Summary
Qui, presentiamo un protocollo per la determinazione in vivo dell'ingenuo T CD4 delle cellule (cellule T) attivazione, proliferazione e differenziazione Th1, indotta da GM-CSF midollo osseo (BM)-derivato le cellule dendritiche (DCs). Inoltre, questo protocollo descrive isolamento BM e T-cell, generazione di DC e DC e T-cell trasferimento adottivo.
Abstract
Quantificazione dell'attivazione di cellule T CD4 Naive, la proliferazione e la differenziazione di T helper 1 (Th1) cellule è un modo utile per valutare il ruolo svolto dalle cellule di T in una risposta immunitaria. Questo protocollo descrive la differenziazione in vitro di progenitori del midollo osseo (BM) per ottenere granulocita macrofago distimolazione factor (GM-CSF) derivato-cellule dendritiche (DCs). Il protocollo descrive anche il trasferimento adottivo del peptide di ovoalbumina (OVAp)-caricato di GM-CSF-derivati DCs e cellule T CD4 Naive da topi transgenici Paolo al fine di analizzare l'attivazione in vivo , la proliferazione e la differenziazione Th1 della trasferite le cellule T CD4. Questo protocollo elude la limitazione di puramente in vivo metodi imposti dalla incapacità di specificamente manipolare o selezionare la popolazione delle cellule studiate. Inoltre, questo protocollo permette studi in un ambiente in vivo , evitando così alterazioni di fattori funzionali che possono verificarsi in vitro e compreso l'influenza di tipi cellulari e di altri fattori trovati solo negli organi intatti. Il protocollo è uno strumento utile per la generazione di cambiamenti nel sistema DCs e cellule di T che modificare le risposte immunitarie, potenzialmente fornire risultati importanti per capire l'origine o lo sviluppo di numerose patologie immuni.
Introduction
Le cellule T CD4 + e cellule (APCs) come DCs presentanti l'antigene sono necessari mediatori di immunità agli agenti patogeni microbici1,2. Negli organi linfoidi periferici, le cellule T CD4 sono attivate al momento della rilevazione di antigeni specifici presentati da APC3,4,5. Linfociti T CD4 attivati proliferano e si differenziano in cellule effettrici specifiche distinte del Th che sono necessari per lo sviluppo di una corretta risposta immunitaria adattativa6,7. Controllo di questi processi è fondamentale per la produzione di un'adeguata difesa adattiva che uccide l'agente patogeno senza produrre tessuto nocivo danni8. Cellule del Th sono definite secondo l'espressione o la produzione di molecole di superficie, fattori di trascrizione e le citochine effettrici e svolgono funzioni essenziali e precisione in risposta ad agenti patogeni1. Cellule del sottoinsieme delle cellule Th1 esprimono il fattore di trascrizione T-scommessa e la citochina interferone γ (IFNγ) e partecipano nella difesa ospite contro patogeni intracellulari1. Quantificazione dell'attivazione di cellule T CD4 Naive, proliferazione e differenziazione Th1 è un strumento utile per valutare il ruolo T cellule nella risposta immunitaria.
Questa protocollo consente in vivo analisi della capacità di in vitro -generato DCs BM-derivato di modulare l'attivazione, proliferazione e differenziazione Th1 delle cellule T CD4 Naive. Il protocollo serve anche a valutare la capacità delle cellule T CD4 Naive per essere attivato, indotti a proliferare e Th1 differenziato (Figura 1). Questo protocollo versatile elude l'incapacità di specificamente manipolare o selezionare la popolazione delle cellule studiate in puramente in vivo protocolli. Gli effetti di diverse molecole e trattamenti su controller di dominio possono essere studiati utilizzando BM da topi geneticamente modificati5 o trattamento o manipolare geneticamente isolata BM cellule9. Allo stesso modo, le risposte delle cellule T possono essere esplorate di ottenimento delle cellule di T per trasferimento adottivo da fonti diverse o dopo diverse manipolazioni3,8,10.
I principali vantaggi di questo protocollo sono duplici. L'attivazione delle cellule t, la proliferazione e la differenziazione Th1 sono analizzati con un approccio di citometria a flusso; e questo è combinato con studi in vivo , così evitare le alterazioni che possono verificarsi in vitro e compresi tipi cellulari e altri fattori solo trovati in organi intatti11.
L'uso di coloranti vitali è una tecnica ampiamente utilizzata per tenere traccia di proliferazione delle cellule, evitando l'uso di radioattività. La misurazione di proliferazione con questi reagenti si basa sulla diluizione della tintura dopo la divisione cellulare. Inoltre, questi coloranti possono essere rilevati a più lunghezze d'onda e facilmente sono analizzati tramite flusso cytometry in combinazione con più anticorpi fluorescenti o marcatori. Evidenziamo l'utilità del presente protocollo, mostrando come l'attivazione delle cellule T, la proliferazione e la differenziazione Th1 possono essere analizzati tramite flusso cytometry.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Procedure sperimentali sono state approvate dalla Fundación Centro Nacional de Investigaciones Cardiovasculares Carlos III (CNIC) e la Comunidad Autónoma de Madrid conformemente agli orientamenti spagnoli ed europei. I topi sono stati allevati in condizioni di agente patogeno specifico libera (SPF) e sono stati eutanasizzati per inalazione di anidride carbonica (CO2).
