Summary
Her presenterer vi i vivo fastsettelse av naiv CD4 T celle (T celle) aktivering, spredning og Th1 differensiering av GM-CSF benmargen (BM) er en protokoll-avledet dendrittiske celler (DCs). I tillegg beskriver denne protokollen BM og T-celle isolasjon, DC generasjon og DC og T-celle adoptivforeldre overføring.
Abstract
Kvantifisering av naiv CD4 T celle aktivering, spredning og differensiering å T helper 1 (Th1) celler er en nyttig måte å vurdere rollen spilt av T-celler i en immunrespons. Denne protokollen beskriver i vitro differensiering av benmarg (BM) progenitors hente granulocytt-macrophage koloni-stimulerende faktor (GM-CSF) avledet-dendrittiske celler (DCs). Protokollen beskriver også adoptivforeldre overføring av ovalbumin peptid (OVAp)-lastet GM-CSF-avledet DCs og naiv CD4 T celler fra OTII transgene mus for å analysere den i vivo aktivering, spredning og Th1 differensiering av den overførte CD4 T-celler. Denne protokollen omgår begrensning av rent i vivo metoder pålagt av kan spesielt manipulere eller velg studerte celle befolkningen. Denne protokollen gir videre studier i i vivo miljø, dermed unngår endringer til funksjonelle faktorer som kan oppstå i vitro og med påvirkning av celletyper og andre faktorer som bare finnes i intakt organer. Protokollen er et nyttig verktøy for å generere endringer i DCs og T celler som endre adaptive immunreaksjoner, å gi viktige resultater for å forstå opprinnelsen og utviklingen av mange immun tilknyttede sykdommer.
Introduction
CD4 T celler og antigen presentere celler (APCs) som DCs er nødvendig meglere av immunitet til mikrobiell patogener1,2. I perifere lymfoide organer, er CD4 T celler aktivert på anerkjennelse av bestemte antigener presentert av APCs3,4,5. Aktivert CD4 T celler spredning og differensiere i forskjellige bestemt effektor Th celler som er nødvendige for utviklingen av en riktig adaptive immunrespons6,7. Kontroll av disse prosessene er kritisk for å produsere en tilstrekkelig adaptive forsvar som dreper patogen uten å produsere skadelige vev skade8. Th celler defineres etter uttrykk eller produksjon av overflaten molekyler, transkripsjonsfaktorer og effektor cytokiner og utføre viktig og nøyaktige svar på patogener1. Celler Th1 celle delmengden express transkripsjon faktoren T-bet og cytokin interferon γ (IFNγ) og delta i vert forsvar mot intracellulær patogener1. Kvantifisering av naiv CD4 T celle aktivering og spredning Th1 differensiering er et nyttig vurdere T celler rollespill i en immunrespons.
Denne protokollen gir i vivo analyse av kapasiteten til in vitro -generert BM-avledet DCs å modulere aktivisering, spredning og Th1 differensiering av naiv CD4 T-celler. Protokollen fungerer også å vurdere kapasitet naiv CD4 T-celler aktivert, overtalt til å spre og Th1 differensiert (figur 1). Denne allsidige protokollen omgår kan spesielt manipulere eller velg studerte celle befolkningen i rent i vivo protokoller. Effekten av diverse molekyler og behandlinger på domenekontrollere kan studeres ved hjelp av BM genmodifiserte mus5 eller behandle eller genetisk manipulering isolert BM celler9. Tilsvarende kan T celle svar utforskes ved å skaffe T celler for adopsjon overføring fra ulike kilder eller etter flere manipulasjoner3,8,10.
De viktigste fordelene med denne protokollen er todelt. T celle aktivering og spredning Th1 differensiering analyseres med en flyt cytometri tilnærming; og dette er kombinert med i vivo studier, dermed avverge endringer som kan oppstå i vitro og inkludert celletyper og andre faktorer som bare finnes i intakt organer11.
Bruk av vitale fargestoffer er en mye brukt teknikk å spore celle spredning og unngå bruk av radioaktivitet. Måling av spredning med disse reagensene er basert på fargestoff fortynning etter celledeling. Videre disse fargestoffer kan oppdages ved flere bølgelengder og analyseres lett av flowcytometri i kombinasjon med flere fluorescerende antistoffer eller markører. Vi markere nytten av denne protokollen ved å vise hvordan T celle aktivering og spredning Th1 differensiering kan analyseres av flowcytometri.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Eksperimentell prosedyrer ble godkjent av den Fundación Nacional Centro de Investigaciones Cardiovasculares Carlos III (CNIC) og Comunidad Autónoma de Madrid spanske og europeiske retningslinjer. Mus ble avlet i bestemte patogen gratis (SPF) forhold og ble euthanized av karbondioksid (CO2) innånding.
