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Genetics

Proteina endogena Tagging in umani hanno indotto le cellule staminali pluripotenti utilizzando CRISPR/Cas9

doi: 10.3791/58130 Published: August 25, 2018

Summary

Descritto qui è un protocollo per l'etichettatura in modo endogeno espresse proteine con tag fluorescente in cellule staminali pluripotenti indotte umane utilizzando CRISPR/Cas9. Celle putativamente modificate sono arricchite da ordinamento di attivate la fluorescenza delle cellule e linee clonali della cellula vengono generate.

Abstract

Un protocollo è presentato per la generazione di cellule staminali umane pluripotenti indotte (hiPSCs) che proteine endogene express fuse per tag fluorescente N - o C-terminale in-struttura. Il sistema CRISPR/Cas9 procariotico (cluster regolarmente interspaziato corto palindromo 9 ripetizioni/CRISPR-associati) può essere utilizzato per introdurre grandi sequenze esogeni in loci genomici tramite riparazione omologia diretto (HDR). Per ottenere il desiderato knock-in, questo protocollo impiega la ribonucleoproteina (RNP)-dove la proteina wild type Streptococcus pyogenes Cas9, guida sintetica 2 RNA (gRNA) e un plasmide di modello del donatore vengono consegnati alle cellule tramite l'approccio basato sul elettroporazione. Putativamente modificate cellule che esprimono le proteine fluorescente contrassegnate sono arricchite da celle attivate la fluorescenza che ordinano (FACS). Linee clonali sono poi generati e possono essere analizzati per i risultati di editing precisi. Introducendo il tag fluorescente del locus genomico del gene di interesse, la localizzazione subcellulare risultante e la dinamica della proteina di fusione può essere studiato sotto controllo regolamentare endogena, un miglioramento fondamentale rispetto convenzionale sovraespressione sistemi. L'uso di hiPSCs come sistema modello per il gene tagging offre l'opportunità di studiare le proteine etichettate in cellule diploidi, non trasformate. Dal momento che hiPSCs può essere differenziato in più tipi di cellule, questo approccio offre l'opportunità di creare e studiare le proteine etichettate in una varietà di contesti cellulari isogeniche.

Introduction

L'uso di strategie di modifica del genoma, soprattutto CRISPR/Cas9, per studiare i processi cellulari sta diventando sempre più accessibile e preziosa1,2,3,4,5, 6 , 7. una delle tante applicazioni di CRISPR/Cas9 è l'introduzione (tramite riparazione omologia diretto (HDR)) di grandi sequenze esogeni come GFP in loci genomici specifici che poi servono come reporter per l'attività di un gene o una proteina prodotto8 . Questa tecnica può essere utilizzata per unire una sequenza della proteina fluorescente a un telaio di lettura aperto endogeno dove la proteina di fusione in modo endogeno regolamentato risultante può essere utilizzata per visualizzare la localizzazione subcellulare e la dinamica della proteina di interesse5 ,6,9,10,11. Mentre le proteine etichettate in modo endogeno offrono molti vantaggi rispetto ai sistemi di sovraespressione, inserimento di grandi sequenze nel genoma umano è un processo inefficiente in genere richiedono una selezione o una strategia di arricchimento per ottenere una popolazione di cellule che possono essere facilmente studiati5,12.

Questo protocollo descrive l'inserimento di una sequenza di DNA codifica per una proteina fluorescente (FP) in un locus genomico desiderato. Il protocollo comprende progettazione e consegna del plasmide di modello del donatore e il complesso ribonucleoproteico (RNP) (proteina wild-type S. pyogenes Cas9 combinata con sintetico CRISPR RNA (crRNA) e trans-attivazione crRNA (tracrRNA)). È anche descritto l'arricchimento delle celle putativamente modificate tramite celle attivate la fluorescenza che ordinano (FACS) e il processo di generazione di linea clonale delle cellule. Ad oggi, questo metodo è stato utilizzato per generare linee hiPSC con monoallelica o tag (raramente) bi-allelica proteina fluorescente verde (GFP) etichettatura venticinque proteine che rappresentano importanti strutture cellulari. Le celle modificate risultante da questi sforzi sono state confermate per avere l'inserimento genetico previsto, esprimono una proteina di fusione corretta localizzazione e mantenere la pluripotenza e un12 cariotipo stabile (e dati non pubblicati). Questo metodo è stato utilizzato anche per generare più altri single e dual (due differenti proteine contrassegnati nella stessa cella) modificato popolazioni di hiPSCs (dati non pubblicati).

IPSCs umane derivate da un donatore sano sono stati scelti per questi sforzi editing genomico perché, a differenza di molte linee cellulari convenzionali, sono diploidi, karyotypically stabile, non trasformate e proliferativa. Queste proprietà forniscono un modello interessante per lo studio della biologia delle cellule fondamentali e modellazione di malattia. Inoltre, il potenziale di differenziazione di hiPSCs offre l'opportunità di studiare di più stadi di sviluppo in parallelo attraverso le varie stirpi e tipi cellulari, utilizzando cellule isogeniche tra cui organoids, tessuti e modelli "malattia in un piatto"13 ,14,15. Mentre questo protocollo è stato sviluppato per hiPSCs (linea WTC), può essere informativa per lo sviluppo di protocolli usando altre linee cellulari di mammifero.