1. isolamento delle cellule del midollo osseo del topo da tibie e femori
Nota: Il ceppo di topo C57BL/6 Congenici trasporta l'indicatore differenziale del leucocita Ptprcuna, generalmente riconosciuto come CD45.1 o Ly5.1, considerando che il selvaggio-tipo C57BL ceppi Ptprcb dell'allele, conosciuto come CD45.2 o Ly5.2. Varianti CD45.1 e CD45.2 possono essere distinti da citometria a flusso facendo uso degli anticorpi. Topi CD45.1, CD45.2 e CD45.1/CD45.2 possono essere utilizzati come fonti di cellule o come destinatari per trasferimento adottivo, permettendo l'analisi delle popolazioni distinte delle cellule tramite flusso cytometry. Utilizzare preferenzialmente età- e sesso-abbinato maschi o femminili topi sotto 12 settimane di età.
-
Preparazione dei femori e tibie
- Eutanasia topi utilizzando il protocollo approvato dal Comitato istituzionale cura degli animali.
- Disinfettare le zampe spruzzando la superficie animale con etanolo al 70%.
- Utilizzare bisturi, pinze e forbici sterili. Con un bisturi, fare un taglio nella pelle e rimuovere la pelle dalla parte distale del mouse compreso la pelle che copre l'estremità posteriore. Sbucciare la pelle intorno al muscolo del polpaccio inferiore e rimuovere la pelle dalle gambe completamente (Figura 2A, 2B).
- Separare il muscolo quadricipite dal femore usando un bisturi. Disarticulate l'articolazione dell'anca senza rompere la testa del femore. Rimuovere i muscoli dalla tibia usando un bisturi (Figura 2, 2D). Separare il femore dalla tibia senza rompere l'estremità dell'osso.
- Mantenere le ossa in una piastra Petri contenente 10% siero bovino fetale (FBS) e 1% di penicillina/streptomicina nel mezzo di Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 1x ghiacciata.
-
Isolamento delle cellule
Nota: Tutti i passaggi successivi devono essere eseguiti sotto una cappa di cultura e con materiale sterile per evitare la contaminazione.- In una piastra Petri sterile, con cura di tagliare le estremità prossimale e distale di ogni osso con un bisturi.
- Lavare le ossa ripetutamente con un volume totale di 10 mL di caldo terreno RPMI completo (RPMI + 10% FBS, 2 mM EDTA, 1% di penicillina/streptomicina, 20 mM HEPES, 55 µM 2-mercaptoetanolo, piruvato di sodio di 1 mM e 2 mM L-Glutammina). Lavare le ossa da entrambe le estremità con un ago 25 G collegato ad una siringa da 1 mL.
- Trasferire il effluate in una provetta conica 50 mL con 70 µm in nylon web filtro. Attentamente sloggiare conglomerati delle cellule e detriti di agitazione delicata e pipettaggio.
- Centrifugare la sospensione cellulare a 250 x g per 10 min a temperatura ambiente (TA).
- Risospendere il pellet cellulare in 1 mL di tampone di lisi di globulo rosso freddo (0,15 M NH4Cl + 1mm KHCO3 + 0,1 mM EDTA, pH regolato a 7,2 con 1 N HCl, 0,4 µm sterile filtrato e conservato a 4 ° C). Mantenere in ghiaccio per 5 minuti con il manuale di agitazione.
- Aggiungere 10 mL di tampone di freddo (1 x 2 mM EDTA, tamponato fosfato salino (PBS) + 2% albumina di siero bovino (BSA)) per inattivare e lavare il buffer di lisi di globuli rossi.
- Centrifugare la sospensione cellulare a 250 x g per 5 min a 4 ° C.
- Lavare le cellule con 25 mL di terreno RPMI completo e centrifugare a 250 x g per 5 min a 4 ° C.
- Risospendere le cellule in 5 mL di terreno RPMI completo. Mix 50 µ l di sospensione cellulare 1:1 con trypan blu. Determinare il numero di cellule in una camera di conteggio al microscopio. Calcolare il numero di cellulare utilizzando la formula: cellule/mL = [(non macchiato delle cellule totali/4) x 2 x 10.000]12.
Nota: Questo metodo rese 40 x 106 a 60 x 106 osseo cellule di midollo per 8 non infetti al mouse di C57BL/6 settimana-vecchio 12. - Centrifugare la sospensione cellulare a 250 x g per 5 min a 4 ° C.
2. DC differenziazione, maturazione e caricamento di antigene
-
Raccolta delle cellule di BM
- Seme della cultura completa sulle piastre di superficie 6 pozzetti ultra-low-allegato a 106 cellule per mL di terreno, in genere in 5 mL per pozzetto. Macrofagi differenziati attribuirà alle piastre di coltura. Dopo 12 h, trasferire il surnatante, contenente principalmente i monociti, per pulire le piastre da 6 pozzetti, scartando i vecchi 6 pozzetti con i macrofagi aderiti.
- Per promuovere la differenziazione cellulare, coltura le cellule non-aderenti a 5 x 105 cellule / mL in genere 5ml per pozzetto di terreno RPMI completo contenente 20 ng/mL ottenuto commercialmente ricombinante GM-CSF murino a 37 ° C e 5% di anidride carbonica (CO2) e osservare quotidianamente.