1. isolering av musen bein margtransplantasjon celler fra Tibias og Femurs
Merk: C57BL/6 congenic musen belastningen bærer differensial leukocytter markøren Ptprcen, generelt anerkjent som CD45.1 eller Ly5.1, mens vill-type C57BL belastninger gjennomføre Ptprcb allelet, kjent som CD45.2 eller Ly5.2. CD45.1 og CD45.2 kan skilles av flowcytometri ved hjelp av antistoffer. CD45.1, CD45.2 og CD45.1/CD45.2 mus kan brukes som cellen kilder eller mottakere for adopsjon overføring, tillater sporing av de ulike celle populasjonene av flowcytometri. Fortrinnsvis bruk alder- og sex-matchet mann eller kvinne mus under 12 ukens av alderen.
-
Utarbeidelse av Femurs og Tibias
- Euthanize mus ved hjelp av protokollen som er godkjent av dyr institusjon.
- Desinfiser bakbeina av sprøyting dyr overflaten med 70% etanol.
- Bruke sterilt saks, pinsett og skalpeller. Skalpell, må et kutt i huden og fjern skinnet fra den distale del av musen inkludert huden dekke bakre ekstremiteter. Skrelle huden rundt lavere kalv muskler og fjern skinnet fra bena helt (figur 2A, 2B).
- Skille quadriceps muskel fra femur ved hjelp av en skalpell. Disarticulate hofteleddet uten å bryte femur hodet. Fjern musklene fra tibia ved hjelp av en skalpell (figur 2C, 2D). Skille femur fra tibia uten å bryte bein endene.
- Holde beina i en Petriskål inneholder 10% fosterets bovin serum (FBS) og 1% penicillin/streptomycin i iskalde 1 x Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 medium.
-
Cellen aisolering
Merk: Alle etterfølgende trinnene må utføres under kultur hette og med steril materiale å unngå forurensning.- I et sterilt Petriskål, må du nøye avskåret proksimale og distale endene av hver bein med skalpell.
- Tømme Ben gjentatte ganger med et totalt volum på 10 mL av varm komplett RPMI medium (RPMI + 10% FBS, 2 mM EDTA, 1% penicillin/streptomycin, 20 mM HEPES, 55 µM 2-mercaptoethanol, 1 mM natrium pyruvate og 2 mM L-glutamin). Tømme bein fra begge ender med en 25 G nål knyttet til en 1 mL sprøyte.
- Overføring av effluate til en 50 mL konisk rør utstyrt med en 70 µm nylon web filter. Forsiktig kablene rusk og celle konglomerater av mild røring og pipettering.
- Sentrifuge celle suspensjon på 250 x g i 10 min ved romtemperatur (RT).
- Resuspend celle pellet i 1 mL av lyseringsbuffer for kalde røde blodlegemer (0,15 M NH4Cl + 1 mM KHCO3 + 0,1 mM EDTA, justere pH til 7.2 med 1 N HCl, 0.4 µm sterilt filtrert og lagret på 4 ° C). Opprettholde på is 5 min med manuell risting.
- Legge til 10 mL kaldt bufferen (1 x fosfat bufret saltvann (PBS) + 2 mM EDTA + 2% bovin serum albumin (BSA)) for å deaktivere og vaske ut røde blodlegemer lyseringsbuffer.
- Sentrifuge celle suspensjon på 250 x g i 5 min på 4 ° C.
- Vask celler med 25 mL av komplett RPMI medium og sentrifuge 250 x g for 5 min på 4 ° C.
- Resuspend cellene i 5 mL av komplett RPMI medium. Mix 50 µL av cellen suspensjon 1:1 med trypan blå. Fastslå hvor celle i en telling kammer under et mikroskop. Beregne hvor cellen med formelen: celler/mL = [(ikke-farget celle teller/4) x 2 x 10 000]12.
Merk: Denne metoden gir 40 x 106 til 60 x 106 bein margtransplantasjon celler per infisert 8 til 12 uke-gamle C57BL/6 musen. - Sentrifuge celle suspensjon på 250 x g i 5 min på 4 ° C.
2. DC differensiering, modning og Antigen lasting
-
BM cellen høsting
- Frø i fullstendig kultur på 6-og ultra-lav-vedlegg overflaten plater på 106 celler per mL medium vanligvis 5 mL per brønn. Differensiert makrofager vil legge til kultur-platene. Etter 12 h, overføre nedbryting, som hovedsakelig inneholder monocytter, rengjør 6-og plater, forkaster gamle 6-vel platene med de adhered makrofagene.
- For å fremme celledifferensiering, kultur ikke-tilhenger cellene på 5 x 105 celler per mL i vanligvis 5 mL per vel fullstendige RPMI medium som inneholder 20 ng/mL kommersielt innhentet rekombinant murine GM-CSF på 37 ° C og 5% karbondioksid (CO2) og observere daglig.
- Hver 3 dager, Nedspinning suspendert celler og samle tilhenger cellene med 5 mM EDTA i PBS og spinne ned. Kombiner og resuspend på 5 x 105 celler/mL i frisk medium som inneholder 20 ng/mL rm-GM-CSF.