Protocol

1. in Silico Design di crRNA e donatore modello plasmide per FP Knock-in

  1. Ottenere la sequenza di riferimento annotato da NCBI16 o l' UCSC Genome Browser17 (ad es., GenBank formato) del gene di interesse e importarlo in un software di bioinformatica di scelta. Se la sequenza del genoma di host è conosciuta per contenere varianti rispetto al riferimento, comprendono quelli ora per impostare la sequenza di riferimento del software di bioinformatica (vedi discussione).
  2. Individuare il sito di inserimento desiderato di FP. Per Tag: C-terminale, la sequenza per il tag FP sarà introdotta tra l'ultima base del codone ultimo e la prima base di codone di arresto. Per N-terminale tagging, la sequenza per il tag FP sarà introdotto in genere tra l'ultima base del codone di inizio e la prima base del codone successivo. In alcuni casi, ad esempio quando il codone di inizio è un esone singolo codone, o dove una sequenza segnale esiste vicino al capolinea della proteina, il sito di inserimento desiderato FP può essere situato in una posizione più 3ʹ, fino a quando continua ad essere nel frame.
  3. Uso 50 bp su ciascun lato del sito di inserimento desiderato come la sequenza di input per qualsiasi strumento di disegno di crRNA pubblicamente disponibili. Una volta 2-4 crRNA obiettivi sono identificati nei pressi del sito di inserimento, annotare i siti di legame di crRNA e le sequenze di motivi protospacer-adiacente (PAM) (NGG) nel software di bioinformatica. Questi crRNAs serviranno per indurre le interruzioni incagliate doppie (vedi discussione per ulteriori indicazioni sulla progettazione di crRNA).
    Nota: Per sintesi possono essere presentate sequenze crRNA Custom con un fornitore commerciale (consigliato), o la sequenza può essere utilizzata come punto di partenza per progettare una strategia di sintesi clonazione o in vitro , che esula dall'ambito del presente protocollo (vedi discussione ).
  4. Per avviare il plasmide di modello del donatore, utilizzare 1 kb di sequenza a Monte del sito di inserimento desiderato come il braccio di omologia di 5ʹ (questo dovrebbe includere il codone di inizio per gli inserimenti del N-terminale) e 1 kb di sequenza a valle del sito di inserimento desiderato come la 3ʹ braccio di omologia (questo dovrebbe includere il codone di arresto per gli inserimenti C-terminale). Basi tra le due braccia di omologia in genere non sono omessi. Comprese le varianti specifiche linee cellulari tra le braccia di omologia conserverà queste varianti genetiche nelle celle modificate risultante.
  5. Tra i due rami di omologia, inserire la sequenza per la FP (o altra sequenza knock-in) e il linker (vedi discussione per ulteriori indicazioni sulla linker). Per i tag N-terminale, la sequenza del linker dovrebbe essere direttamente 3ʹ del PQ; per Tag: C-terminale, la sequenza del linker dovrebbe essere direttamente 5ʹ del PQ.
  6. Interrompere crRNA siti di legame nel plasmide modello donatore per prevenire Cas9 taglio di sequenza di donatore (vedi discussione per considerazioni quando si alterano i siti di legame di crRNA). Se possibile, la rottura del PAM in una sequenza diversa da NGG o NAG è preferita. In alternativa, l'introduzione di mutazioni puntiformi a tre basi nella regione semi di crRNA (10 basi prossimale al PAM) è preveduta per sufficientemente interrompere associazione crRNA. Alcuni siti di legame di crRNA sono interrotti da introduzione della sequenza FP nel plasmide modello donatore; Assicurarsi che nessun PAM o regione legante intatto ancora presente in questi casi.
    Nota: In silico plasmide modello donatore possa essere presentate per la sintesi di geni da un fornitore commerciale, o può essere utilizzato come punto di partenza per progettare una strategia di clonazione, che esula dall'ambito del presente protocollo. Una semplice spina dorsale come pUC19 o pUC57 è sufficiente.

2. ribonucleoproteina (RNP) transfezione per Knock-in CRISPR/Cas9 mediata in hiPSCs

Nota: In questo protocollo, il termine 'gRNA' descrive crRNA sintetico e tracrRNA correttamente ri-sospensione, quantificato e pre-complessati le istruzioni del produttore (Vedi Tabella materiali). Integrare tutti i media con 1% penicillina streptomicina. Linee guida generali di coltura della linea hiPSC WTC sono descritti più dettagliatamente al Allen cella Explorer18,19. WTC hiPSCs sono utilizzati nel presente protocollo, ma con ottimizzazione adeguata di transfezione, elettroporazione della RNP e plasmide modello donatore può essere adattato con successo ad altri tipi di cella.

