Summary
Här presenterar vi ett protokoll för i vivo bestämning av naiva CD4 T cell (T cell) aktivering och spridning Th1 differentiering induceras av GM-CSF benmärg (BM)-härledda dendritiska celler (DCs). Dessutom beskriver det här protokollet BM och T-cell isolering, DC generation och DC och T-cell överföring.
Abstract
Kvantifiering av naiva CD4 T cellaktivering, proliferation och differentiering till T helper 1 (Th1) celler är ett användbart sätt att bedöma den roll som T-celler i ett immunsvar. Det här protokollet beskriver i vitro differentiering av benmärgen (BM) föräldraparets att erhålla granulocyt-makrofag granulocytkolonistimulerande faktor (GM-CSF) härrör-dendritiska celler (DCs). Protokollet beskrivs också överföringen av äggalbumin peptid (OVAp)-laddade GM-CSF-härledda DCs och naiv CD4 T-celler från OTII transgena möss för att analysera den i vivo aktivering och spridning Th1 differentiering av den överförda CD4 T-celler. Detta protokoll kringgår begränsning av rent i vivo metoder som införts av oförmågan att specifikt manipulera eller Välj studerade cell befolkningen. Detta protokoll tillåter dessutom studier i en in-vivo -miljö, därmed undvika förändringar till funktionella faktorer som kan uppstå i vitro och med påverkan av celltyper och andra faktorer som bara finns i intakta organ. Protokollet är ett användbart verktyg för att skapa förändringar i DCs och T celler som ändra adaptiva immunsvar, potentiellt ge viktiga resultat för att förstå ursprunget eller utvecklingen av många associerade sjukdomar.
Introduction
CD4 T-celler och antigenpresenterande celler (APC) såsom DCs är krävs medlare av immunitet mot mikrobiella patogener1,2. I perifera lymfoida organ aktiveras CD4 T-celler vid erkännande av specifika antigener presenteras av trupptransportfordon3,4,5. Aktiverade CD4 T-celler föröka sig och differentiera i olika specifika effektor Th-celler som är nödvändiga för utvecklingen av en rätt adaptiva immunsvaret6,7. Kontroll av dessa processer är kritiska för att producera en tillräcklig adaptive defense som dödar patogen utan att producera skadliga vävnad skada8. Th-celler definieras enligt uttryck eller produktion av ytan molekyler, transkriptionsfaktorer och effektor cytokiner och utföra grundläggande och precisa svar på patogener1. Cellerna av delmängden Th1 cellen uttrycka transkriptionsfaktor T-bet och de cytokiner interferon γ (IFNγ) och delta i värd försvar mot intracellulära patogener1. Kvantifiering av naiva CD4 T cellaktivering och spridning Th1 differentiering är ett användbart sätt att bedöma T celler rollspelet i ett immunsvar.
Detta protokoll möjliggör i vivo analys av in vitro -kapacitet genereras BM-derived DCs att modulera den aktivering och spridning Th1 differentiering av naiva CD4 T-celler. Protokollet tjänar också till att utvärdera kapaciteten hos naiva CD4 T-celler till vara aktiverat, inducerad föröka och Th1 differentierade (figur 1). Detta mångsidiga protokoll kringgår oförmågan att specifikt manipulera eller Välj studerade cell befolkningen i rent i vivo protokoll. Effekterna av olika molekyler och behandlingar på DCs kan studeras med BM från genetiskt modifierade möss5 eller genom att behandla eller att genetiskt manipulera isolerad BM celler9. Likaså kan T cell Svaren utforskas genom att erhålla T-celler för överföring från olika källor eller efter flera manipulationer3,8,10.
De främsta fördelarna med detta protokoll är tvåfaldigt. T-cellaktivering och spridning Th1 differentiering analyseras med ett flöde flödescytometri tillvägagångssätt. och detta kombineras med in-vivo studier, därmed avvärja förändringar som kan uppstå i vitro och inklusive celltyper och andra faktorer som endast finns i intakta organ11.
Användning av vitala färgämnen är en allmänt använd teknik att spåra cell spridning samtidigt som man undviker användningen av radioaktivitet. Mätning av spridning med dessa reagenser är baserad på dye utspädning efter celldelning. Dessutom dessa färgämnen kan upptäckas vid flera våglängder och analyseras enkelt av flödescytometri i kombination med flera fluorescerande antikroppar eller markörer. Vi belysa nyttan av detta protokoll genom att visa hur T cellaktivering och spridning Th1 differentiering kan analyseras med flödescytometri.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Experimentella rutiner godkändes av Fundación Centro Nacional de Investigaciones Cardiovasculares Carlos III (CNIC) och Comunidad Autónoma de Madrid enligt spanska och Europeiska riktlinjer. Möss var uppvuxna i specifik patogen fri (SPF) villkor och var euthanized av koldioxid (CO2) inandning.
