräuber. CD4/OTII T-Zellen verteilen zu den anderen lymphatischen Organen, während GM-CSF DCs auf die popliteal Lymphknoten migrieren wo GM-CSF DCs durch die Präsentation von OVAp naive CD4/OTII T-Zellen aktivieren. Naive CD4/OTII T-Zellen dann vermehren und in Richtung der Th1-Phänotyp zu unterscheiden. Abbildung 7 zeigt die Quantifizierung der naiven CD4/OTII T-Zell-Aktivierung aus der Analyse der Membran CD69 und CD25 Ausdruck. Abbildung 8 zeigt die Quantifizierung der CD4/OTII T-Zell-Proliferation. Abbildung 9 zeigt die Quantifizierung der CD4/OTII T-Zell-Differenzierung gegenüber der Th1-Phänotyp.
Abbildung 1: Protokollschema. (1) isolieren Sie BM Zellen aus Maus Oberschenkelknochen und Schienbeine. (2) Kultur BM Zellen mit GM-CSF, GM-CSF BM generieren abgeleitet-DCs. 3) Check DC Differenzierung und Reife GM-CSF BM abgeleitet-DCs mit LPS. (4) Check DC Reifung. (5) laden pls mit OVAp. (6) isolieren CD4/OTII T-Zellen bilden Maus Milz. (7) Fleck CD4/OTII T-Zellen mit lebenswichtigen Zelle Tracer Farbstoff. (8) Isolierung Reinheit und lebenswichtige Zelle Tracer Farbstoff Färbung des isolierten CD4/OTII T-Zellen zu überprüfen. (9) übertragen Sie isolierte CD4/OTII T Zellen i.v. adoptively zum Empfänger Mäuse 10). adoptively OVAp geladen und gereifte DCs s.c. auf Empfänger Mäuse übertragen. (11) CD4/OTII T-Zell-Aktivierung zu überprüfen. (12) CD4/OTII T-Zell-Proliferation und Differenzierung zu überprüfen. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 2: Knochenmark isoliert Prozess von der Maus Oberschenkelknochen und Schienbeine. (A) Haut Schnitt mit der Schere. (B) Entfernung von Haut aus der Extremität. (C) Muskel-Schnitt mit der Schere. (D) Entfernung des Muskels von der Extremität mit einem Skalpell. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 3: Flow Cytometry Analyse der Reifung der GM-CSF BM abgeleitet DCs. Ausdruck der ARBEITSPLATZAUSSTATTUNG, CD80 und CD86 in LPS aktiviert (+ LPS) Oberfläche und nicht aktiviert (-LPS) GM-CSF BM abgeleitet DCs. Zahlen zeigen die mittlere Fluoreszenzintensität in beliebige Einheiten (AE). Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 4: Position der leisten-, Axilläre, brachial, Gebärmutterhals- und mesenterialen Lymphknoten und der Milz bei Mäusen. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 5: experimentelle Einrichtung für Lymphknoten und Milz Homogenisierung. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 6: Adoptiveltern Transfer von CD4/OTII T-Zellen und OVAp geladen GM-CSF BM-abgeleitet-DCs. (A) intravenöse Injektion von CD4/OTII T-Zellen in der Retro-Orbital-Plexus. (B) die subkutane Injektion von GM-CSF BM abgeleitet DCs OVAp geladen in die Straßenräuber. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 7: Quantifizierung der T-Zell-Aktivierung in Vivo. Flow Cytometry Grundstücke und Graph zeigt die Analyse und Quantifizierung der Membran Ausdruck CD69 in CD4-T-Zellen. CD45.1/CD45.2 Mäuse waren adoptively übertragenen i.v. mit Maus CD45.1/CD4/OTII und CD45.1/CD4/OTII Zellen 24 h vor dem s.c. Adoptiv Transfer von OVAp geladen GM-CSF BM-abgeleitet-DCs T-Zell-Aktivierung wurde an 2 Tagen Post-DC gemessen, Übertragung durch Durchflusszytometrie nach der Färbung mit Leuchtstoff-markierten Antikörpern auf die angegebenen Antigene. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 8: Quantifizierung der T-Zell-Proliferation in Vivo. Flow Cytometry Grundstücke und Diagramme, die Analyse und Quantifizierung der Rückgang lebenswichtige Zelle Tracer Färbung Färbung in Proliferierende CD4-T-Zellen. CD45.2 Mäuse waren adoptively übertragenen i.v. mit Mauszellen CD45.1/CD4/OTII 24 h vor dem s.c. Adoptiv Transfer von OVAp geladen GM-CSF BM-abgeleitet-DCs T-Zell-Proliferation wurde gemessen bei 5 Tage Post-DC Übertragung durch Durchflusszytometrie nach Färbung mit der fluoreszierende Antikörper angezeigt. T-Zell-Proliferation kann durch Messung der Anteil der proliferierenden Zellen, der Anteil der Zellen in jeder Abteilung Gipfel oder durch zählen der Anzahl der Abteilung Gipfel wie in den Diagrammen dargestellt ermittelt werden. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 9: Quantifizierung der T-Zell-Differenzierung zu Th1 Phänotyp in Vivo. Flow Cytometry Diagramme und Diagramme, die Analyse und Quantifizierung des Prozentsatzes der IFNγ auszudrücken CD4 T-Zellen. CD45.2 Mäuse waren adoptively übertragenen i.v. mit Mauszellen CD45.1/CD4/OTII 24 h vor dem s.c. Adoptiv Transfer von OVAp geladen GM-CSF BM-abgeleitet-DCs T-Zell-Differenzierung war gemessen am Tage Post-DC Übertragung durch Durchflusszytometrie nach der Färbung mit der fluoreszierende Antikörper angezeigt. T-Zell-Differenzierung gegenüber der Th1-Phänotyp wurde als IFNγ exprimierenden Zellen als Prozentsatz der gesamten CD4 T-Zellen und aus nur die proliferierenden CD4-T-Zellen bestimmt. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
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Discussion
Dieses Protokoll ermöglicht die Charakterisierung der Kapazität der BM-abgeleitete DCs die Aktivierung, Proliferation und Differenzierung von naiven CD4-T-Zellen zu modulieren. Darüber hinaus es auch lässt sich beurteilen, die Anfälligkeit der CD4-T-Zellen zur Modulation von DCs BM abgeleitet. Mit diesem Protokoll kann Änderungen an diesen Veranstaltungen gemessenen in Vivo.
Je nach der Hypothese untersucht können mehrere Kombinationen von T-Zellen und DCs verwendet werden. Zum Beispiel kann man die Folgen von klopfen in oder ausschlagen bestimmter Gene oder die Leistungsfähigkeit eines bestimmten Reizes von CD4-T-Zell-Aktivierung, Verbreitung oder Th1 Differenzierung analysieren. Diese Eingriffe können auf DCs oder CD4 T Zellen oder auf beiden Zelltypen. Somit sind CD4-T-Zellen von Wildtyp oder gentechnisch veränderte Mäuse mit DCs abgeleitet von Wildtyp Mäusen und umgekehrt kombinierbar.
Dieses Protokoll kann die Herkunft der unterschiedlichen Zellpopulationen zu unterscheiden, mittels Durchflusszytometrie und Antikörper gegen CD45.1 und CD45.2 angepasst werden. In der Tat können CD45.1/CD45.1 und CD45.2/CD45.2 Mäuse als die Quelle aller verwendeten Zelltypen oder als Empfänger für Adoptiv-Transfer in beliebiger Kombination verwendet werden. Z. B. CD4-T-Zellen CD45.1/CD45.1/OTII Mäuse erhalten Sie bei CD45.2/CD45.2 Mäusen den Ursprung des BM für DC-Generation sein. In diesem Experiment können beide Zelltypen adoptively CD45.1/CD45.2 Mäuse übertragen werden. Darüber hinaus CD4/OTII T-Zellen von CD45.1/CD45.1 geben Sie einen Mäuse und CD45.2/CD45.2 Typ zwei Mäuse können in der gleichen oder unterschiedlichen CD45.1/CD45.2 Typ drei Empfänger geben Sie zwei CD4-T-Zell-Populationen im Wettbewerb zu vergleichen das Verhalten der Typ eins kombiniert werden und bzw. nicht-konkurrierende Bedingungen.