  1. Preparare 10 azioni di lavoro µM di gRNA e wild type S. pyogenes Cas9 proteina2,20; tenere il ghiaccio. Preparare 1 µ g / µ l lavoro stock di plasmide di modello del donatore; conservare a temperatura ambiente (TA). Utilizzare buffer di TE pH 8.0 per tutte le diluizioni.
  2. Preparare una piastra di coltura del tessuto 6 pozzetti rivestite con matrice con 5 mL di coltura fresca completati con inibitore di ROCK 10 µM (Ri) in ogni pozzetto. Tenere piatto con media nell'incubatore a 37 ° C e 5% CO2 fino al momento alle cellule di piastra dopo la procedura di trasfezione (massimo 2 ore).
    Nota: Tutte le piastre rivestite con matrice utilizzate nel presente protocollo sono realizzate con l'aggiunta di che un volume di gelida Matrigel diluito 01:30 freddo DMEM/F12 media secondo l'Istituto di Allen per protocollo di cella scienza per la coltura del WTC hiPSC linea19.
  3. Utilizzando un reagente delicato unicellulare dissociazione come consigliato nella Tabella materiali, passaggio hiPSCs nelle cellule di cella singola sospensione e conteggio utilizzando un contatore di cellule automatizzato o un emocitometro.
    Nota: Un protocollo dettagliato per la linea di hiPSC WTC utilizzato qui reperibile al Allen cella Explorer19. Brevemente, lavare le cellule una volta con DPBS RT e trattare con il reagente di dissociazione per 3-5 minuti. Quindi triturare le cellule in sospensione unicellulare di pipettaggio delicato e pellet mediante centrifugazione. Risospendere il pellet di cellule vive in media di sviluppo completato con 10 µM Ri.
    1. Preparare un'aliquota di 1,84 x 106 cellule per ogni condizione sperimentale a trasfettati in tubi separati 1.5 mL.
      Nota: Tutti i volumi sono calcolati per un volume di reazione totale di 4,5 µ l in un volume di elettroporazione di 100 µ l, volte 2,3 reazioni. Questo account per la transfezione duplicata e in eccesso per errore di pipettaggio.
  4. Preparare della ribonucleoproteina tubi complessi (RNP) per ogni condizione sperimentale aggiungendo 2,88 µ l di 10 µM gRNA e 2,88 µ l di 10 µM Cas9 in una provetta da 1,5 mL. Incubare a temperatura ambiente per un minimo di 10 min (max 1 h).
  5. A pellet una cella aliquota (preparata al punto 2.3.1) a 211 x g per 3 min a RT. aspirare il surnatante e risospendere il pellet cellulare in 220 µ l di tampone di elettroporazione del produttore.
  6. Aggiungere 220 µ l di sedimento cellule dal passaggio 2.5 nel tubo complesso RNP 1,5 mL preparato al punto 2.4.
  7. Aggiungere 4.60 µ l di 1 µ g / µ l donatore modello plasmide al tubo da 1,5 mL preparato al punto 2.4.
  8. Utilizzare la punta di nucleofection e pipetta per mescolare il contenuto del tubo 2 - 3 volte, poi trasferire 100 µ l di sospensione al dispositivo preparato elettroporazione. Evitare di introdurre eventuali bolle nella punta. Applicare 1300 V per 1 impulso di 30 ms.
  9. Trasferire delicatamente la sospensione nel piatto preparato 6 pozzetti dal passaggio 2.2 con un moto vorticoso. Disperdere le cellule muovendo delicatamente la piastra lato a lato e fronte-retro.
  10. Utilizzando una nuova punta di nucleofection, ripetere i passaggi da 2,8-2,9 con i restanti 100 µ l di sospensione e trasferimento in un secondo pozzetto della piastra 6-ben preparato.
    1. Ripetere i passaggi da 2.4 attraverso 2.10 per ogni donatore e gRNA modello plasmide combinazione, tra cui non-targeting gRNA, donatore modello plasmide solo e unicamente controlli a tampone. Prendersi cura di cambiare pipetta e nucleofection consigli per evitare la contaminazione incrociata.
  11. Incubare le cellule trasfettate a 37 ° C e 5% CO2. Cambiare il supporto ai media di crescita regolare (no Ri) a 24 h e continuare ad alimentare hiPSCs ogni 24 h per 72-96 h, monitoraggio confluency. Quando hiPSCs raggiunge la confluenza di 60-80%, procedere al passaggio 3.
    Nota: Morte pesante (> 70%, stimato) è normale 24-48 ore dopo la trasfezione.

3. FACS-arricchimento di hiPSCs putativamente modificato

Nota: Durante l'ordinamento di cellule staminali, adattare le impostazioni dello strumento per promuovere la sopravvivenza delle cellule come suggerito nella discussione. Brevemente, utilizzare l'ugello più grande possibile (130 µm), una portata bassa (≤ 24 µ l/min), conservanti guaina fluido (ad esempio soluzione fisiologica, Vedi Tabella materiali) e campione di bassa pressione (10 psi).