1. isolering av mus benmärgsceller från skenbenet och lårbenet
Obs: C57BL/6 congenic mus stammen bär differentiell leukocyt markören Ptprcen, allmänt erkänd som CD45.1 eller Ly5.1, medan vildtyp C57BL stammar bär Ptprcb -allelen, känd som CD45.2 eller Ly5.2. CD45.1 och CD45.2 varianter kan särskiljas genom flödescytometri med hjälp av antikroppar. CD45.1, CD45.2 och CD45.1/CD45.2 möss kan användas som cellen källor eller som mottagare för överföring, medger spårning av de distinkta cellpopulationer av flödescytometri. Företrädesvis använda ålder- och sex-matchade manliga eller kvinnliga möss under 12 veckors ålder.
-
Beredning av lårbenet och förbenade
- Euthanize möss med hjälp av protokollet som godkänts av utskottet för institutionella djurvård.
- Desinficera bakbenen genom sprutning djur yta med 70% etanol.
- Använd steril sax, pincett och skalpeller. Med en skalpell, göra ett snitt i huden och ta bort skinnet från den distala delen av musen inklusive huden som täcker bakre extremiteter. Dra huden runt nedre vadmuskeln och ta bort huden från benen helt (figur 2A, 2B).
- Separat i quadriceps-muskeln från lårbenet med en skalpell. Talseuropéer höftleden utan att bryta lårbenet huvudet. Ta bort musklerna från skenbenet med en skalpell (figur 2 c, 2D). Separata lårbenet från skenbenet utan att bryta benändarna.
- Håll benen i en petriskål som innehåller 10% fetalt bovint serum (FBS) och 1% penicillin/streptomycin i iskall 1 x Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 medium.
-
Cell isolering
Obs: Alla efterföljande steg måste utföras under en kultur huva och med sterilt material att undvika kontaminering.- I en steril petriskål, noggrant skära av proximala och distala ändarna på varje ben med en skalpell.
- Spola benen upprepade gånger med en total volym på 10 mL varm komplett RPMI-medium (RPMI + 10% FBS, 2 mM EDTA, 1% penicillin/streptomycin, 20 mM HEPES, 55 µM 2-merkaptoetanol, 1 mM natrium pyruvat och 2 mM L-glutamin). Spola benen från båda ändarna med en 25 G injektionsnål till en 1 mL spruta.
- Överföra effluate till en 50 mL konisk tub försedd med 70 µm nylon spindelväv filter. Noggrant få bort skräp och cell konglomerat av skonsam omrörning och pipettering.
- Centrifugera cellsuspension på 250 x g under 10 minuter vid rumstemperatur (RT).
- Återsuspendera cellpelleten i 1 mL lyseringsbuffert kall röd-blodkroppar (0,15 M NH4Cl + 1 mM KHCO3 + 0,1 mM EDTA, justerat pH till 7,2 med 1 N HCl, 0,4 µm sterila filtreras och lagras vid 4 ° C). Upprätthålla på is för 5 min med manuell skakning.
- Tillsätt 10 mL kall buffert (1 x fosfatbuffrad saltlösning (PBS) + 2 mM EDTA + 2% bovint serumalbumin (BSA)) för att inaktivera och tvätta ur den röda-blodkroppar lyseringsbuffert.
- Centrifugera cellsuspension på 250 x g under 5 minuter vid 4 ° C.
- Tvätta cellerna med 25 mL av komplett RPMI medium och centrifugera vid 250 x g under 5 minuter vid 4 ° C.
- Att resuspendera cellerna i 5 mL av komplett RPMI medium. Blanda 50 µL cellsuspension 1:1 med trypan blå. Bestämma antalet cell i en räknande kammare under ett mikroskop. Beräkna antalet cellen med formeln: celler/mL = [(icke-färgade cell count/4) x 2 x 10.000]12.
Obs: Denna metod avkastning 40 x 106 till 60 x 106 ben märg celler per oinfekterade 8 till 12 veckor gamla C57BL/6 mus. - Centrifugera cellsuspension på 250 x g under 5 minuter vid 4 ° C.
2. DC differentiering, mognad och Antigen lastning
-
BM cellen skörd
- Frö den kompletta kulturen på 6-väl ultra-låg-attachment planskivor på 106 celler per mL medium, vanligtvis i 5 mL per brunn. Differentierade makrofager fäster vid kultur-plattorna. Efter 12 h, överför supernatanten, som huvudsakligen innehåller monocyter, för att rengöra 6-bra plattor, kasta gamla 6-väl plattorna med vidhäftat makrofager.
- För att främja celldifferentiering, kultur icke-anhängare cellerna på 5 x 105 celler per mL i vanligtvis 5 mL per brunn av komplett RPMI medium innehållande 20 ng/mL kommersiellt erhålls rekombinant murin GM-CSF vid 37 ° C och 5% koldioxid (CO2) och iaktta dagligen.
- Varje 3 dagar, snurra ner suspenderade celler och samla vidhäftande cellerna med 5 mM EDTA i PBS och snurra ner. Kombinera och resuspendera på 5 x 105 celler/mL i färskt medium innehållande 20 ng/mL rm-GM-CSF.