- Dag 8, samle tilhenger og frittliggende celler som ovenfor og resuspend på 5 x 105 celler/mL i middels inneholder 20 ng/mL GM-CSF og 20 ng/mL lipopolysakkarid (LPS) for 24 timer i en ikke-vev kultur-behandlet sterilt Petriskål, å indusere høy MHC-II , CD80 og CD86.
- Sjekk DC differensiering av flowcytometri som angitt i trinn 2.2.
-
Flow cytometri differensiering og modning analyse.
- Sentrifuge celle suspensjon på 250 x g i 5 min på 4 ° C. Gjenta dette trinnet to ganger.
- Blokk Fc reseptorer av rugende den resuspended cellen pellet i musen Fc reseptor blokkering (renset anti musen CD16/CD32 IgG2b antistoff) i 15 min på 4 ° C i henhold til produsentens instruksjoner.
- Sentrifuge celle suspensjon på 250 x g i 5 min på 4 ° C.
- For hver probe, resuspend 250.000 celler i 300 µL av flyt cytometri buffer (1 x PBS + 2 mM EDTA + 2% BSA) på 4 ° C.
- Overføring 30 µL av cell løsningen per brønn til en 96-brønnen-plate.
- Sentrifuge celle suspensjon på 250 x g i 5 min på 4 ° C.
- Forkaste nedbryting og legge til 30 µL av antistoff-inneholder hver godt etter produsentens indikasjoner-buffer. Inkuber cellene med antistoffer for 20 min på 4 ° C.
Merk: Vanligvis ansatt markører for DCs, monocytter og makrofager er CD11b, CD64, CD115, CD11c, MHCII, CD80 og CD86 (Figur 3). - Sentrifuge prøvene 250 x g i 5 min på 4 ° C og resuspend i 200 µL per brønn kalde flyt cytometri bufferen som inneholder en markør for å utelate døde celler (f.eks propidium iodide, 4, 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) eller en Amin-reaktive dye ) på produsentens anbefalte konsentrasjon13.
- Overvåke celledifferensiering ved overføring prøvene å flyt cytometri rør og flyt cytometri analyse unntatt døde celler på dager 0, 3, 6 og 9.
-
DC Antigen lasting.
- På dag 8, sentrifuge prøvene 250 x g i 5 min på 4 ° C og resuspend pellets i 200 µL medium (RPMI + 10% FBS uten antibiotika). Gjenta dette trinnet to ganger.
- Inkuber DCs med 10 µg/mL OVAp (323-339; ISQAVHAAHAEINEAGR) per 1 x 107 DCs i 1 mL av middels (RMPI + 1% FBS) i et plastrør i minst 30 min på 37 ° C. Bruk ikke OVAp lastet DCs som en negativ kontroll tilstand.
- Sentrifuge prøvene 250 x g i 5 min på 4 ° C og resuspend pellets i 200 µL komplett RPMI medium. Gjenta dette trinnet to ganger.
- Sentrifuge prøvene 250 x g i 5 min på 4 ° C og resuspend pellets i 200 µL medium (RPMI + 10% FBS) på 2 x 106 celler/mL.
3. isolering av naiv CD4 T-celler fra OTII mus
Merk: Denne metoden gir ca 100 x 106 spleenocytes per infisert 8 til 12 uke-gamle C57BL/6 musen. Både hanner og hunner kan brukes. CD4 T celler kan isoleres fra milt eller lymfeknuter; CD4 T celler utgjør ca 25% og 50% av celler i disse organene, henholdsvis. Gjør følgende i sterile forhold.
- Isolere inguinal, aksillær, brachialis, cervical og hvem lymfeknuter og milten fra OTII transgene mus (Figur 4) og overføre dem til en plast Petriskål inneholder 10 mL av komplett RPMI medium.
- Skyll celle silen med 2 mL komplett RPMI medium og fjerne den fra 50 mL tube. Overføre lymfeknuter og milt til en 70 µm celle sil plassert i en 50 mL tube. Homogenize bruker en sprøytestempelet (figur 5) og legge til middels opptil 15 mL.
- Sentrifuge prøvene 250 x g i 5 min på 4 ° C og resuspend pellet i 15 mL av komplett RPMI medium. Gjenta dette trinnet to ganger.
- Milt celle suspensjon, resuspend celle pellets og lyse røde blod celler som angitt i trinn 1.2.5.
- Sentrifuge celle suspensjon på 250 x g i 5 min på 4 ° C.
- Vask celler med 25 mL av komplett RPMI medium og sentrifuge 250 x g for 5 min på RT.
- Resuspend cellene i 5 mL av medium. Bland 50 µL av cellen suspensjon 1:1 med Trypan blå. Bestemme cellen nummeret en telling kammer under et mikroskop. Beregne hvor cellen med formelen: celler/mL = [(ikke-farget celle teller/4) x 2 x 10 000]12.
- Gjenta trinn 2.2.2.