  1. Prima di iniziare un esperimento di FACS, cambiare supporto ai media di crescita completati con 10 µM Ri e incubare le cellule a 37 ° C e 5% di CO2 per 2-4 h per promuovere la sopravvivenza dopo FACS.
  2. Utilizzando un reagente delicato unicellulare dissociazione come consigliato nella Tabella materiali, passaggio hiPSCs in sospensione unicellulare in crescita media completati con 10 µM Ri19.
  3. Filtrare hiPSC sospensione 35 µm maglia filtro in provette di polistirene a fondo tondo.
  4. Ordinare le celle utilizzando il forward scatter e dispersione laterale (tra cui altezza vs larghezza) per escludere detriti e doppietti. Uso dal vivo, buffer solo controllare le cellule per impostare la porta di FP-positivo, tale che < 0,1% delle cellule solo tampone rientrano il cancello.
  5. Ordina l'intera popolazione di FP-positiva delle cellule in una provetta di polipropilene 1,5-15 mL contenente 0,5-2 mL di mezzi di sviluppo RT completati con 10 µM Ri.
    Nota: Polipropilene riduce il potenziale di adesione delle cellule alla plastica.
  6. Centrifugare le cellule prelevate a 211 x g per 3 minuti a TA.
  7. Attentamente, aspirare il supernatante e risospendere il pellet cellulare in 200 µ l di crescita media completati con 10 µM Ri. Trasferimento fino a 3.000 cellule ordinate in un singolo pozzetto di una piastra a 96 pozzetti rivestite con matrice fresco19.
    Nota: Con setup strumento appropriato, le cellule possono anche essere ordinate (in massa) direttamente in un singolo pozzetto di una piastra di coltura del tessuto 96 pozzetti rivestite con matrice contenente 200 µ l di crescita media completati con 10 µM, Ri ad una densità consigliata di 1.000-3.000 cellule per pozzetto per hiPSC.
  8. Incubare le cellule ordinate a 37 ° C e 5% CO2. Cambiare il supporto ai media di crescita completati con 5 µM Ri a 24 h. A 48 h iniziare alimentazione cellule crescita regolare supporto (nessun Ri) ogni 24 h per 72-96 h, monitoraggio confluency. Sopravvivenza dopo FACS è stimata per essere superiore al 50% se un minimo di 500 cellule è seminato in un pozzetto di una piastra a 96 pozzetti.
    1. Quando hiPSCs raggiunge la confluenza di 60-80% e visualizza morfologia matura (liscio, ben confezionato Colonia centri), il passaggio in una piastra di formato più grande come una piastra a 24 pozzetti, quindi da una piastra a 24 pozzetti in una piastra a 6 pozzetti.
    2. Quando il hiPSCs in una piastra a 6 pozzetti raggiungere 60-80% confluenza e visualizza maturo morfologia, espandere in un piatto di 100 mm, ri-piastra per l'imaging, crioconservare o semi clone picking densità (passaggio 4)19.

4. generazione putativamente modificato clonale hiPSC linee

  1. Utilizzando un reagente delicato unicellulare dissociazione come consigliato nella Tabella materiali, passage hiPSCs in cella singola sospensione e determinare il numero di cellule per mL19.
  2. Cellule di seme 10.000 della popolazione modificata di hiPSCs su un piatto di coltura del tessuto fresco rivestite con matrice 100 mm utilizzando mezzi di sviluppo completato con 10 µM Ri19. Cambiare il supporto ai media di crescita senza Ri 24 h dopo la semina e feed hiPSCs con media crescita fresco ogni 24 h per 5-7 giorni.
  3. Quando hiPSCs formano colonie che sono visibili in modo macroscopico (circa 500 µm) sono abbastanza grandi per essere isolato. Preparare una piastra a 96 pozzetti rivestite con matrice ad aspirazione matrice in eccesso e aggiungendo 100 µ l di crescita media completati con 10 µM Ri per ben19.
  4. Su una pipetta di uso un P-200 microscopio per dissezione, o simili, per delicatamente raschiare ed aspirare diverse colonie dalla superficie della placca. Trasferire il volume (~ 20-100 µ l) contenente la Colonia per un singolo pozzetto della piastra 96 pozzetti preparata al punto 4.3.
    1. Dopo tutte le colonie sono state trasferite, incubare la piastra in un incubatore di coltura del tessuto a 37 e 5% CO2. Cambiare il supporto ai media di crescita regolare (no Ri) a 24 h e continuare ad alimentare le cellule ogni 24 h per 72-96 h fino a quando le colonie hanno circa triplicato le sue dimensioni (circa 1500 µm).
      Nota: Picking 24-96 colonie per crRNA usato nella transfezione è raccomandato. Sopravvivenza dei cloni isolati è generalmente maggiore del 95%.
  5. Utilizzando un reagente delicato unicellulare dissociazione come consigliato nella Tabella materiali, passaggio hiPSC cloni in una nuova piastra a 96 pozzetti rivestite con matrice come segue19.
    1. Utilizzando un aspiratore di 8 canali, rimuovere e gettare il terreno dalla prima colonna della piastra 96 pozzetti.
    2. Usando una pipetta multicanale di P-200, aggiungere ~ 200 µ l di DPBS alla prima colonna della piastra 96 pozzetti per lavare le cellule. Utilizzando un aspiratore di 8 canali, rimuovere e scartare DPBS lavata dalla prima colonna della piastra 96 pozzetti.
    3. Usando una pipetta multicanale di P-200, aggiungere 40 µ l di reagente di dissociazione alla prima colonna della piastra 96 pozzetti.
    4. Ripetere i passaggi 4.5.1-4.5.3 per fino a un totale di sei colonne della piastra a 96 pozzetti, cambiando suggerimenti per essere sicuri di non contaminare da Croce pozzi. Posizionare la piastra nell'incubatore 37 ° C per 3-5 minuti dal momento in cui che il reagente di dissociazione è stato aggiunto alla prima colonna (punto 4.5.3).
      Nota: È consigliabile passaggio solo un massimo di sei colonne (48 pozzetti) alla volta a causa del tempo che necessario per eseguire questi passaggi. Quando si esegue questo protocollo per la prima volta, iniziare con passaggio solo una o due colonne alla volta. Limitando il numero di colonne in una sola volta attraversate assicura che le cellule non sono lasciate nel reagente dissociazione per troppo tempo, che potrebbe essere dannoso per hiPSCs.
    5. Quando le celle nella prima colonna della piastra hanno cominciato a sollevare il fondo della piastra, utilizzare una pipetta multicanale P-200 per aggiungere 160 µ l di DPBS alla prima colonna della piastra 96 pozzetti e triturare delicatamente le cellule presso il "12:00" , "03:00", "06:00" e "09:00" posizioni di ciascun pozzetto. Trasferire l'intero volume della sospensione cellulare (200 µ l) in un piatto fondo V 96 pozzetti.
    6. Ripetere il passaggio 4.5.5 per le restanti colonne di cellule che hanno il reagente di dissociazione in loro; modificare i suggerimenti per non contaminare da Croce pozzi.
    7. Girare la piastra di fondo V in una centrifuga a 385 x g per 3 minuti a TA.
    8. Usando una pipetta multicanale di P-200, rimuovere delicatamente il supernatante e risospendere le cellule in 200 µ l di coltura fresco completati con 10 µM Ri per pozzetto. Ripetere per tutti i pozzetti, cambio punte per non contaminare di croce.
    9. Trasferire tutti i della sospensione delle cellule a una piastra a 96 pozzetti rivestite con matrice fresco19. Incubare la piastra in un incubatore di coltura del tessuto a 37 ° C e 5% CO2. Cambiare il supporto ai media di crescita regolare (no Ri) a 24 h e continuare ad alimentare le cellule ogni 24 h per 72-96 h, fino a raggiunge la maggior parte dei cloni confluenza di 60-80%.
      Nota: Questo passaggio consente di diffondere le cellule e permettere una crescita più su tutta l'area della piastra 96 pozzetti.
  6. Cloni di osservare e identificare un rapporto di divisione appropriata per ogni singolo clone della piastra a 96 pozzetti (ad es., 01:10 o 1:8). Utilizzano un reagente delicato unicellulare dissociazione come suggerito nella Tabella materiali, passaggio hiPSC cloni in una nuova rivestite con matrice piastra a 96 pozzetti (misure 4.5.1-4.5.8) trasferimento di un rapporto della sospensione cellulare appropriato per ogni clone. Incubare la piastra in un incubatore di coltura del tessuto a 37 e 5% CO2. Cambiare il supporto ai media di crescita regolare (no Ri) a 24 h e continuare ad alimentare le cellule ogni 24 h per 72-96 h, fino a raggiunge la confluenza di 60-80% la maggior parte dei cloni, Mostra morfologia matura.
    Nota: Ogni clone può avere un rapporto di divisione differenti a causa del tasso di crescita leggermente diverso o sopravvivenza dal passaggio precedente, quindi questo passaggio contribuisce a normalizzare il numero di cellule per pozzetto di ogni clone per il congelamento passo da seguire. Dovuta al tasso di variazione di sopravvivenza e di crescita, alcuni cloni possono invadere o non riescono a svilupparsi durante queste fasi di passaggio.
    1. Salvare il resto della sospensione cellulare e pellet per gDNA isolamento dalle cellule centrifugazione in un piatto fondo V 96 pozzetti a 385 x g per 3 min a RT. Remove surnatante e procedere all'isolamento gDNA utilizzando un kit di 96 pozzetti o memorizzare piastra delle cellule pellettate a - 20 ˚ c per fino a thr settimane di EE.