- Dag 8, samla anhängare och fristående celler som ovan och resuspendera på 5 x 105 celler/mL i medium innehållande 20 ng/mL GM-CSF och 20 ng/mL lipopolysackarid (LPS) för 24 h i en icke-vävnadsodling-behandlade steril petriskål, att framkalla hög MHC-II , CD80 och CD86 uttryck.
- Kontrollera DC differentiering av flödescytometri som anges i steg 2.2.
-
Flöde flödescytometri differentiering och mognad analys.
- Centrifugera cellsuspension på 250 x g under 5 minuter vid 4 ° C. Upprepa detta steg två gånger.
- Blockera Fc receptorer av ruvning återsuspenderade cellpelleten mus Fc-receptor blockerare (renat anti mus CD16/CD32 IgG2b antikropp) under 15 minuter vid 4 ° C enligt tillverkarens anvisningar.
- Centrifugera cellsuspension på 250 x g under 5 minuter vid 4 ° C.
- För varje sond, Omsuspendera 250.000 celler i 300 µL flöde flödescytometri buffert (1 x PBS + 2 mM EDTA + 2% BSA) vid 4 ° C.
- Överföra 30 µL av cell lösning per brunn till en 96-brunn-platta.
- Centrifugera cellsuspension på 250 x g under 5 minuter vid 4 ° C.
- Avlägsna supernatanten och tillsätt 30 µL av antikropp-innehållande buffert till varje väl efter tillverkarens beteckningar. Inkubera cellerna med antikroppar i 20 min vid 4 ° C.
Obs: Används vanligt markörer för DCs, monocyter och makrofager är CD11b, CD64, CD115, CD11c, MHCII, CD80 och CD86 (figur 3). - Centrifugera proverna vid 250 x g i 5 minuter vid 4 ° C och slamma på nytt upp i 200 µL per brunn av kall flöde flödescytometri buffert som innehåller en markör för att utesluta döda celler (t.ex. propidium jodid, 4, 6-diamidin-2-fenylindol (DAPI) eller en amine-reaktivt färgämne ) på tillverkarens rekommenderade koncentrationen13.
- Övervaka celldifferentiering genom överföring av proverna till flöde flödescytometri rör och utföra flödescytometri Flödesanalys exklusive döda celler på dag 0, 3, 6 och 9.
-
DC-Antigen lastning.
- Dag 8, Centrifugera proverna vid 250 x g i 5 minuter vid 4 ° C och resuspendera pellets i 200 µL medium (RPMI + 10% FBS utan antibiotika). Upprepa detta steg två gånger.
- Inkubera DCs med 10 µg/mL OVAp (323-339; ISQAVHAAHAEINEAGR) per 1 x 107 DCs i 1 mL av medium (RMPI + 1% FBS) i ett plaströr i minst 30 minuter vid 37 ° C. Använd icke OVAp-loaded DCs som negativ kontroll villkor.
- Centrifugera proverna vid 250 x g i 5 minuter vid 4 ° C och resuspendera pellets i 200 µL komplett RPMI medium. Upprepa detta steg två gånger.
- Centrifugera proverna vid 250 x g i 5 minuter vid 4 ° C och resuspendera pellets i 200 µL medium (RPMI + 10% FBS) på 2 x 106 celler/mL.
3. isolering av naiva CD4 T-celler från OTII möss
Obs: Denna metod ger cirka 100 x 106 spleenocytes per oinfekterade 8 till 12 veckor gamla C57BL/6 mus. Både hanar och honor kan användas. CD4 T-celler kan isoleras från mjälte eller lymfkörtlar; CD4 T-celler står för cirka 25% och 50% av cellerna i dessa organ, respektive. Utför följande steg i sterila förhållanden.
- Isolera inguinal, axillär, brachialis, livmoderhalscancer och mesenteriala lymfkörtlar och mjälte från OTII transgena möss (figur 4) och överföra dem till en plast petriskål innehållande 10 mL komplett RPMI medium.
- Skölj cellen silen med 2 mL av komplett RPMI medium och ta bort den från de 50 mL tub. Överföring lymfkörtlar och mjälte till en 70 µm cell SIL placeras i en 50 mL tub. Homogenisera med en sprutkolven (figur 5) och Lägg till medium upp till 15 mL.
- Centrifugera proverna vid 250 x g i 5 minuter vid 4 ° C och återsuspendera pelleten i 15 mL komplett RPMI medium. Upprepa detta steg två gånger.
- För mjälte cellsuspension, Omsuspendera cellpelleten och lysera röda blodkroppar som anges i steg 1.2.5.
- Centrifugera cellsuspension på 250 x g under 5 minuter vid 4 ° C.
- Tvätta cellerna med 25 mL av komplett RPMI medium och centrifugera vid 250 x g under 5 minuter på RT.
- Att resuspendera cellerna i 5 mL medium. Blanda 50 µL cellsuspension 1:1 med Trypan blå. Bestämma antalet cell använder en räknande kammare under ett mikroskop. Beräkna antalet cellen med formeln: celler/mL = [(icke-färgade cell count/4) x 2 x 10.000]12.
- Upprepa steg 2.2.2.