- Etter produsentens instruksjoner, ruge cellene med 1:800 fortynninger av biotinylated antistoffer mot CD8α, IgM, B220, CD19, MHCII (I-Ab), CD11b, CD11c, CD44, CD25 og DX5 i 30 min på is senere negative utvalg av CD4 T celler.
- Følg produsentens instruksjoner og basert på antall celler og kapasitet av perler, beregne den nødvendige mengden av streptavidin-belagt magnetiske microbeads og isolere CD4 T celler ved hjelp av magnetiske celle skilletegn og riktig separasjon kolonner.
- Resuspend cellene i 5 mL av komplett RPMI medium og holde dem på is mens telling lever celler som beskrevet i trinn 3.7.
- Ekstra 2 x 105 celler og sjekk renheten av det avhentet celler ved hjelp av anti CD4, CD3, B220 og CD8 fluorescerende antistoffer i en flyt cytometer med produsenten-anbefale antistoff fortynninger.
- Til stain isolert naiv CD4/OTII T-celler, resuspend 106 celler i 500 µL buffer (1 x PBS + 2 mM EDTA + 2% BSA). Forberede 500 µL buffer (1 x PBS + 2 mM EDTA + 2% BSA) som inneholder doble siste produsenten anbefalte konsentrasjonen av vitale celle tracer fargestoff. Bland begge løsninger ved sakte legger celle tracer løsningen til celle suspensjon. Inkuber celler for 5 min på 37 ° C.
- Vask cellene med 5 mL av komplett RPMI medium og sentrifuge 250 x g for 5 min på 4 ° C. Gjenta dette trinnet to ganger. Resuspend cellene i 1 mL av komplett RPMI medium på 1 x 107celler/mL.
4. i Vivo aktivisering, spredning og Th1 differensiering analysen
Merk: Den vitale celle tracer fargestoff carboxyfluorescein diacetate succinimidyl ester (CFSE) og andre succinimidyl ester-basert fargestoffer, som er glade og avgir fluorescens ved forskjellige bølgelengder, brukes til å vurdere lymfocytt spredning flyt cytometri på grunn av deres høye fluorescens intensitet, lang levetid, lave variasjon og lav toksisitet14.
- Adoptively overføre intravenøst (IV) 1 x 106 levende viktig celle tracer fargestoff-farget naiv CD4/OTII T celler i 100 µL av PBS per musen. Merket T-celler kan adoptively overføres ved halen vene eller retro-orbital innsetting15; i begge tilfeller vil cellene hjem til lymfoide organer (figur 6A).
- Utfordre mottaker mus en dag senere ved adoptively overføring 100.000 LPS-modnet OVAp lastet DCs ved injeksjon (si) i Skosåler (figur 6B).
- Høste femoral lymfeknuter fra mottakeren mus og behandle dem før obtainment av enkeltcelle suspensjoner følge de samme trinnene som tidligere beskrevet i 3.1 og 3.2. Gjør dette på dag 2 etter immunisering å måle CD4/OTII T celle aktivering og dag 5 å måle spredning pluss Th1 differensiering.
- Analysere T celle aktivering på dag 2, beis celler med fluorescerende antistoffer mot CD4, CD69 og CD25 (eventuelt CD45.1 og CD45.2) og andelen C69+CD25+ T celler i befolkningen CD4. Analyser av flowcytometri (figur 7).
- For å sjekke T celle spredning på dag 5, beis celler ved hjelp av riktig fluorescerende antistoffer mot CD4 og eventuelt CD45.1 og CD45.2. Analysere forfallet av vitale celle tracer fargestoff signalet i befolkningen CD4 ved flowcytometri (Figur 8). Flere parametere kan bestemmes i disse studiene, for eksempel antall celledelinger gjennomgått av celler merket med viktig celle tracer fargestoff, prosentandelen av dele celler i hver fluorescens topp og andelen dele celler i totalt-cellen befolkningen.
- Å avgjøre Th1 differensieringen dag 5, plate 400.000 celler per brønn av en 96-brønns plate i 200 µL av komplett RPMI medium som inneholder 1 µM ionomycin og 10 ng/mL phorbol 12 myristate 13 acetate (PMA) for 6 h 37 ° C i inkubator. For de siste 4 h, legge 3-10 µg/mL brefeldin en å blokkere cytokin sekresjon til medium.
- Sentrifuge platene i 5 min på 250 x g på 4 ° C. Kast nedbryting av rask inversjon av 96-brønns plate.
- Gjenta trinn 2.2.2.
- Stain cellemembranene av rugende i 15 min på 4 ° C i 30 µL av buffer (1 x PBS + 2 mM EDTA + 2% BSA) inneholder antistoffer CD4 og eventuelt CD45.1 og CD45.2 på produsenten anbefalte fortynninger. Vask cellene ved å legge 150 µL bufferen (1 x PBS + 2 mM EDTA + 2% BSA) og sentrifuge platene i 5 min på 250 x g på 4 ° C og forkaste nedbryting.