5. Crioconservazione delle varietà di cellula clonale in formato piastra a 96 pozzetti

  1. Utilizzando un reagente di dissociazione unicellulare, passaggio hiPSC cloni come descritti in precedenza (punti 4.5.1-4.5.7). Aspirare il surnatante con una pipetta multicanale P-200 e risospendere in 60 µ l di crescita media completati con 10 µM Ri. Ripetere per tutti i pozzetti; modificare i suggerimenti per non contaminare di croce.
  2. Versare 30 µ l di sospensione cellulare in un piatto non matrix 96 pozzetti rivestiti di coltura del tessuto. Quindi aggiungere rapidamente 170 µ l tampone di congelamento (Vedi Tabella materiali) in ciascun pozzetto, senza mescolare. Ripetere trasferendo i rimanenti 30 µ l di sospensione in una sorella piastra e l'aggiunta di 170 µ l congelamento del buffer.
    Nota: Questo processo è fatto in duplicati sorella piastre così che esista una popolazione di back up delle cellule dopo lo scongelamento di uno dei piatti individuali. Mettere le cellule crioconservate in solo ogni altra colonna di una piastra a 96 pozzetti permette per più velocemente lo scongelamento (punto 5.6).
  3. Avvolgete la piastra con parafilm e in una scatola di polistirolo RT con coperchio. Posizionare la scatola intera in un congelatore a-80 ° C.
  4. Dopo 24 h piastre possono essere trasferiti fuori dalla scatola di polistirolo e conservati a - 80 ° c fino a quattro settimane.
    Nota: Mentre le cellule vengono memorizzate temporaneamente a-80 ° C, le analisi genetiche di controllo di qualità possono essere eseguite con il gDNA raccolta da cellule ottenute nel passaggio 4.6.1 al fine di identificare i cloni per scongelare e propagare ulteriormente, come discusso nel lavoro precedentemente pubblicato 12. brevemente, una copia numero gocciolina digitale analisi PCR può essere utilizzata per identificare i cloni che contengono una o due copie di GFP e nessun donatore modello plasmide spina dorsale integrazione. Una combinazione di analisi di PCR end-point e può di sequenziamento Sanger quindi identificare cloni che contengono un inserto preciso.
  5. Per scongelare, portare l'intera piastra a 37 ° C in un incubatore di coltura del tessuto, guardando con attenzione per i pellet di ghiaccio a sciogliersi. Pozzi al bordo della piastra tendono a scongelare prima.
    1. Quando si scioglie il pellet di ghiaccio del clone desiderato, delicatamente trasferisca intero 200 µ l di una provetta conica da 15 mL contenente 3 mL di mezzi di sviluppo RT completati con 10 µM Ri e centrifugare a 211 x g per 3 minuti a TA.
    2. Aspirare il supernatante e risospendere le cellule pellettate in 1 mL di mezzi di sviluppo RT completati con 10 µM Ri. Versare in un piatto fresco di 24 pozzetti rivestite con matrice e incubare a 37 e 5% CO2. Cambiare il supporto ai media di crescita regolare (no Ri) a 24 h e continuare ad alimentare le cellule ogni 24 h per 72-96 h fino a quando il clone raggiunge confluency di 60-80% ed ha morfologia matura19.