- Efter tillverkarens instruktioner, inkubera cellerna med 1:800 utspädningar av biotinylerade antikroppar mot CD8α, IgM, B220, CD19, MHCII (I-Ab), CD11b, CD11c, CD44, CD25 och DX5 i 30 min på is för senare negativa urval av CD4 T-celler.
- Efter tillverkarens instruktioner och utifrån antalet celler och kapaciteten av pärlor, beräkna den erforderliga mängden av streptividin-belagda magnetiska mikrokulor och isolera CD4 T-celler med hjälp av en magnetisk cell avgränsare och lämplig Separationskolonner.
- Att resuspendera cellerna i 5 mL komplett RPMI medium och hålla dem på is medan räknar levande celler som beskrivs i steg 3,7.
- Extrahera 2 x 105 celler och kontrollera renheten av de insamlade celler som använder anti CD3, CD4 och CD8, B220 fluorescerande antikroppar i en flödescytometer användning tillverkaren-rekommendera antikropp utspädningar.
- För att färga isolerade naiva CD4/OTII T-celler, resuspendera 106 celler i 500 µL buffert (1 x PBS + 2 mM EDTA + 2% BSA). Förbereda 500 µL buffert (1 x 2% BSA, PBS + 2 mM EDTA) som innehåller dubbel vitala cell tracer dye slutliga tillverkaren-Rekommenderad koncentration. Blanda båda lösningarna genom att cellsuspensionen cell tracer lösningen långsamt. Inkubera cellerna för 5 min vid 37 ° C.
- Tvätta cellerna med 5 mL av komplett RPMI medium och centrifugera vid 250 x g under 5 minuter vid 4 ° C. Upprepa detta steg två gånger. Att resuspendera cellerna i 1 mL av komplett RPMI medium på 1 x 107celler/mL.
4. in Vivo aktivering, spridning och Th1 differentiering Assay
Obs: Viktig cell tracer dye carboxyfluorescein diacetat succinimidyl ester (CFSE) och andra succinimidyl esterbaserade färgämnen, som är entusiastiska och avger fluorescens vid olika våglängder, ofta används för att bedöma lymfocyter spridning av flöde flödescytometri på grund av deras höga fluorescensintensiteten, lång livslängd, låg variabilitet och låg toxicitet14.
- Adoptively överföra intravenöst (i.v.) 1 x 106 levande vitala cell tracer dye-färgade naiva CD4/OTII T-celler i 100 µL av PBS per mus. Märkt T-celler kan överföras adoptively av svans ven eller retro-orbital injektion15; i båda fallen kommer cellerna hem till lymfoida organ (figur 6A).
- Utmana de mottagande möss en dag senare genom adoptively överföra 100.000 LPS-mognat OVAp-loaded DCs subkutant (s.i.) i trampdynorna (figur 6B).
- Skörda Poplietallymfknutor lymfkörtlar från mottagarens möss och bearbeta dem tills obtainmenten av enda cellsuspensioner följa samma steg som tidigare beskrivs i 3.1 och 3.2. Gör detta på dag 2 efter immunisering att mäta CD4/OTII T cellaktivering och på dag 5 att mäta spridning plus Th1 differentiering.
- För att analysera T cellaktivering på dag 2, färga celler med fluorescerande antikroppar mot CD4, CD69 och CD25 (alternativt CD45.1 och CD45.2) och bestämma procentandelen av C69+CD25+ T celler i CD4 befolkningen. Analysera med flödescytometri (figur 7).
- För att kontrollera T cell spridning på dag 5, färga celler med hjälp av lämpliga fluorescerande antikroppar mot CD4 och eventuellt CD45.1 och CD45.2. Analysera förfalla av vitala cell tracer dye signalen i CD4 befolkningen genom flödescytometri (figur 8). Flera parametrar kan bestämmas i dessa studier, till exempel antalet celldelningar som genomgått av celler märkta med vitala cell tracer färgämnet, andelen delande celler i varje fluorescens topp och andelen delande celler i cellen Summa befolkningen.
- Att bestämma Th1 differentiering på dag 5, platta 400 000 celler per väl av en plattan med 96 brunnar i 200 µL komplett RPMI medium innehållande 1 µM ionomycin och 10 ng/mL phorbol 12 isopropylmyristat 13 acetat (PMA) under 6 timmar vid 37 ° C i inkubatorn. För senaste 4 h, lägga till 3 – 10 µg/mL brefeldin A till blockera cytokin sekretion till medium.
- Centrifugera plattorna för 5 min på 250 x g vid 4 ° C. Kassera supernatanten genom snabba inversion av plattan med 96 brunnar.
- Upprepa steg 2.2.2.
- Fläcken cellmembran genom inkubation under 15 minuter vid 4 ° C i 30 µL buffert (1 x PBS + 2 mM EDTA + 2% BSA) innehållande antikroppar till CD4 och eventuellt till CD45.1 och CD45.2 på tillverkaren rekommenderade utspädningar. Tvätta cellerna genom att lägga till 150 µL buffert (1 x PBS + 2 mM EDTA + 2% BSA) och centrifugera plattorna för 5 min på 250 x g vid 4 ° C och Kassera supernatanten.