- Ogni 3 giorni, rotazione verso il basso le cellule sospese e raccogliere le celle aderenti con 5 mM EDTA in PBS e rotazione verso il basso. Combinare e risospendere a 5 x 105 cellule/mL in mezzo fresco che contiene 20 ng/mL rm-GM-CSF.
- Il giorno 8, raccogliere le cellule aderenti e distaccate come sopra e risospendere a 5 x 105 cellule/mL in media da 20 ng/mL GM-CSF e 20 ng/mL lipopolysaccharide (LPS) per 24 h in un non-coltura del tessuto-trattati sterile di Petri, per indurre alta MHC-II , Espressione di CD80 e CD86.
- Differenziazione di controllo DC mediante citometria a flusso come indicato al punto 2.2.
-
Analisi di maturazione e differenziazione di citometria a flusso.
- Centrifugare la sospensione cellulare a 250 x g per 5 min a 4 ° C. Ripetere questo passaggio due volte.
- Recettori Fc blocco incubando il pellet cellulare sedimento nel stampo del ricevitore del mouse Fc (purificato anti anticorpo IgG CD16/CD322b ) per 15 min a 4 ° C secondo le istruzioni del produttore.
- Centrifugare la sospensione cellulare a 250 x g per 5 min a 4 ° C.
- Per ogni sonda, risospendere le 250.000 cellule a 300 µ l di tampone di citometria a flusso (1x PBS + 2 mM EDTA + 2% BSA) a 4 ° C.
- Trasferire 30 µ l di soluzione di cellule per pozzetto di una piastra a 96 pozzetti.
- Centrifugare la sospensione cellulare a 250 x g per 5 min a 4 ° C.
- Scartare il surnatante e aggiungere 30 µ l di anticorpo-contenente buffer per ogni bene seguendo le indicazioni del produttore. Incubare le cellule con anticorpi per 20 min a 4 ° C.
Nota: In genere impiegati marcatori per DCs, monociti e macrofagi sono CD11b, CD64, CD115, CD11c, MHCII, CD80 e CD86 (Figura 3). - Centrifugare i campioni a 250 x g per 5 min a 4 ° C e risospendere in 200 µ l di tampone di citometria a flusso freddo contenente un marcatore per escludere le cellule morte (ad es., ioduro di propidio, 4 ′, 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) o un colorante ammina-reattivo ) del produttore concentrazione consigliata13.
- Monitorare la differenziazione delle cellule trasferire i campioni ai tubi di flusso cytometry ed effettuando l'analisi di citometria a flusso escluse le cellule morte nei giorni 0, 3, 6 e 9.
-
Carico DC antigene.
- Il giorno 8, centrifugare i campioni a 250 x g per 5 min a 4 ° C e risospendere il pellet in media di 200 µ l (RPMI + 10% FBS senza antibiotici). Ripetere questo passaggio due volte.
- Incubare il DCs con 10 µ g/mL OVAp (323-339; ISQAVHAAHAEINEAGR) a 1 x 107 DCs in 1 mL di terreno (RMPI + 1% FBS) in un tubo di plastica per almeno 30 min a 37 ° C. Uso non caricati OVAp DCs come una condizione di controllo negativo.
- Centrifugare i campioni a 250 x g per 5 min a 4 ° C e risospendere il pellet in terreno RPMI completo di 200 µ l. Ripetere questo passaggio due volte.
- Centrifugare i campioni a 250 x g per 5 min a 4 ° C e risospendere il pellet in media di 200 µ l (RPMI + 10% FBS) a 2 x 106 cellule/mL.
3. isolamento di cellule T CD4 ingenuo da Paolo topi
Nota: Questo metodo produce circa 100 x 106 spleenocytes a 8 non infetti al mouse di C57BL/6 settimana-vecchio 12. Possono essere utilizzate sia maschi che femmine. Cellule T CD4 possono essere isolate dalla milza o linfonodi; Cellule T CD4 rappresentano circa il 25% e il 50% delle cellule in questi organi, rispettivamente. Effettuare le seguenti operazioni in condizioni di sterilità.
- Isolare i linfonodi inguinali, ascellari, brachiali, cervicali e mesenterici e la milza da topi transgenici Paolo (Figura 4) e trasferirli in una capsula di Petri contenente 10 mL di terreno RPMI completo di plastica.
- Sciacquare il filtro cella con 2 mL di terreno RPMI completo e rimuoverlo dal tubo 50 mL. Trasferimento di linfonodi e milza per un colino di cella di 70 µm collocato in una provetta da 50 mL. Omogeneizzare mediante un pistone della siringa (Figura 5) e aggiungere il terreno fino a 15 mL.
- Centrifugare i campioni a 250 x g per 5 min a 4 ° C e risospendere il pellet in 15 mL di terreno RPMI completo. Ripetere questo passaggio due volte.
- Per sospensione di cellule di milza, risospendere il pellet cellulare e lisare cellule rosse del sangue, come indicato nel passaggio 1.2.5.
- Centrifugare la sospensione cellulare a 250 x g per 5 min a 4 ° C.
- Lavare le cellule con 25 mL di terreno RPMI completo e centrifugare a 250 x g per 5 minuti a TA.
- Risospendere le cellule in 5 mL di terreno. Mescolare 50 µ l di sospensione cellulare 1:1 con Trypan blue. Determinare il numero di cellulare utilizzando una camera di conteggio al microscopio. Calcolare il numero di cellulare utilizzando la formula: cellule/mL = [(non macchiato delle cellule totali/4) x 2 x 10.000]12.