- Fastsette cellene ved å legge 100 µL av 2% paraformaldehyde/1% sukrose etter 20 min på RT. sentrifuge platene for 5 min på 1000 x g og 4 ° C. Kast nedbryting.
- Permeabilize cellene ved å legge til 50 µL av intracellulær permeabilization buffer (1 x PBS + 0,1% BSA, 0,01 M HEPES, 0,3% saponin) og Inkuber i 30 min på 4 ° C.
- Legge til 150 µL PBS og sentrifuge for 5 min på 1000 x g ved RT. Forkast nedbryting.
- Stain intracellulær cytokiner ved å legge 30 µL av fluorophore-konjugerte anti IFNγ antistoffer i bufferen (PBS + 0,1% saponin) og Inkuber i 30 min på RT.
- Vask cellene ved å legge 150 µL bufferen (PBS + 0,1% saponin). Sentrifuge platene i 5 min på 1000 x g ved RT og kast nedbryting. Gjenta dette trinnet to ganger.
- Analysere celle populasjoner av flowcytometri (Figur 8).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Figur 1 illustrerer fremgangsmåten beskrevet i denne protokollen. Figur 2 viser den isolasjon og kultur av musen BM celler. Tillegg av GM-CSF og LP-plater til disse kulturene lar den i vitro generasjonen og modning av DCs. Figur 3 illustrerer flyten cytometri analyse av differensieringen og modningen av de fått DCs. OVAp lastet GM-CSF BM-avledet DCs og isolert viktig celle spor fargestoff-farget CD4/OTII T-celler blir adoptively overført til mus. Figur 4 viser lymfeknutene brukes for isolering av CD4/OTII T celler. Figur 5 viser en 50 mL tube med 70 µm nylon filteret og en sprøytestempelet brukes til homogenize lymfeknuter og milt. Figur 6 viser IV injeksjon av CD4/OTII T-celler i retro-orbital plexus og SC injeksjon av OVAp lastet GM-CSF BM-avledet domenekontrollere i footpad. CD4/OTII T celler distribuere til forskjellige lymfoide organer, mens GM-CSF DCs migrere til femoral lymfeknutene der GM-CSF DCs aktivere naiv CD4/OTII T celler ved presentasjon av OVAp. Naive CD4/OTII T celler deretter spredning og differensiere mot Th1 fenotypen. Figur 7 illustrerer kvantifisering av naiv CD4/OTII T celle aktivering fra analyse av membran CD69 og CD25 uttrykk. Figur 8 viser kvantifisering av CD4/OTII T celle spredning. Figur 9 illustrerer kvantifisering av CD4/OTII T celledifferensiering mot Th1 fenotypen.
Figur 1: Protokollskjemaet. 1) isolere BM celler fra mus femurs og tibias. 2) kultur BM celler med GM-CSF generere GM-CSF BM avledet-DCs. 3) av DC differensiering og modne GM-CSF BM avledet-DCs med LPS. 4) undersøker DC modning. 5) laste DCs med OVAp. 6) isolere CD4/OTII T-cellene danner musen milten. 7) flekken CD4/OTII T-celler med viktig celle tracer fargestoff. 8) kontroller isolasjon renhet og viktig celle tracer fargestoffet flekker av isolerte CD4/OTII T-celler. 9) adoptively overføre isolert CD4/OTII T celler IV til mottakeren mus. 10). adoptively overføre OVAp lastet og modnet DCs SC til mottakeren mus. 11) Sjekk CD4/OTII T celle aktivering. 12) Sjekk CD4/OTII T celle spredning og differensiering. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2: benmarg isolasjon prosess fra mus femurs og tibias. (A) huden snitt med saks. (B) fjerning av huden fra lem. (C) muskel snitt med saks. (D) fjerning av muskel fra Ben med en skalpell. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 3: Flow cytometri analyse av modning av GM-CSF BM-avledet DCs. Overflaten uttrykk for MHCII, CD80 og CD86 i LPS aktivert (+ LPS) og ingen-aktivert (-LPS) GM-CSF BM-avledet DCs. tallene viser mener fluorescens intensiteten i vilkårlig enheter (a.u.). Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 4: plassering av lymfeknutene inguinal, aksillær, brachialis, cervical og hvem og milten i mus. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 5: eksperimentelle oppsett for lymfeknute og milt homogenisering. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 6: adopsjon overføring av CD4/OTII T celler og OVAp lastet GM-CSF BM-avledet-DCs. (A) intravenøs injeksjon av CD4/OTII T celler i retro-orbital plexus. (B) Subcutaneous injeksjon av OVAp lastet GM-CSF BM-avledet DCs i footpad. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 7: kvantifisering av T celle aktivering i vivo. Flow cytometri plott og grafen viser analyse og kvantifisering av membran uttrykk for CD69 i CD4 T celler. CD45.1/CD45.2 mus var adoptively overførte IV med musen CD45.1/CD4/OTII og CD45.1/CD4/OTII celler 24 timer før SC adoptivforeldre overføringen av OVAp lastet GM-CSF BM-avledet-DCs. T celle aktivering ble målt på 2 dager innlegg-DC overføring av flowcytometri etter farging med fluorescerende-merket antistoffer mot de angitte antigener. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 8: kvantifisering av T celle spredning i vivo. Flow cytometri plott og grafer viser analyse og kvantifisering av nedgang viktig celle tracer fargestoffet flekker i voksende CD4 T-celler. CD45.2 mus var adoptively overførte IV med musen CD45.1/CD4/OTII celler 24 timer før SC adoptivforeldre overføringen av OVAp lastet GM-CSF BM-avledet-DCs. T celle spredning ble målt på 5 dager innlegg-DC overføring av flowcytometri etter farging med den angitt fluorescerende antistoffer. T celle spredning kan bestemmes ved å måle andelen voksende celler, prosentandelen av celler i hver divisjon topp, eller ved å telle antall divisjon topper som i diagrammene. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 9: kvantifisering av T celledifferensiering mot Th1 fenotypen i vivo. Flow cytometri tomter og grafer viser analyse og kvantifisering av andelen IFNγ-uttrykke CD4 T celler. CD45.2 mus var adoptively overførte IV med musen CD45.1/CD4/OTII celler 24 timer før SC adoptivforeldre overføringen av OVAp lastet GM-CSF BM-avledet-DCs. T celledifferensiering ble målt på dager innlegg-DC overføring av flowcytometri etter farging med den angitt fluorescerende antistoffer. T celledifferensiering mot Th1 fenotypen identifiserte som IFNγ-uttrykke celler i prosent av totalt CD4 T-celler og bare de voksende CD4 T-cellene. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Denne protokollen gir karakterisering av kapasiteten til BM-avledet DCs å modulere aktivisering, spredning og differensiering av naiv CD4 T-celler. Videre kan det også brukes til å vurdere mottakelighet av CD4 T-celler for modulering av BM-avledet DCs. Med denne protokollen kan endringer i disse hendelsene målt i vivo.
Avhengig av hypotesen under etterforskning, kan flere kombinasjoner av T-celler og DCs brukes. For eksempel kan en analysere konsekvensene av banke i eller slå ut bestemte gener eller effektiviteten av en bestemt stimulans CD4 T celle aktivering, spredning eller Th1 differensiering. Disse prosedyrene kan utføres på domenekontrollere eller CD4 T celler eller begge celletyper. Dermed kan CD4 T celler fra vill-type eller genmodifiserte mus kombineres med DCs avledet fra vill-type mus og vice versa.
Denne protokollen kan tilpasses å skille opprinnelsen til ulike celle populasjoner med flowcytometri og antistoffer mot CD45.1 og CD45.2. Faktisk, CD45.1/CD45.1 og CD45.2/CD45.2 mus kan brukes som kilden til noen av de celletyper brukes eller mottakere for adopsjon overføring alle kombinasjoner. For eksempel kan CD4 T celler fås fra CD45.1/CD45.1/OTII mus mens CD45.2/CD45.2 mus kan være opprinnelsen til BM for DC generasjon. I dette eksperimentet, kan begge celletyper adoptively overføres til CD45.1/CD45.2 mus. Videre CD4/OTII T celler fra CD45.1/CD45.1 inn en mus og CD45.2/CD45.2 type to mus kan kombineres i samme eller forskjellige CD45.1/CD45.2 type tre mottakerne sammenligne virkemåten til Skriv en og skriv to CD4 T celle populasjoner i å konkurrere og ikke-konkurrerende forhold, henholdsvis.
Denne metoden beskriver generering av GM-CSF BM-avledet DCs. Men er alternative protokoller tilgjengelig for DC modning og differensiering; papain kan for eksempel brukes i stedet for LPS eller fms-relaterte tyrosin kinase 3 ligand (Flt3-L) i stedet for GM-CSF, slik at studiet av kapasiteten til svært forskjellige DCs å aktivere CD4 T celle adaptiv immunitet. Med samme hensikt, DCs for antigen lasting og presentasjon kan være direkte isolert fra mus. Kombinasjonen av denne protokollen med andre9 tillater for manipulering av naiv CD4/OTII T celler av virusinfeksjon16 før deres adoptivforeldre overføring til mottakeren mus. BM kan også transduced med retroviruses9 å studere effekten av kontrollert celle modifikasjoner på domenekontrollere før bruk i protokollen.