- Fixa cellerna genom att lägga till 100 µL av 2% paraformaldehyde/1% sackaros i 20 min på RT. centrifug plattorna för 5 min vid 1 000 x g och 4 ° C. Kassera supernatanten.
- Permeabilize cellerna genom att lägga till 50 µL av intracellulära permeabilisering buffert (1 x PBS + 0,1% BSA, 0,01 M HEPES, 0,3% saponin) och inkubera i 30 minuter vid 4 ° C.
- Tillsätt 150 µL av PBS och Centrifugera under 5 minuter vid 1 000 x g vid RT. Kassera supernatanten.
- Fläcken intracellulära cytokiner genom att lägga till 30 µL av fluorophore-konjugerad anti IFNγ antikropp i buffert (PBS + 0,1% saponin) och inkubera i 30 min på RT.
- Tvätta cellerna genom att lägga till 150 µL buffert (PBS + 0,1% saponin). Centrifugera plattorna för 5 min vid 1 000 x g vid RT och kasta bort supernatanten. Upprepa detta steg två gånger.
- Analysera cellpopulationer med flödescytometri (figur 8).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Figur 1 illustrerar stegen som beskrivs i detta protokoll. Figur 2 illustrerar isolering och kultur av mus BM celler. Tillägg av GM-CSF och LPS till dessa kulturer tillåter den in vitro- generationen och mognaden av DCs. figur 3 illustrerar flödet flödescytometri analys av differentiering och mognad av de erhållna DCs. OVAp-loaded GM-CSF BM-derived DCs och isolerade vitala cell trace dye-färgade CD4/OTII T celler överförs adoptively till möss. Figur 4 visar placeringen av de lymfkörtlar som används för isolering av CD4/OTII T-celler. Figur 5 visar en 50 mL tub försedd med filtret nylon 70 µm och en sprutkolven som används för att homogenisera de lymfkörtlar och mjälte. Figur 6 visar i.v. injektion av CD4/OTII T-cellerna i den retro-orbital plexus och s.c. injektion av OVAp-loaded GM-CSF BM-derived DCs in footpad. CD4/OTII T celler distribuera till de olika lymfoida organ, medan GM-CSF DCs migrera till Poplietallymfknutor lymfkörtlarna där GM-CSF DCs aktivera naiva CD4/OTII T-celler genom presentationen av OVAp. Naiva CD4/OTII T celler då föröka sig och differentiera mot Th1 fenotypen. Figur 7 illustrerar kvantifiering av naiva CD4/OTII T cellaktivering från analysen av membran CD69 och CD25 uttryck. Figur 8 visar kvantifiering av CD4/OTII T cell spridning. Figur 9 visar kvantifiering av CD4/OTII T celldifferentiering mot Th1 fenotypen.
Figur 1: protokoll systemet. (1) isolera BM celler från mus lårbenet och skenbenet. (2) kultur BM celler med GM-CSF att generera GM-CSF BM-DCs. 3) kontrollera DC differentiering och mogen GM-CSF BM härrör-DCs med LPS. (4) kontrollera DC mognad. 5) load DCs med OVAp. (6) isolera CD4/OTII T-celler bildar mus mjälte. (7) fläcken CD4/OTII T-celler med vitala cell tracer färgämne. (8) kontrollera isolering renhet och vitala cell tracer färgämnet färgning av isolerade CD4/OTII T-celler. 9) adoptively överför isolerade CD4/OTII T celler i.v. till mottagarens möss. 10). adoptively överföra OVAp-laddad och mognade DCs s.c. till mottagarens möss. 11) kontrollera CD4/OTII T cellaktivering. 12) kontrollera CD4/OTII T cellproliferation och differentiering. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2: benmärg isolering processen från mus lårbenet och förbenade. (A) huden snitt med sax. (B) avlägsnande av hud från extremiteten. (C) muskel snitt med sax. (D) avlägsnande av muskler från extremiteten med en skalpell. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3: Flow flödescytometri analys av mognaden av GM-CSF BM-derived DCs. Ytan uttryck för MHCII, CD80 och CD86 i LPS aktiveras (+ LPS) och icke-aktiverade (-LPS) GM-CSF BM-derived DCs. siffrorna visar genomsnittlig fluorescensintensiteten i godtyckliga enheter (a.u.). Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 4: placering av inguinal, axillär, brachialis, livmoderhalscancer och mesenteriala lymfkörtlar och mjälte i möss. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 5: Experimental inrättats för lymfknutor och mjälte homogenisering. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 6: överföring av CD4/OTII T-celler och OVAp-loaded GM-CSF BM-härrör-DCs. (A) intravenös injektion av CD4/OTII T-celler i den retro-orbital plexus. (B) subkutan injektion av OVAp-loaded GM-CSF BM-derived DCs i footpad. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 7: kvantifiering av T-cells aktivering i vivo. Flöde flödescytometri tomter och diagram som visar analysen och kvantifiering av membran uttryck för CD69 i CD4 T-celler. CD45.1/CD45.2 möss var adoptively överförda i.v. med mus CD45.1/CD4/OTII och CD45.1/CD4/OTII celler 24 h innan s.c. adoptiv överföringen av OVAp-loaded GM-CSF BM-härrör-DCs. T cellaktivering mättes på 2 dagar post-DC överföring av flödescytometri efter färgning med lysrör-taggade antikroppar mot angivna antigen. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 8: kvantifiering av T-cell spridning i vivo. Flöde flödescytometri tomter och grafer visar analysen och kvantifiering av nedgång vitala cell tracer färgämnet färgning i prolifererande CD4 T-celler. CD45.2 möss var adoptively överförda i.v. med musen CD45.1/CD4/OTII celler 24 h innan s.c. adoptiv överföringen av OVAp-loaded GM-CSF BM-härrör-DCs. T cell spridning mättes på 5 dagar post-DC överföring av flödescytometri efter färgning med den anges fluorescerande antikroppar. T cell spridning kan bestämmas genom mätning av andelen prolifererande celler, andelen celler i varje division topp, eller genom att räkna antalet avdelningen toppar som visas i diagrammen. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 9: kvantifiering av T-celldifferentiering mot Th1 fenotyp i vivo. Flöde flödescytometri tomter och grafer visar analysen och kvantifiering av procentandelen av IFNγ-uttrycker CD4 T-celler. CD45.2 möss var adoptively överförda i.v. med musen CD45.1/CD4/OTII celler 24 h innan s.c. adoptiv överföringen av OVAp-loaded GM-CSF BM-härrör-DCs. T celldifferentiering mättes på dagar post-DC överföring av flödescytometri efter färgning med den anges fluorescerande antikroppar. T-celldifferentiering mot Th1 fenotypen fastställdes som IFNγ-uttryckande celler som en procentandel av totala antalet CD4 T-celler och från bara de prolifererande CD4 T-cellerna. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Detta protokoll tillåter för karakterisering av BM-derived DCs förmåga att modulera den aktivering, proliferation och differentiering av naiva CD4 T-celler. Dessutom kan det också användas för att bedöma känsligheten av CD4 T-celler för modulering av BM-derived DCs. Med detta protokoll, kan förändringar i dessa händelser vara mätt i vivo.
Beroende på hypotesen under utredning, kan flera kombinationer av T-celler och DCs användas. Exempelvis kan man analysera konsekvenserna av knackar i eller slå ut specifika gener eller effektiviteten av en viss stimulans av CD4 T cellaktivering eller spridning Th1 differentiering. Dessa förfaranden kan utföras på DCs eller CD4 T celler eller på båda celltyper. CD4 T-celler från vildtyp eller genetiskt modifierade möss kan alltså kombineras med DCs härrör från vildtyp möss och vice versa.
Detta protokoll kan anpassas att skilja de olika cellpopulationer ursprung med hjälp av flödescytometri och antikroppar mot CD45.1 och CD45.2. CD45.1/CD45.1 och CD45.2/CD45.2 möss kan faktiskt användas som källa för någon av de celltyper som används eller som mottagare för överföring i valfri kombination. Exempelvis kan CD4 T-celler erhållas från CD45.1/CD45.1/OTII möss medan CD45.2/CD45.2 möss kan vara ursprunget till BM för DC generation. I detta experiment, kan båda celltyper adoptively överföras till CD45.1/CD45.2 möss. Dessutom CD4/OTII T-celler från CD45.1/CD45.1 typ en möss och CD45.2/CD45.2 typ två möss kan kombineras i samma eller olika CD45.1/CD45.2 typ tre mottagarna att jämföra funktionen för typ en och Skriv två CD4 T cellpopulationer i konkurrerande och icke-konkurrerande villkorar, respektive.
Denna metod beskriver generationen av GM-CSF BM-derived DCs. Alternativa protokoll är dock tillgängliga för DC mognad och differentiering; papain kan exempelvis användas istället för LPS eller fms-relaterade tyrosin Kinas 3 ligand (Flt3-L) i stället för GM-CSF, möjliggör studie av fenotypiskt distinkta DCs förmåga att aktivera CD4 T cell adaptiv immunitet. Med samma avsikt, DCs för antigen lastning och presentationen kan vara direkt isolerad från möss. Kombinationen av detta protokoll med andra9 tillåter manipulering av naiva CD4/OTII T-celler av virusinfektion16 innan deras överföring till mottagarens möss. BM kan vara också sensorik med retrovirus9 att studera effekten av kontrollerade cell ändringar på DCs före deras användning i protokollet.