Representative Results

L'obiettivo di questo esperimento era di fondere mEGFP (monomerico avanzata GFP) alla proteina nucleare Lilo B1 introducendo la sequenza di mEGFP fino alla fine di 5ʹ del gene LMNB1 (N-terminale della proteina). Un linker (sequenza dell'amminoacido SGLRSRAQAS) è stato scelto basata su precedenti costrutti di cDNA dal Michael Davidson proteina fluorescente collezione21. Perché la regione di associazione crRNA nel plasmide modello donatore per ogni candidato crRNA è stato interrotto dopo l'inserimento in silico di mEGFP e la sequenza del linker, nessuna mutazione di punto doveva essere fatto interferire con potenziali crRNA riconoscimento e scissione di Cas9 della sequenza dei donatori (Figura 1). La sequenza di donatore conteneva armi di omologia di 1 kb che fiancheggiano entrambe le estremità della sequenza mEGFP-linker. La risultante 2.734 bp di DNA è stato clonato in una spina dorsale pUC57, sequenza verificato, e il plasmide di modello donatore risultante è stato purificato mediante un'endotossina-libero maxi prep. Il donatore modello plasmide e RNP complesso transfected, putativamente modificato le cellule sono state arricchite e la localizzazione della proteina di fusione B1 Lilo mEGFP-nucleare è stata confermata da microscopia di fluorescenza (Figura 2). Solo risultati dalla transfezione di crRNA1 sono descritti qui, anche se entrambe le sequenze di crRNA prodotto popolazioni putativamente modificato12.

Rispetto al controllo negativo, che non conteneva nessun gRNA, Cas9 proteina o plasmide di modello donatore nella reazione elettroporazione (solo buffer), il crRNA1 LMNB1 transfettate le cellule contenute 0,95% cellule di mEGFP-positive che rappresentano il putativamente modificato mEGFP-nucleare Liuzzi B1 popolazione (Figura 3a). Questo risultato è stato all'interno della gamma di knock-in efficienza osservata attraverso molti loci genomici utilizzando questo metodo, come precedentemente segnalato12.

Le cellule mEGFP-positive sono sono isolate da FACS e ripreso da microscopia diretta per confermare la localizzazione prevista della proteina di fusione B1 mEGFP-nucleare LILO alla busta nucleare. Dopo FACS-arricchimento, circa il 90% delle cellule ordinate dalla popolazione crRNA1 LMNB1 erano mEGFP-positivi (come determinato da microscopia), suggerendo che alcune cellule mEGFP-negativi co-purificati con le cellule GFP-positive durante la procedura di ordinamento. Questo era un livello accettabile di arricchimento che ha permesso per la raccolta di 96 cloni che potrebbe allora essere geneticamente selezionati per l'editing di successo. Generalmente, un cut-off per l'arricchimento di successo è del 50% positivo GFP.

La maggior parte della popolazione cellulare ordinato visualizzato fluorescenza la busta nucleare (periferia nucleare) in cellule nondividing e a un'estesa lamina nucleare all'interno del citoplasma durante fiducia fornendo mitosi nella corretta genomico modifica presso il LMNB1 locus. La popolazione arricchita ha contenuto le cellule con segnale luminoso o dim. Questa differenza nell'intensità del segnale può riflettere una combinazione di corrette ed errate modifica i risultati e mette in evidenza l'utilità di generare una linea clonale geneticamente convalidata per ulteriori studi (vedi discussione) (Figura 3b)12. Dopo la generazione di linea clonale, geneticamente convalidato cellule hanno mostrato intensità uniforme di GFP in esperimenti di microscopia (Figura 3C).