I tillegg kan denne protokollen tilpasses for intravital mikroskopi studier17 ved å bruke fluorescerende protein-uttrykke celler. For eksempel kan CD4/OTII mus krysses med GFP - eller kirsebær-uttrykke mus å få GFP eller kirsebær/OTII CD4 mus. Disse musene kan brukes som en kilde til CD4 T celler og kan kombineres med BM-avledet DCs fra kirsebær - eller GFP-uttrykke mus, som kreves, i vivo eksperimenter.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne ikke avsløre
Acknowledgments
Vi takker Dr. Simon Bartlett engelsk redigeringsspråk. Denne studien ble støttet av tilskudd fra Instituto de Salud Carlos III (ISCIII) (PI14/00526; PI17/01395; CP11/00145; CPII16/00022), Miguel Servet programmet og Fundación Ramón Areces; med co-finansiering fra Fondo Europeo de Desarrollo Regional (FEDER). CNIC er støttet av departementet for økonomi, industri og konkurranseevne (MEIC) og Pro CNIC stiftelsen og er en Severo Ochoa Center of Excellence (SEV-2015-0505). RTF er grunnlagt av Fundación Ramón Areces og CNIC, VZG av ISCIII, BHF ved Instituto de Investigación Sanitaria Hospital de 12 Octubre (imas12) og JMG-G ISCIII Miguel Servet programmet og imas12.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Ethanol | VWR Chemicals | 20,824,365 | 5 L |
| Scissors | Fine Science Tools (F.S.T.) | 14001-12 | |
| Forceps | Fine Science Tools (F.S.T.) | 11000-13 | |
| Fine Forceps | Fine Science Tools (F.S.T.) | 11253-20 | |
| Scalpel | Fine Science Tools (F.S.T.) | 10020-00 | Box of 100 blades |
| Fetal Bovine Serum | SIGMA | F7524 | |
| Penicillin/streptomycin | LONZA | DE17-602E | |
| Roswell Park Memorial Institute medium (RPMI) | GIBCO | 21875-034 | |
| Sterile Petri dishes | Falcon | 353003 | |
| 25-gauge needle | BD Microlance 3 | 300600 | |
| 1 ml syringe | Novico | N15663 | |
| 15 ml conical tubes | Falcon | 352096 | |
| 50 ml conical tubes | Falcon | 352098 | |
| 70 μm nylon web filter | BD Falcon | 352350 | |
| Red blood lysis buffer | SIGMA | R7757 | 100 Ml |
| EDTA | SIGMA | ED2SS-250 | |
| Bovine Serum Albumin | SIGMA | A7906 | 100 g |
| Trypan blue | SIGMA | 302643-25G | |
| Culture-plates | Falcon | 353003 | |
| 4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid (HEPES) | Cambrex | BE17-737E | |
| Beta-mercaptoethanol | Merck | 8-05740-0250 | |
| Sodium pyruvate | LONZA | BE13-115E | |
| L-glutamine | LONZA | BE17-605E | |
| Recombinant murine Granulocyte Macrophage colony-stimulating factor (GM-CSF) | Prepotech | 315-03 | |
| lipopolysaccharide (LPS) | SIGMA-ALDRICH | L2018 | |
| 96-well-plate | Costar | 3799 | |
| v450 anti-mouse CD11b antibody | BD Biosciences | 560455 | |
| PE anti-mouse CD64 antibody | BioLegend | 139303 | |
| PE anti-mouse CD115 antibody | BioLegend | 135505 | |
| FITC anti-mouse CD11c antibody | BioLegend | 117305 | |
| FITC anti-mouse MHCII antibody | BioLegend | 125507 | |
| APC anti-mouse CD86 antibody | BioLegend | 105011 | |
| APC anti-mouse CD80 antibody | BioLegend | 104713 | |
| Flow Cytometry tubes | Zelian | 300800-1 | PS 12X75 5mL |
| OTII Ovoalbumine peptide | InvivoGen | 323-339 | |
| anti-mouse biotinylated CD8α antibody | Tonbo Biosciences | 30-0081-U500 | |
| anti-mouse biotinylated IgM antibody | BioLegend | 406503 | |
| anti-mouse biotinylated B220 antibody | Tonbo Biosciences | 30-0452-U500 | |
| anti-mouse biotinylated CD19 antibody | Tonbo Biosciences | 30-0193-U500 | |
| anti-mouse biotinylated MHCII (I-Ab) antibody | BioLegend | 115302 | |
| anti-mouse biotinylated CD11b antibody | Tonbo Biosciences | 30-0112-U500 | |
| anti-mouse biotinylated CD11c antibody | BioLegend | 117303 | |
| anti-mouse biotinylated CD44 antibody | BioLegend | 103003 | |
| anti-mouse biotinylated CD25 antibody | Tonbo Biosciences | 30-0251-U100 | |
| anti-mouse biotinylated DX5 antibody | BioLegend | 108903 | |
| streptavidin-coated magnetic microbeads | MACS Miltenyi Biotec | 130-048-101 | |
| Magnetic cell separator | MACS Miltenyi Biotec | 130-090-976 | QuadroMACS Separator |
| Separation columns | MACS Miltenyi Biotec | 130-042-401 | |
| PE anti-mouse CD4 antibody | BioLegend | 100408 | |
| APC anti-mouse CD3 antibody | BioLegend | 100235 | |