Diese Methode beschreibt die Erzeugung von GM-CSF BM abgeleitet DCs. Allerdings gibt es alternative Protokolle für DC Reifung und Differenzierung; zum Beispiel kann Papain anstelle von LPS oder Fms-bezogene Tyrosin-Kinase 3 Liganden (Flt3-L) anstelle von GM-CSF, ermöglicht Studie über die Kapazität der phänotypisch ausgeprägte DCs CD4 T-Zelle adaptive Immunität aktivieren verwendet werden. Mit der gleichen Absicht DCs für Antigen beladen und Präsentation werden können direkt von Mäusen isoliert. Kombination dieses Protokolls mit anderen9 ermöglicht die Manipulation der naiven CD4/OTII T-Zellen durch Virusinfektion16 vor ihre Adoptiveltern Übertragung auf Empfänger Mäuse. BM kann auch mit Retroviren9 um die Wirkung von kontrollierten Zelle Änderungen auf Domänencontrollern vor ihrer Verwendung im Protokoll untersuchen ausgestrahlt werden.
Darüber hinaus kann dieses Protokoll für intravitalen Mikroskopie Studien17 angepasst werden, mithilfe von fluoreszierenden Protein exprimierenden Zellen. Zum Beispiel können CD4/OTII Mäuse mit GFP oder Kirsche-exprimierenden Mäuse zu GFP oder Kirsche/OTII CD4 Mäuse überquert werden. Diese Mäuse können dann verwendet werden, als eine Quelle von CD4-T-Zellen und in Vivo Experimente mit BM abgeleitet DCs aus Kirsche oder GLP-exprimierenden Mäuse, je nach Bedarf kombinierbar.
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Disclosures
Die Autoren haben nichts preisgeben
Acknowledgments
Wir danken Dr. Simon Bartlett für englische Bearbeitung. Diese Studie wurde unterstützt durch Zuschüsse vom Instituto de Salud Carlos III (ISCIII) (PI14/00526; PI17/01395; CP11/00145; CPII16/00022), Miguel Servet Programm und Fundación Ramón Areces; mit Kofinanzierung von Fondo Europeo de Desarrollo Regional (FEDER). Das CNIC wird unterstützt durch das Ministerium für Wirtschaft, Industrie und Wettbewerbsfähigkeit (MEIC) und der Stiftung Pro CNIC und ist ein Severo Ochoa Center of Excellence (SEV-2015-0505). RTF ist gegründet von Fundación Ramón Areces und CNIC, VZG durch ISCIII, BHF von Instituto de Investigación Sanitaria Krankenhaus 12 de Octubre (imas12) und JMG-G von den ISCIII Miguel Servet Programm und imas12.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Ethanol | VWR Chemicals | 20,824,365 | 5 L |
| Scissors | Fine Science Tools (F.S.T.) | 14001-12 | |
| Forceps | Fine Science Tools (F.S.T.) | 11000-13 | |
| Fine Forceps | Fine Science Tools (F.S.T.) | 11253-20 | |
| Scalpel | Fine Science Tools (F.S.T.) | 10020-00 | Box of 100 blades |
| Fetal Bovine Serum | SIGMA | F7524 | |
| Penicillin/streptomycin | LONZA | DE17-602E | |
| Roswell Park Memorial Institute medium (RPMI) | GIBCO | 21875-034 | |
| Sterile Petri dishes | Falcon | 353003 | |
| 25-gauge needle | BD Microlance 3 | 300600 | |
| 1 ml syringe | Novico | N15663 | |
| 15 ml conical tubes | Falcon | 352096 | |
| 50 ml conical tubes | Falcon | 352098 | |
| 70 μm nylon web filter | BD Falcon | 352350 | |
| Red blood lysis buffer | SIGMA | R7757 | 100 Ml |
| EDTA | SIGMA | ED2SS-250 | |
| Bovine Serum Albumin | SIGMA | A7906 | 100 g |
| Trypan blue | SIGMA | 302643-25G | |
| Culture-plates | Falcon | 353003 | |