- Ripetere il punto 2.2.2.
- Seguendo le istruzioni del produttore, incubare le cellule con diluizioni 1: 800 di anticorpi biotinilati CD8α, IgM, B220, CD19, MHCII (Ab), CD11b, CD11c, CD44, CD25 e DX5 per 30 min in ghiaccio per poi selezione negativa delle cellule T CD4.
- Seguendo le istruzioni del produttore e sulla base del numero delle cellule e la capacità dei branelli, calcolare la quantità necessaria di microperle magnetiche rivestite con streptavidina e isolare le cellule T CD4 + utilizzando un separatore magnetico delle cellule e l'appropriato colonne di separazione.
- Risospendere le cellule in 5 mL di terreno RPMI completo e tenerli sul ghiaccio mentre il conteggio di cellule vive, come descritto al punto 3.7.
- Estrarre 2 x 105 celle e verificare la purezza delle cellule raccolte utilizzando anti-CD4, CD3, B220 e CD8 anticorpi fluorescenti in un citometro a flusso con diluizioni di anticorpo produttore-consigliare.
- Per macchiare le cellule di T di CD4/Paolo isolato naif, risospendere le cellule in 500 µ l di tampone (1x PBS + 2 mM EDTA + 2% BSA) 10-6 . Preparare 500 µ l tampone (1x PBS + 2 mM EDTA + 2% BSA) raddoppiare la concentrazione consigliata dal produttore finale di colorante tracciante vitale delle cellule. Mescolare entrambe le soluzioni aggiungendo lentamente la soluzione di tracciante cellulare alla sospensione di cellule. Incubare le cellule per 5 min a 37 ° C.
- Lavare le cellule con 5 mL di terreno RPMI completo e centrifugare a 250 x g per 5 min a 4 ° C. Ripetere questo passaggio due volte. Risospendere le cellule in 1 mL di terreno RPMI completo a 1 x 107cellule/mL.
4. in Vivo l'attivazione, proliferazione e analisi di differenziazione Th1
Nota: L'estere di succinimidyl diacetato di cellula vitale tracciante colorante carboxyfluorescein (CFSE) e altri coloranti a base di estere succinimidyl, che sono eccitati ed emettono fluorescenza a diverse lunghezze d'onda, sono ampiamente utilizzati per valutare la proliferazione dei linfociti di flusso citometria a causa della loro intensità alta fluorescenza, lunga durata, bassa variabilità e bassa tossicità14.
- Passivamente trasferimento per via endovenosa (i.v.) 1 x 106 dal vivo e vitale delle cellule tracciante colorante-macchiato ingenuo CD4/Paolo T cellule in 100 µ l di PBS per topo. Le cellule di T con etichettate possono essere trasferite passivamente dalla vena caudale o retro-orbitale iniezione15; in entrambi i casi, le cellule saranno sede di organi linfoidi (Figura 6A).
- Sfida i topi destinatari un giorno più tardi trasferendo passivamente 100.000 LPS-maturato caricato OVAp DCs per via sottocutanea (s.c.) in footpads (Figura 6B).
- Raccogliere poplitea linfonodi da topi destinatari ed elaborarli fino all'ottenimento delle sospensioni di cellule singole seguendo la stessa procedura come descritta in precedenza in 3.1 e 3.2. Fare questo post-immunizzazione giorno 2 per misurare l'attivazione delle cellule T CD4/Paolo ed il giorno 5 per misurare la proliferazione e la differenziazione Th1.
- Per analizzare l'attivazione delle cellule T il giorno 2, macchia le cellule con anticorpi fluorescenti di CD4, CD69 e CD25 (facoltativamente CD45.1 e CD45.2) e determinare la percentuale di C69+CD25+ T cellule nella popolazione CD4. Analizzare mediante citometria a flusso (Figura 7).
- Per controllare la proliferazione delle cellule T il giorno 5, macchia le celle utilizzando appropriati anticorpi fluorescenti CD4 e facoltativamente CD45.1 e CD45.2. Analizzare il decadimento del segnale vitale delle cellule tracciante colorante nella popolazione CD4 da citometria a flusso (Figura 8). Diversi parametri possono essere determinati in questi studi, come il numero di divisioni cellulari subito dalle cellule etichettate con il colorante tracciante vitali delle cellule, la percentuale di divisione delle cellule in ogni picco di fluorescenza e la percentuale di divisione delle cellule nella cella totale popolazione.
- Per determinare la differenziazione Th1 giorno 5, 400.000 cellule piastra per pozzetto di una piastra a 96 pozzetti in 200 µ l di terreno RPMI completo contenente 1 µM ionomicina e 10 ng/mL phorbol 12 miristato 13 acetato (PMA) per 6 h a 37 ° C nell'incubatore. Per l'ultimo 4 h, aggiungere 3 – 10 µ g/mL brefeldina A per bloccare la secrezione di citochina al mezzo.
- Centrifugare le piastre per 5 min a 250 x g a 4 ° C. Scartare il surnatante di inversione rapida della piastra 96 pozzetti.
- Ripetere il punto 2.2.2.