Figure 1
Figura 1 . Progettare una strategia per il tagging di GFP N-terminale del gene LMNB1. Il tag GFP è stato progettato per 5ʹ di inserimento N-terminale del primo esone di LMNB1 localizzato sul cromosoma 5. Omologia sia 5ʹ che 3ʹ le braccia sono 1 kb ciascuno e si incontrano tra il codone di inizio (ATG) e il secondo codone (armi di omologia solo parzialmente rappresentati in figura). Due candidati crRNAs sono stati progettati per guidare Cas9 fendere come vicino al sito di inserimento previsto come possibile, pur essendo unico nel genoma. Sequenza per mEGFP e un linker dell'amminoacido sono stati inseriti solo 3ʹ del codone di inizio (sequenza mEGFP e il linker non in scala). Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 2
Figura 2 . Flusso di lavoro per la produzione in modo endogeno con tag linee clonali hiPSC. Componenti di transfezione, tra cui il complesso RNP Cas9/crRNA/tracrRNA (mostrato in rosso Cas9 proteina con crRNA oro e viola tracrRNA), contenente le braccia di omologia (HAs, mostrato in oro), il plasmide del modello donatore e FP + sequenza del linker (mostrato in verde), sono stati individulamente. Dopo 4 giorni, le cellule FP-positive putativamente modificata erano arricchite da FACS e ampliate come una popolazione di tutte le celle ordinate semina in un singolo pozzetto di una piastra a 96 pozzetti (~ 1.000 cellule) e quindi espanse in coltura fino a una popolazione lavorativa di diversi milioni di euro cellule potrebbero essere analizzate come la popolazione"arricchita" (Vedi protocollo punto 3.8). Il rendimento delle cellule positive-FP differisce da esperimento a causa di tassi variabili di HDR12; un arricchimento di successo in genere può includere ~ 300-5.000 cells fianchi dopo trasfezione di circa 1.6 x 106 . Studi preliminari di formazione immagine ha confermato il segnale e la localizzazione della proteina di fusione nella popolazione arricchita. Colonie sono state vendemmiate manualmente in una piastra a 96 pozzetti per espansione e crioconservazione. Ulteriormente lo screening genomico di controllo di qualità usando gocciolina digitali altri dosaggi basati sulla PCR e PCR (ddPCR) fu usato per identificare correttamente modificati cloni, come descritto in precedenza12. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 3
Figura 3 . Arricchimento delle popolazioni delle cellule putativamente modificato. (A) flusso cytometry trame del LMNB1 modificato post-transfezione quattro giorni di cellule. L'asse y Visualizza intensità GFP e l'asse x Visualizza forward scatter. Ordinamento cancelli erano impostate in base il controllo solo buffer. Dal momento che hiPSCs sono sensibili alla perturbazione, live/dead macchia è stato omesso e un cancello molto conservatrice di FSC/SSC è stato usato invece. (B) dopo arricchimento, la popolazione di LMNB1 Cr1 modificato cellule hanno mostrato ~ 90% delle cellule con GFP localizzazione alla busta nucleare (previsto LMNB1 localizzazione). La popolazione conteneva cellule di diversa intensità GFP, nonché alcune cellule GFP-negative. Barre della scala sono 10 micron. (C) dopo la generazione di linea clonale, le cellule hanno mostrato un intensità GFP uniforme, con alcune differenze dipendente dal ciclo cellulare. Barra della scala è di 20 micron.

Discussion

Il metodo presentato qui per generare in modo endogeno regolato fusioni di proteina fluorescente in hiPSCs è un approccio versatile e potente per la generazione di linee cellulari di gene modificato con applicazioni che vanno dall'imaging cellule vive a vari studi funzionali e " modelli di malattia in un piatto"usando paziente-derivati hiPSC linee13,14,15. Mentre questo metodo è stato utilizzato per introdurre grandi FP tag a N - o C-terminale delle proteine endogene, potenzialmente potrebbe essere utilizzato per introdurre altri tag o piccoli cambiamenti genetici a modello o malattia-causanti corretta mutazioni22,23 . Per gli inserti più piccoli, la dimensione del braccio omologia può essere ridotta, ma l'approccio generale all'editing presentati in questo metodo si può ancora applicare24,25. Mentre l'uso di hiPSCs è fortemente incoraggiato per la loro utilità vasta, con attenta ottimizzazione, questo protocollo può essere adattato per modificare i genomi di altre linee cellulari di mammifero.

Quando si identifica un gene di interesse per il tagging di FP, stime di abbondanza di trascrizione (da microarray o RNA-Seq dati) è un buon punto di partenza per valutare se un gene o una isoforma di interesse è espresso, anche se i livelli della trascrizione non correla sempre con livelli della proteina. La strategia di FACS-arricchimento descritta qui funziona meglio per geni che sono espressi almeno moderatamente bene il tipo di cella di interesse. Questa strategia ha anche avuto successo nella selezione per le fusioni che mostrano modelli di localizzazione punctate e/o discreti come centrin, desmoplakina e paxillin dove il fondo rapporto segnale è molto basso12,19. Geni che non sono altamente espressi o sono espressi solo in tipi cellulari derivati possono richiedere strategie di selezione supplementari.

Il punto di partenza per crRNA e donatore disegni del plasmide di modello utilizzato nelle linee cellulari umane dovrebbe essere il genoma umano di riferimento (GRCh38). Perché i genomi di diverse linee cellulari possono variare all'interno della stessa specie, e poiché CRISPR/Cas9 è sequenza-specifici, è estremamente utile identificare varianti di linea specifico delle cellule (polimorfismi a singolo nucleotide o inserzioni/delezioni (indels)) che differiscono dal genoma di riferimento e incorporare questi nel design. Questo assicura che crRNAs sarà compatibile con il genoma ospite e che le braccia di omologia di donatore modello plasmide manterrà tutte le varianti specifiche linee cellulari. Una strategia suggerita è di incorporare omozigotiche varianti nelle braccia modello plasmide omologia crRNAs e donatore durante il processo di progettazione. Incorporando varianti eterozigotiche è facoltativo. I reagenti specifici utilizzati per esperimenti di knock-in grande e altre considerazioni chiave per questo protocollo sono discussi di seguito.

Proteina Cas9

Il vantaggio principale dell'utilizzo della proteina Cas9 è che introducendo il Cas9 e gRNA come un complesso RNP ha dimostrato di provocare una durata limitata di attività della nucleasi rispetto ad approcci basati su plasmide dove espressione del Cas9 e gRNA può continuare per giorni e condurre 26,ad una maggiore attività di on e off-target27. Un ulteriore vantaggio dell'utilizzo di proteine Cas9 è che è prontamente disponibile per fendere una volta all'interno delle cellule. Questo contrasta con i metodi più convenzionali dell'utilizzo Cas9 mRNA o Cas9/gRNA plasmide che richiedono la trascrizione, la traduzione e la proteina elaborazione26,28. Proteina S. pyogenes Cas9 wildtype è ora disponibile da molte fonti commerciali.