| 4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid (HEPES) | Cambrex | BE17-737E | |
| Beta-mercaptoethanol | Merck | 8-05740-0250 | |
| Sodium pyruvate | LONZA | BE13-115E | |
| L-glutamine | LONZA | BE17-605E | |
| Recombinant murine Granulocyte Macrophage colony-stimulating factor (GM-CSF) | Prepotech | 315-03 | |
| lipopolysaccharide (LPS) | SIGMA-ALDRICH | L2018 | |
| 96-well-plate | Costar | 3799 | |
| v450 anti-mouse CD11b antibody | BD Biosciences | 560455 | |
| PE anti-mouse CD64 antibody | BioLegend | 139303 | |
| PE anti-mouse CD115 antibody | BioLegend | 135505 | |
| FITC anti-mouse CD11c antibody | BioLegend | 117305 | |
| FITC anti-mouse MHCII antibody | BioLegend | 125507 | |
| APC anti-mouse CD86 antibody | BioLegend | 105011 | |
| APC anti-mouse CD80 antibody | BioLegend | 104713 | |
| Flow Cytometry tubes | Zelian | 300800-1 | PS 12X75 5mL |
| OTII Ovoalbumine peptide | InvivoGen | 323-339 | |
| anti-mouse biotinylated CD8α antibody | Tonbo Biosciences | 30-0081-U500 | |
| anti-mouse biotinylated IgM antibody | BioLegend | 406503 | |
| anti-mouse biotinylated B220 antibody | Tonbo Biosciences | 30-0452-U500 | |
| anti-mouse biotinylated CD19 antibody | Tonbo Biosciences | 30-0193-U500 | |
| anti-mouse biotinylated MHCII (I-Ab) antibody | BioLegend | 115302 | |
| anti-mouse biotinylated CD11b antibody | Tonbo Biosciences | 30-0112-U500 | |
| anti-mouse biotinylated CD11c antibody | BioLegend | 117303 | |
| anti-mouse biotinylated CD44 antibody | BioLegend | 103003 | |
| anti-mouse biotinylated CD25 antibody | Tonbo Biosciences | 30-0251-U100 | |
| anti-mouse biotinylated DX5 antibody | BioLegend | 108903 | |
| streptavidin-coated magnetic microbeads | MACS Miltenyi Biotec | 130-048-101 | |
| Magnetic cell separator | MACS Miltenyi Biotec | 130-090-976 | QuadroMACS Separator |
| Separation columns | MACS Miltenyi Biotec | 130-042-401 | |
| PE anti-mouse CD4 antibody | BioLegend | 100408 | |
| APC anti-mouse CD3 antibody | BioLegend | 100235 | |
| FITC anti-mouse CD8 antibody | Tonbo Biosciences | 35-0081-U025 | |
| Cell Violet Tracer | Thermofisher | C34557 | |
| APC anti-mouse CD25 antibody | Tonbo Biosciences | 20-0251-U100 | |
| Alexa647 anti-mouse CD69 antibody | BioLegend | 104518 | |
| PerCPCY5.5 anti-mouse CD45.1 antibody | Tonbo Biosciences | 65-0453 | |
| APC anti-mouse CD45.1 antibody | Tonbo Biosciences | 20-0453 | |
| PECY7 anti-mouse CD45.1 antibody | Tonbo Biosciences | 60-0453 | |
| FITC anti-mouse CD45.2 antibody | Tonbo Biosciences | 35-0454 | |
| Ionomycin | SIGMA-ALDRICH | I0634 | |
| Phorbol 12 Myristate 13 Acetate (PMA) | SIGMA | P8139 | |
| Brefeldin A (BD GolgiPlug) | BD | 555029 | |
| Paraformaldehyde | Millipore | 8-18715-02100 | |
| Intracellular permeabilization buffer | eBioscience | 00-8333 | |
| APC anti-mouse IFNg antibody | Tonbo Biosciences | 20-7311-U100 | |
| Fc-block (anti-mouse CD16/CD32) | Tonbo Biosciences | 70-0161-U100 | |
| B6.SJL CD45.1 mice | The Jackson Laboratory | 002014 | |
| BD LSRFortessa™ Cell Analyzer | BD Biosciences | 649225 | |
| DAPI Solution | Thermofisher | 62248 |
References
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