- Macchia le membrane cellulari mediante incubazione per 15 min a 4 ° C in 30 µ l di tampone (1x PBS + 2 mM EDTA + 2% BSA) contenente al CD4 e, facoltativamente, a CD45.1 e CD45.2 alle diluizioni consigliate dal produttore. Lavare le cellule con l'aggiunta di 150 µ l di tampone (1x PBS + 2 mM EDTA + 2% BSA) e centrifugare le piastre per 5 min a 250 x g a 4 ° C ed eliminare il surnatante.
- Fissare le cellule aggiungendo 100 µ l di paraformaldehyde/1% 2% saccarosio per 20 min a RT. centrifuga le piastre per 5 min a 1.000 x g a 4 ° C. Scartare il surnatante.
- Permeabilize le cellule aggiungendo 50 µ l di tampone di permeabilizzazione intracellulare (1x PBS + 0.1% BSA, 0,01 M HEPES, 0,3% saponine) ed incubare per 30 min a 4 ° C.
- Aggiungere 150 µ l di PBS e centrifugare per 5 minuti a 1.000 x g a RT. scartare il surnatante.
- Macchia di citochine intracellulari aggiungendo 30 µ l di fluorophore-coniugato anti anticorpo IFNγ nel buffer (PBS + 0.1% saponine) e incubare per 30 minuti a TA.
- Lavare le cellule con l'aggiunta di 150 µ l di tampone (PBS + 0.1% saponine). Centrifugare le piastre per 5 min a 1.000 x g a RT e scartare il surnatante. Ripetere questo passaggio due volte.
- Analizzare le popolazioni delle cellule mediante citometria a flusso (Figura 8).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
La figura 1 illustra i passaggi descritti in questo protocollo. La figura 2 illustra l'isolamento e la coltura delle cellule BM del topo. L'aggiunta di GM-CSF e LPS a queste culture permette la generazione in vitro e maturazione della DCs. Figura 3 illustra l'analisi di citometria a flusso della differenziazione e maturazione della DCs. OVAp-caricato GM-CSF BM-derivato DCs ottenuti e isolato delle cellule vitali traccia macchiato di tintura CD4/Paolo T cellule vengono trasferite passivamente ai topi. La figura 4 Mostra la posizione dei linfonodi utilizzato per l'isolamento di cellule T CD4/Paolo. La figura 5 Mostra un tubo 50 mL con il filtro di nylon 70 µm e un stantuffo della siringa utilizzata per omogeneizzare i linfonodi e la milza. Figura 6 Mostra i.v. l'iniezione delle cellule T CD4/Paolo nel plesso retro-orbitale e l'iniezione s.c. del DCs di GM-CSF BM-derivati OVAp-caricate il grassatore. Cellule T CD4/Paolo distribuiscono ai vari organi linfoidi, considerando che la migrazione di GM-CSF DCs ai linfonodi popliteal dove GM-CSF DCs attivare le cellule T CD4/Paolo ingenui dalla presentazione di OVAp. Cellule T CD4/Paolo ingenuo poi proliferano e differenziano verso il fenotipo Th1. La quantificazione di ingenuo l'attivazione delle cellule T CD4/Paolo dall'analisi della membrana CD69 e l'espressione di CD25 illustrato nella figura 7 . Figura 8 Mostra la quantificazione di proliferazione delle cellule T CD4/Paolo. Figura 9 illustra la quantificazione di differenziazione delle cellule T CD4/Paolo verso il fenotipo Th1.
Figura 1: schema del protocollo. 1) isolare cellule BM da mouse femori e tibie. 2) cultura BM celle con GM-CSF per generare GM-CSF BM derivate-DCs. 3) controllo DC differenziazione e GM-CSF BM derivato-DC mature con LPS. 4) controllare la maturazione delle DC. 5) carico DCs con OVAp. 6) isolare cellule di T di CD4/Paolo formano milza del mouse. 7) macchia le cellule T CD4/Paolo con colorante tracciante vitali delle cellule. 8) verificare la purezza di isolamento e cellula vitale tracciante colorante colorazione delle cellule T CD4/Paolo isolate. 9) passivamente trasferimento i.v. di cellule T CD4/Paolo isolato ai topi destinatari. 10). trasferire passivamente s.c. DCs OVAp-caricato e fatto maturare ai topi destinatari. 11) verifica l'attivazione delle cellule T CD4/Paolo. 12) verifica la differenziazione e la proliferazione delle cellule T CD4/Paolo. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 2: processo di isolamento del midollo osseo da mouse femori e tibie. (A) incisione cutanea con le forbici. (B) rimozione della pelle dall'arto. (C) incisione del muscolo con le forbici. (D) rimozione del muscolo dall'arto con un bisturi. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 3: flusso cytometry analisi della maturazione di GM-CSF BM-derivato DCs. Espressione di MHCII, CD80 e CD86 in LPS attivato (+ LPS) in superficie e non attivato (-LPS) derivata da GM-CSF BM DCs. numeri mostrano l'intensità media di fluorescenza in unità arbitrarie (UA). Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 4: posizione dei linfonodi inguinali, ascellari, brachiali, cervicali e mesenterici e della milza nei topi. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 5: impostazione sperimentale per linfonodi e milza omogeneizzazione. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 6: trasferimento adottivo di cellule T CD4/Paolo e OVAp-caricato GM-CSF BM-derivato-DCs. (A) l'iniezione endovenosa di cellule T CD4/Paolo nel plesso retro-orbitale. (B) l'iniezione sottocutanea di DCs di GM-CSF BM-derivati OVAp-caricato nel grassatore. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 7: quantificazione di cellula T di attivazione in vivo. Il flusso cytometry trame e grafico che mostra l'analisi e la quantificazione dell'espressione di membrana di CD69 in cellule T CD4. CD45.1/CD45.2 topi erano trasferiti passivamente i.v. con mouse CD45.1/CD4/OTII e cellule CD45.1/CD4/OTII 24 h prima del trasferimento adottivo di s.c. di BM di GM-CSF OVAp-caricato-derivato-attivazione delle cellule DCs. T è stata misurata a 2 giorni post-DC trasferimento tramite flusso cytometry dopo colorazione con etichetta fluorescente anticorpi agli antigeni indicati. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 8: quantificazione della proliferazione di cellule T in vivo. Il flusso cytometry trame e grafici che mostrano l'analisi e la quantificazione del colorante tracciante cellula vitale declino colorazione nella proliferazione di cellule T CD4. CD45.2 topi erano trasferiti passivamente i.v. con cellule di topo CD45.1/CD4/OTII 24 h prima del trasferimento adottivo di s.c. di BM di GM-CSF OVAp-caricato-derivato-proliferazione cellulare DCs. T è stata misurata a 5 giorni post-DC trasferimento tramite flusso cytometry dopo colorazione con il indicato anticorpi fluorescenti. Proliferazione delle cellule t può essere determinata misurando la percentuale delle cellule di proliferazione, la percentuale delle cellule in ogni picco di divisione, o contando il numero di picchi di divisione come illustrato nei grafici. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 9: quantificazione di differenziazione delle cellule T verso il fenotipo Th1 in vivo. Trame di citometria a flusso e grafici che mostrano l'analisi e la quantificazione della percentuale di cellule di T di CD4 + che esprimono IFNγ. CD45.2 topi erano trasferiti passivamente i.v. con cellule di topo CD45.1/CD4/OTII 24 h prima del trasferimento adottivo di s.c. di BM di GM-CSF OVAp-caricato-derivato-differenziazione delle cellule DCs. T è stata misurata a giorni post-DC trasferimento tramite flusso cytometry dopo colorazione con il indicato anticorpi fluorescenti. Differenziazione delle cellule t verso il fenotipo Th1 è stata determinata come cellule che esprimono IFNγ come percentuale di cellule T CD4 totali e da solo le cellule di T CD4 proliferazione. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Questo protocollo consente la caratterizzazione della capacità del DCs BM-derivato di modulare l'attivazione, proliferazione e differenziazione delle cellule T CD4 Naive. Inoltre, può anche essere utilizzato per valutare la suscettibilità delle cellule T CD4 + a modulazione da DCs BM-derivato. Con questo protocollo, le modifiche a questi eventi possono essere misurato in vivo.
Secondo l'ipotesi in esame, diverse combinazioni di cellule T e DC possono essere usati. Ad esempio, si possono analizzare le conseguenze di bussare o buttando di specifici geni o l'efficienza di uno stimolo specifico di attivazione delle cellule T CD4, proliferazione o differenziazione Th1. Queste procedure possono essere eseguite su DCs o T CD4 cellule o su entrambi i tipi cellulari. Così, le cellule T CD4 + da topi wild-type o geneticamente combinabile con DCs derivati da topi wild-type e viceversa.
Questo protocollo può essere adattato per distinguere l'origine delle popolazioni differenti delle cellule tramite flusso cytometry e anticorpi contro CD45.1 e CD45.2. Infatti, topi CD45.1/CD45.1 e CD45.2/CD45.2 possono essere utilizzati come origine di uno dei tipi di cella utilizzati o come destinatari per trasferimento adottivo in qualsiasi combinazione. Ad esempio, le cellule T CD4 + possono essere ottenute dai topi CD45.1/CD45.1/OTII mentre CD45.2/CD45.2 topi possono essere l'origine del BM per la generazione di DC. In questo esperimento, entrambi i tipi cellulari possono essere trasferiti passivamente ai topi CD45.1/CD45.2. Inoltre, le cellule di T di CD4/Paolo da CD45.1/CD45.1 digitare uno topi e CD45.2/CD45.2 tipo due topi possono essere combinati nei destinatari di tipo tre CD45.1/CD45.2 uguali o diversi per confrontare il comportamento di tipo uno e digitare due popolazioni di cellule T CD4 + in competizione e non concorrenti condizioni, rispettivamente.
Questo metodo descrive la generazione di GM-CSF BM-derivato DCs. Tuttavia, i protocolli alternativi sono disponibili per la maturazione delle DC e differenziazione; ad esempio, la papaina può essere utilizzata invece di LPS o ligando di chinasi 3 di tirosina fms-correlate (Flt3-L) invece di GM-CSF, permettendo studio della capacità di DCs fenotipico distinti per attivare l'immunità adattativa di cellule T CD4. Con la stessa intenzione, DCs per caricamento dell'antigene e la presentazione può essere direttamente isolati da topi. Combinazione di questo protocollo con altri9 permette la manipolazione di ingenuo cellule T CD4/Paolo da infezione virale16 prima del loro trasferimento adottivo ai topi destinatari. BM possono essere inoltre trasdotte con retrovirus9 per studiare l'effetto delle modificazioni cellulari controllate su controller di dominio prima del loro utilizzo nel protocollo.