| FITC anti-mouse CD8 antibody | Tonbo Biosciences | 35-0081-U025 | |
| Cell Violet Tracer | Thermofisher | C34557 | |
| APC anti-mouse CD25 antibody | Tonbo Biosciences | 20-0251-U100 | |
| Alexa647 anti-mouse CD69 antibody | BioLegend | 104518 | |
| PerCPCY5.5 anti-mouse CD45.1 antibody | Tonbo Biosciences | 65-0453 | |
| APC anti-mouse CD45.1 antibody | Tonbo Biosciences | 20-0453 | |
| PECY7 anti-mouse CD45.1 antibody | Tonbo Biosciences | 60-0453 | |
| FITC anti-mouse CD45.2 antibody | Tonbo Biosciences | 35-0454 | |
| Ionomycin | SIGMA-ALDRICH | I0634 | |
| Phorbol 12 Myristate 13 Acetate (PMA) | SIGMA | P8139 | |
| Brefeldin A (BD GolgiPlug) | BD | 555029 | |
| Paraformaldehyde | Millipore | 8-18715-02100 | |
| Intracellular permeabilization buffer | eBioscience | 00-8333 | |
| APC anti-mouse IFNg antibody | Tonbo Biosciences | 20-7311-U100 | |
| Fc-block (anti-mouse CD16/CD32) | Tonbo Biosciences | 70-0161-U100 | |
| B6.SJL CD45.1 mice | The Jackson Laboratory | 002014 | |
| BD LSRFortessa™ Cell Analyzer | BD Biosciences | 649225 | |
| DAPI Solution | Thermofisher | 62248 |
References
- Zhu, J., Yamane, H., Paul, W. E. Differentiation of effector CD4 T cell populations (*). Annual Review of Immunology. 28, 445-489 (2010).
- Bustos-Moran, E., Blas-Rus, N., Martin-Cofreces, N. B., Sanchez-Madrid, F. Orchestrating Lymphocyte Polarity in Cognate Immune Cell-Cell Interactions. International Review of Cell and Molecular Biology. 327, 195-261 (2016).
- Gonzalez-Granado, J. M., et al. Nuclear envelope lamin-A couples actin dynamics with immunological synapse architecture and T cell activation. Science Signaling. 7 (322), ra37 (2014).
- Rocha-Perugini, V., Gonzalez-Granado, J. M. Nuclear envelope lamin-A as a coordinator of T cell activation. Nucleus. 5 (5), 396-401 (2014).
- Rocha-Perugini, V., et al. CD9 Regulates Major Histocompatibility Complex Class II Trafficking in Monocyte-Derived Dendritic Cells. Molecular and Cellular Biology. 37 (15), (2017).
- Kaech, S. M., Wherry, E. J., Ahmed, R. Effector and memory T-cell differentiation: implications for vaccine development. Nature Reviews Immunology. 2 (4), 251-262 (2002).
- Iborra, S., Gonzalez-Granado, J. M. In Vitro Differentiation of Naive CD4(+) T Cells: A Tool for Understanding the Development of Atherosclerosis. Methods in Molecular Biology. 1339, 177-189 (2015).
- Toribio-Fernandez, R., et al. Lamin A/C augments Th1 differentiation and response against vaccinia virus and Leishmania major. Cell Death & Disease. 9 (1), 9 (2018).
- Lee, T., Shevchenko, I., Sprouse, M. L., Bettini, M., Bettini, M. L. Retroviral Transduction of Bone Marrow Progenitor Cells to Generate T-cell Receptor Retrogenic Mice. Journal of Visualized Experiments. (113), (2016).
- Cruz-Adalia, A., et al. Conventional CD4(+) T cells present bacterial antigens to induce cytotoxic and memory CD8(+) T cell responses. Nature Communications. 8 (1), 1591 (2017).
- Quah, B. J., Wijesundara, D. K., Ranasinghe, C., Parish, C. R. The use of fluorescent target arrays for assessment of T cell responses in vivo. Journal of Visualized Experiments. (88), e51627 (2014).
- Cruz-Adalia, A., Ramirez-Santiago, G., Torres-Torresano, M., Garcia-Ferreras, R., Veiga Chacon, E. T Cells Capture Bacteria by Transinfection from Dendritic Cells. Journal of Visualized Experiments. (107), e52976 (2016).
- Cossarizza, A., et al. Guidelines for the use of flow cytometry and cell sorting in immunological studies. European Journal of Immunology. 47 (10), 1584-1797 (2017).
- Quah, B. J., Parish, C. R. New and improved methods for measuring lymphocyte proliferation in vitro and in vivo using CFSE-like fluorescent dyes. Journal of Immunological Methods. 379 (1-2), 1-14 (2012).
- Yardeni, T., Eckhaus, M., Morris, H. D., Huizing, M., Hoogstraten-Miller, S.
- Warth, S. C., Heissmeyer, V. Adenoviral transduction of naive CD4 T cells to study Treg differentiation. Journal of Visualized Experiments. (78), (2013).
- Liou, H. L., Myers, J. T., Barkauskas, D. S., Huang, A. Y. Intravital imaging of the mouse popliteal lymph node. Journal of Visualized Experiments. (60), (2012).