Dessutom kan detta protokoll anpassas för intravital mikroskopi studier17 med hjälp av fluorescerande protein-uttryckande celler. Exempelvis kan CD4/OTII möss korsas med GFP - eller cherry-uttryckande möss att få GFP eller Cherry/OTII CD4 möss. Dessa möss kan sedan användas som en källa av CD4 T-celler och kan kombineras med BM-derived DCs från cherry - eller GFP-uttryckande möss, som krävs, i vivo experiment.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har ingenting att avslöja
Acknowledgments
Vi tackar Dr. Simon Bartlett för engelska redigering. Denna studie stöddes av bidrag från Instituto de Salud Carlos III (ISCIII) (PI14/00526; PI17/01395; CP11/00145; CPII16/00022), Miguel Servet programmet och Fundación Ramón Areces; med medfinansiering från Fondo Europeo de Desarrollo regionala (FEDER). CNIC stöds av ministeriet för ekonomi, industri och konkurrenskraft (MEIC) och stiftelsen CNIC Pro och är en Severo Ochoa Center of Excellence (SEV-2015-0505). RTF är grundat av Fundación Ramón Areces och CNIC, VZG av ISCIII, BHF av Instituto de Investigación Sanitaria Hospital 12 de Octubre (imas12) och JMG-G av ISCIII Miguel Servet Program och imas12.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Ethanol | VWR Chemicals | 20,824,365 | 5 L |
| Scissors | Fine Science Tools (F.S.T.) | 14001-12 | |
| Forceps | Fine Science Tools (F.S.T.) | 11000-13 | |
| Fine Forceps | Fine Science Tools (F.S.T.) | 11253-20 | |
| Scalpel | Fine Science Tools (F.S.T.) | 10020-00 | Box of 100 blades |
| Fetal Bovine Serum | SIGMA | F7524 | |
| Penicillin/streptomycin | LONZA | DE17-602E | |
| Roswell Park Memorial Institute medium (RPMI) | GIBCO | 21875-034 | |
| Sterile Petri dishes | Falcon | 353003 | |
| 25-gauge needle | BD Microlance 3 | 300600 | |
| 1 ml syringe | Novico | N15663 | |
| 15 ml conical tubes | Falcon | 352096 | |
| 50 ml conical tubes | Falcon | 352098 | |
| 70 μm nylon web filter | BD Falcon | 352350 | |
| Red blood lysis buffer | SIGMA | R7757 | 100 Ml |
| EDTA | SIGMA | ED2SS-250 | |
| Bovine Serum Albumin | SIGMA | A7906 | 100 g |
| Trypan blue | SIGMA | 302643-25G | |
| Culture-plates | Falcon | 353003 | |
| 4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid (HEPES) | Cambrex | BE17-737E | |
| Beta-mercaptoethanol | Merck | 8-05740-0250 | |
| Sodium pyruvate | LONZA | BE13-115E | |
| L-glutamine | LONZA | BE17-605E | |
| Recombinant murine Granulocyte Macrophage colony-stimulating factor (GM-CSF) | Prepotech | 315-03 | |
| lipopolysaccharide (LPS) | SIGMA-ALDRICH | L2018 | |
| 96-well-plate | Costar | 3799 | |
| v450 anti-mouse CD11b antibody | BD Biosciences | 560455 | |
| PE anti-mouse CD64 antibody | BioLegend | 139303 | |
| PE anti-mouse CD115 antibody | BioLegend | 135505 | |
| FITC anti-mouse CD11c antibody | BioLegend | 117305 | |
| FITC anti-mouse MHCII antibody | BioLegend | 125507 | |
| APC anti-mouse CD86 antibody | BioLegend | 105011 | |
| APC anti-mouse CD80 antibody | BioLegend | 104713 | |
| Flow Cytometry tubes | Zelian | 300800-1 | PS 12X75 5mL |
| OTII Ovoalbumine peptide | InvivoGen | 323-339 | |
| anti-mouse biotinylated CD8α antibody | Tonbo Biosciences | 30-0081-U500 | |
| anti-mouse biotinylated IgM antibody | BioLegend | 406503 | |
| anti-mouse biotinylated B220 antibody | Tonbo Biosciences | 30-0452-U500 | |
| anti-mouse biotinylated CD19 antibody | Tonbo Biosciences | 30-0193-U500 | |
| anti-mouse biotinylated MHCII (I-Ab) antibody | BioLegend | 115302 | |
| anti-mouse biotinylated CD11b antibody | Tonbo Biosciences | 30-0112-U500 | |
| anti-mouse biotinylated CD11c antibody | BioLegend | 117303 | |
| anti-mouse biotinylated CD44 antibody | BioLegend | 103003 | |
| anti-mouse biotinylated CD25 antibody | Tonbo Biosciences | 30-0251-U100 | |
| anti-mouse biotinylated DX5 antibody | BioLegend | 108903 | |
| streptavidin-coated magnetic microbeads | MACS Miltenyi Biotec | 130-048-101 | |
| Magnetic cell separator | MACS Miltenyi Biotec | 130-090-976 | QuadroMACS Separator |
| Separation columns | MACS Miltenyi Biotec | 130-042-401 | |
| PE anti-mouse CD4 antibody | BioLegend | 100408 | |
| APC anti-mouse CD3 antibody | BioLegend | 100235 | |