Inoltre, questo protocollo può essere adattato per microscopia intravital studi17 utilizzando cellule che esprimono proteine fluorescenti. Ad esempio, CD4/Paolo topi possono essere incrociati con topi che esprimono GFP o ciliegio per ottenere topi GFP o Cherry/Paolo CD4. Questi topi possono quindi essere utilizzati come fonte di cellule T CD4 e possono essere combinati con DCs BM-derivati dai topi di ciliegia - o GFP-esprimendo, come richiesto, gli esperimenti in vivo .
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Gli autori non hanno nulla a rivelare
Acknowledgments
Ringraziamo il Dr. Simon Bartlett per l'editing di inglese. Questo studio è stato sostenuto da sovvenzioni da Instituto de Salud Carlos III (ISCIII) (PI14/00526; PI17/01395; CP11/00145; CPII16/00022), il programma di Miguel Servet e Fundación Ramón Areces; con il co-finanziamento del Fondo Europeo de Desarrollo Regional (FEDER). Il CNIC è supportato dal Ministero dell'economia, industria e competitività (MEIC) e la Fondazione Pro CNIC, è un Severo Ochoa Center of Excellence (SEV-2015-0505). RTF è fondata da Fundación Ramón Areces e CNIC, VZG da ISCIII, BHF di Instituto de Investigación Sanitaria Hospital 12 de Octubre (imas12) e JMG-G dal ISCIII Miguel Servet programma e imas12.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Ethanol | VWR Chemicals | 20,824,365 | 5 L |
| Scissors | Fine Science Tools (F.S.T.) | 14001-12 | |
| Forceps | Fine Science Tools (F.S.T.) | 11000-13 | |
| Fine Forceps | Fine Science Tools (F.S.T.) | 11253-20 | |
| Scalpel | Fine Science Tools (F.S.T.) | 10020-00 | Box of 100 blades |
| Fetal Bovine Serum | SIGMA | F7524 | |
| Penicillin/streptomycin | LONZA | DE17-602E | |
| Roswell Park Memorial Institute medium (RPMI) | GIBCO | 21875-034 | |
| Sterile Petri dishes | Falcon | 353003 | |
| 25-gauge needle | BD Microlance 3 | 300600 | |
| 1 ml syringe | Novico | N15663 | |
| 15 ml conical tubes | Falcon | 352096 | |
| 50 ml conical tubes | Falcon | 352098 | |
| 70 μm nylon web filter | BD Falcon | 352350 | |
| Red blood lysis buffer | SIGMA | R7757 | 100 Ml |
| EDTA | SIGMA | ED2SS-250 | |
| Bovine Serum Albumin | SIGMA | A7906 | 100 g |
| Trypan blue | SIGMA | 302643-25G | |
| Culture-plates | Falcon | 353003 | |
| 4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid (HEPES) | Cambrex | BE17-737E | |
| Beta-mercaptoethanol | Merck | 8-05740-0250 | |
| Sodium pyruvate | LONZA | BE13-115E | |
| L-glutamine | LONZA | BE17-605E | |
| Recombinant murine Granulocyte Macrophage colony-stimulating factor (GM-CSF) | Prepotech | 315-03 | |
| lipopolysaccharide (LPS) | SIGMA-ALDRICH | L2018 | |
| 96-well-plate | Costar | 3799 | |
| v450 anti-mouse CD11b antibody | BD Biosciences | 560455 | |
| PE anti-mouse CD64 antibody | BioLegend | 139303 | |
| PE anti-mouse CD115 antibody | BioLegend | 135505 | |
| FITC anti-mouse CD11c antibody | BioLegend | 117305 | |
| FITC anti-mouse MHCII antibody | BioLegend | 125507 | |
| APC anti-mouse CD86 antibody | BioLegend | 105011 | |
| APC anti-mouse CD80 antibody | BioLegend | 104713 | |
| Flow Cytometry tubes | Zelian | 300800-1 | PS 12X75 5mL |
| OTII Ovoalbumine peptide | InvivoGen | 323-339 | |
| anti-mouse biotinylated CD8α antibody | Tonbo Biosciences | 30-0081-U500 | |
| anti-mouse biotinylated IgM antibody | BioLegend | 406503 | |
| anti-mouse biotinylated B220 antibody | Tonbo Biosciences | 30-0452-U500 | |
| anti-mouse biotinylated CD19 antibody | Tonbo Biosciences | 30-0193-U500 | |
| anti-mouse biotinylated MHCII (I-Ab) antibody | BioLegend | 115302 | |
| anti-mouse biotinylated CD11b antibody | Tonbo Biosciences | 30-0112-U500 | |
| anti-mouse biotinylated CD11c antibody | BioLegend | 117303 | |
| anti-mouse biotinylated CD44 antibody | BioLegend | 103003 | |
| anti-mouse biotinylated CD25 antibody | Tonbo Biosciences | 30-0251-U100 | |
| anti-mouse biotinylated DX5 antibody | BioLegend | 108903 | |
| streptavidin-coated magnetic microbeads | MACS Miltenyi Biotec | 130-048-101 | |
| Magnetic cell separator | MACS Miltenyi Biotec | 130-090-976 | QuadroMACS Separator |
| Separation columns | MACS Miltenyi Biotec | 130-042-401 | |
| PE anti-mouse CD4 antibody | BioLegend | 100408 | |
| APC anti-mouse CD3 antibody | BioLegend | 100235 | |