| FITC anti-mouse CD8 antibody | Tonbo Biosciences | 35-0081-U025 | |
| Cell Violet Tracer | Thermofisher | C34557 | |
| APC anti-mouse CD25 antibody | Tonbo Biosciences | 20-0251-U100 | |
| Alexa647 anti-mouse CD69 antibody | BioLegend | 104518 | |
| PerCPCY5.5 anti-mouse CD45.1 antibody | Tonbo Biosciences | 65-0453 | |
| APC anti-mouse CD45.1 antibody | Tonbo Biosciences | 20-0453 | |
| PECY7 anti-mouse CD45.1 antibody | Tonbo Biosciences | 60-0453 | |
| FITC anti-mouse CD45.2 antibody | Tonbo Biosciences | 35-0454 | |
| Ionomycin | SIGMA-ALDRICH | I0634 | |
| Phorbol 12 Myristate 13 Acetate (PMA) | SIGMA | P8139 | |
| Brefeldin A (BD GolgiPlug) | BD | 555029 | |
| Paraformaldehyde | Millipore | 8-18715-02100 | |
| Intracellular permeabilization buffer | eBioscience | 00-8333 | |
| APC anti-mouse IFNg antibody | Tonbo Biosciences | 20-7311-U100 | |
| Fc-block (anti-mouse CD16/CD32) | Tonbo Biosciences | 70-0161-U100 | |
| B6.SJL CD45.1 mice | The Jackson Laboratory | 002014 | |
| BD LSRFortessa™ Cell Analyzer | BD Biosciences | 649225 | |
| DAPI Solution | Thermofisher | 62248 |
References
- Zhu, J., Yamane, H., Paul, W. E. Differentiation of effector CD4 T cell populations (*). Annual Review of Immunology. 28, 445-489 (2010).
- Bustos-Moran, E., Blas-Rus, N., Martin-Cofreces, N. B., Sanchez-Madrid, F. Orchestrating Lymphocyte Polarity in Cognate Immune Cell-Cell Interactions. International Review of Cell and Molecular Biology. 327, 195-261 (2016).
- Gonzalez-Granado, J. M., et al. Nuclear envelope lamin-A couples actin dynamics with immunological synapse architecture and T cell activation. Science Signaling. 7 (322), ra37 (2014).
- Rocha-Perugini, V., Gonzalez-Granado, J. M. Nuclear envelope lamin-A as a coordinator of T cell activation. Nucleus. 5 (5), 396-401 (2014).
- Rocha-Perugini, V., et al. CD9 Regulates Major Histocompatibility Complex Class II Trafficking in Monocyte-Derived Dendritic Cells. Molecular and Cellular Biology. 37 (15), (2017).
- Kaech, S. M., Wherry, E. J., Ahmed, R. Effector and memory T-cell differentiation: implications for vaccine development. Nature Reviews Immunology. 2 (4), 251-262 (2002).
- Iborra, S., Gonzalez-Granado, J. M. In Vitro Differentiation of Naive CD4(+) T Cells: A Tool for Understanding the Development of Atherosclerosis. Methods in Molecular Biology. 1339, 177-189 (2015).
- Toribio-Fernandez, R., et al. Lamin A/C augments Th1 differentiation and response against vaccinia virus and Leishmania major. Cell Death & Disease. 9 (1), 9 (2018).
- Lee, T., Shevchenko, I., Sprouse, M. L., Bettini, M., Bettini, M. L. Retroviral Transduction of Bone Marrow Progenitor Cells to Generate T-cell Receptor Retrogenic Mice. Journal of Visualized Experiments. (113), (2016).
- Cruz-Adalia, A., et al. Conventional CD4(+) T cells present bacterial antigens to induce cytotoxic and memory CD8(+) T cell responses. Nature Communications. 8 (1), 1591 (2017).
- Quah, B. J., Wijesundara, D. K., Ranasinghe, C., Parish, C. R. The use of fluorescent target arrays for assessment of T cell responses in vivo. Journal of Visualized Experiments. (88), e51627 (2014).
- Cruz-Adalia, A., Ramirez-Santiago, G., Torres-Torresano, M., Garcia-Ferreras, R., Veiga Chacon, E. T Cells Capture Bacteria by Transinfection from Dendritic Cells. Journal of Visualized Experiments. (107), e52976 (2016).
- Cossarizza, A., et al. Guidelines for the use of flow cytometry and cell sorting in immunological studies. European Journal of Immunology. 47 (10), 1584-1797 (2017).
- Quah, B. J., Parish, C. R. New and improved methods for measuring lymphocyte proliferation in vitro and in vivo using CFSE-like fluorescent dyes. Journal of Immunological Methods. 379 (1-2), 1-14 (2012).
- Yardeni, T., Eckhaus, M., Morris, H. D., Huizing, M., Hoogstraten-Miller, S.
- Warth, S. C., Heissmeyer, V. Adenoviral transduction of naive CD4 T cells to study Treg differentiation. Journal of Visualized Experiments. (78), (2013).
- Liou, H. L., Myers, J. T., Barkauskas, D. S., Huang, A. Y. Intravital imaging of the mouse popliteal lymph node. Journal of Visualized Experiments. (60), (2012).