| FITC anti-mouse CD8 antibody | Tonbo Biosciences | 35-0081-U025 | |
| Cell Violet Tracer | Thermofisher | C34557 | |
| APC anti-mouse CD25 antibody | Tonbo Biosciences | 20-0251-U100 | |
| Alexa647 anti-mouse CD69 antibody | BioLegend | 104518 | |
| PerCPCY5.5 anti-mouse CD45.1 antibody | Tonbo Biosciences | 65-0453 | |
| APC anti-mouse CD45.1 antibody | Tonbo Biosciences | 20-0453 | |
| PECY7 anti-mouse CD45.1 antibody | Tonbo Biosciences | 60-0453 | |
| FITC anti-mouse CD45.2 antibody | Tonbo Biosciences | 35-0454 | |
| Ionomycin | SIGMA-ALDRICH | I0634 | |
| Phorbol 12 Myristate 13 Acetate (PMA) | SIGMA | P8139 | |
| Brefeldin A (BD GolgiPlug) | BD | 555029 | |
| Paraformaldehyde | Millipore | 8-18715-02100 | |
| Intracellular permeabilization buffer | eBioscience | 00-8333 | |
| APC anti-mouse IFNg antibody | Tonbo Biosciences | 20-7311-U100 | |
| Fc-block (anti-mouse CD16/CD32) | Tonbo Biosciences | 70-0161-U100 | |
| B6.SJL CD45.1 mice | The Jackson Laboratory | 002014 | |
| BD LSRFortessa™ Cell Analyzer | BD Biosciences | 649225 | |
| DAPI Solution | Thermofisher | 62248 |
References
- Zhu, J., Yamane, H., Paul, W. E. Differentiation of effector CD4 T cell populations (*). Annual Review of Immunology. 28, 445-489 (2010).
- Bustos-Moran, E., Blas-Rus, N., Martin-Cofreces, N. B., Sanchez-Madrid, F. Orchestrating Lymphocyte Polarity in Cognate Immune Cell-Cell Interactions. International Review of Cell and Molecular Biology. 327, 195-261 (2016).
- Gonzalez-Granado, J. M., et al. Nuclear envelope lamin-A couples actin dynamics with immunological synapse architecture and T cell activation. Science Signaling. 7 (322), ra37 (2014).
- Rocha-Perugini, V., Gonzalez-Granado, J. M. Nuclear envelope lamin-A as a coordinator of T cell activation. Nucleus. 5 (5), 396-401 (2014).
- Rocha-Perugini, V., et al. CD9 Regulates Major Histocompatibility Complex Class II Trafficking in Monocyte-Derived Dendritic Cells. Molecular and Cellular Biology. 37 (15), (2017).
- Kaech, S. M., Wherry, E. J., Ahmed, R. Effector and memory T-cell differentiation: implications for vaccine development. Nature Reviews Immunology. 2 (4), 251-262 (2002).
- Iborra, S., Gonzalez-Granado, J. M. In Vitro Differentiation of Naive CD4(+) T Cells: A Tool for Understanding the Development of Atherosclerosis. Methods in Molecular Biology. 1339, 177-189 (2015).
- Toribio-Fernandez, R., et al. Lamin A/C augments Th1 differentiation and response against vaccinia virus and Leishmania major. Cell Death & Disease. 9 (1), 9 (2018).
- Lee, T., Shevchenko, I., Sprouse, M. L., Bettini, M., Bettini, M. L. Retroviral Transduction of Bone Marrow Progenitor Cells to Generate T-cell Receptor Retrogenic Mice. Journal of Visualized Experiments. (113), (2016).
- Cruz-Adalia, A., et al. Conventional CD4(+) T cells present bacterial antigens to induce cytotoxic and memory CD8(+) T cell responses. Nature Communications. 8 (1), 1591 (2017).
- Quah, B. J., Wijesundara, D. K., Ranasinghe, C., Parish, C. R. The use of fluorescent target arrays for assessment of T cell responses in vivo. Journal of Visualized Experiments. (88), e51627 (2014).
- Cruz-Adalia, A., Ramirez-Santiago, G., Torres-Torresano, M., Garcia-Ferreras, R., Veiga Chacon, E. T Cells Capture Bacteria by Transinfection from Dendritic Cells. Journal of Visualized Experiments. (107), e52976 (2016).
- Cossarizza, A., et al. Guidelines for the use of flow cytometry and cell sorting in immunological studies. European Journal of Immunology. 47 (10), 1584-1797 (2017).
- Quah, B. J., Parish, C. R. New and improved methods for measuring lymphocyte proliferation in vitro and in vivo using CFSE-like fluorescent dyes. Journal of Immunological Methods. 379 (1-2), 1-14 (2012).
- Yardeni, T., Eckhaus, M., Morris, H. D., Huizing, M., Hoogstraten-Miller, S. Retro-orbital injections in mice. Lab Animals (NY). 40 (5), 155-160 (2011).
- Warth, S. C., Heissmeyer, V. Adenoviral transduction of naive CD4 T cells to study Treg differentiation. Journal of Visualized Experiments. (78), (2013).
- Liou, H. L., Myers, J. T., Barkauskas, D. S., Huang, A. Y. Intravital imaging of the mouse popliteal lymph node. Journal of Visualized Experiments. (60), (2012).