Guida di RNA

Ci sono molti strumenti disponibili pubblicamente per l'individuazione di obiettivi di crRNA vicino al sito di inserimento desiderato di FP che hanno zero o pochi predetto off-target negli host genoma29,30,31,32. Efficienze in HDR e la precisione del risultato HDR variano ampiamente tra gli obiettivi di crRNA utilizzati in un dato locus12. Per questo motivo, test diversi crRNAs (2-4 e preferibilmente all'interno di 50 bp al sito d'inserzione desiderata) al locus è raccomandato in quanto ciò può aumentare la probabilità di un esperimento riuscito di editing. Possibilità attuali per la consegna di gRNA includono sintetico 2-parte crRNA tracrRNA, gRNAs singolo sintetico (sgRNAs), e in vitro trascritto sgRNAs, o la consegna di un plasmide alle cellule che esprimono il sgRNA da un promotore di U6. Questo protocollo non è stato ottimizzato per attività di fenditura alta. Non modificato in 2 parti crRNA e tracrRNA (Vedi Tabella materiali) sono stati utilizzati con l'obiettivo di generare linee cellulari mono-allelica FP-etichetta mentre provocando la perturbazione meno potenziale per le cellule.

Donatore modello plasmide

Perché alcune dell'omologia braccio sequenza condizione nel donatore plasmide modello verrà incorporati nel genoma ospite durante l'evento HDR, le mutazioni di punto per i siti di riconoscimento di crRNA dovrebbe presentare per impedire ulteriore scissione di Cas9 seguito HDR. Spesso il cambiamento dirompente più semplice è di mutare la sequenza di PAM. Perché alcune sequenze di PAM non canonico possono essere ancora riconosciuti da wild-type S. pyogenes Cas9, è meglio evitare di usare NGG, NAG o NGA33. Quando si cambia il braccio di omologia, evitare mutazioni non-sinonimo e l'introduzione di codoni rari. Se un cambiamento sinonimo per la sequenza di PAM non è possibile, è consigliabile rendere tre mutazioni puntiformi sinonima della regione semi (10 bp prossimale a PAM) del sito di legame di crRNA. Dovrebbe prestare attenzione estrema quando si apportano queste modifiche nella 5ʹ regione non tradotta (UTR) poiché queste regioni possono contenere sequenze regolatrici importanti. Consultare un database di conservazione genetica come tracce di genomica comparativa del Browser genoma UCSC possono fornire una guida in questi casi, come modifiche alle basi non conservato possono essere tollerate più meglio che cambia a basi altamente conservato17. A volte il semplice inserimento della sequenza FP è sufficiente per danneggiare il sito di associazione di crRNA (come in Figura 1); Tuttavia, la sequenza appena aggiunta dovrebbe essere verificata per la persistenza dell'associazione crRNA e sequenze di PAM.

Aminoacido linker tra la FP e la proteina nativa si consiglia di conservare la funzione della proteina di fusione34. Spesso un linker dell'aminoacido può essere scelto per la sua particolare carica o dimensione. Se una fusione di cDNA con un design simile alla mirata endogena proteina di fusione è stato ben studiato, stessa sequenza del linker può essere utilizzato per la CRISPR/Cas9 knock-in esperimento12,19. Se tali informazioni non sono disponibile, un linker breve come GTSGGS inoltre è stato usato con successo12. Altri studi hanno dimostrato il successo con una sequenza del linker acido 3-ammino piccolo generico per una serie di obiettivi35.

Transfezione e arricchimento di FACS

Molti reagenti di transfezione disponibili in commercio sono formulati per la consegna di alcuni tipi di molecole alle cellule, mentre un sistema di elettroporazione può essere utilizzato per fornire reagenti con una vasta gamma di dimensioni, carica e composizione. Oltre ad essere un comune metodo di transfezione per duro transfect cellule come hiPSCs, elettroporazione porta anche il vantaggio di fornire tutti i tre componenti per CRISPR/Cas9-mediata FP knock-in, come descritto in questo metodo. L'elettroporazione è stato trovato per produrre i migliori risultati rispetto ad altri reagenti commercialmente disponibili durante lo sviluppo di questo metodo (dati non mostrati) e inoltre è stato utilizzato da altri utenti per RNP consegna26,28,36 .

Quando si utilizza questo protocollo per l'editing hiPSCs, si dovrebbe prestare particolare attenzione a garantire una gestione delicata delle cellule prima e dopo il processo per la sopravvivenza cellulare ottimale e minima differenziazione spontanea di editing di gene. In particolare, i metodi di arricchimento di FACS dovrebbero essere adattati per l'ordinamento di cellule staminali utilizzando l'ugello più grande possibile (130 µm), un basso tasso di flusso (≤24 µ l/min), conservanti guaina fluido (ad esempio soluzione fisiologica, Vedi Tabella materiali) e basso del campione pressione (10 psi). Invece di singola cella ordinamento, che si traduce nell'attuabilità suboptimale in cellule staminali, il hiPSCs FACS-arricchito vengono ordinati alla rinfusa e ampliato come una popolazione per ottimizzare l'integrità di cellula staminale e attuabilità delle cellule. Tuttavia, la singola cella ordinamento può essere appropriato per meno tipi cellulari sensibili. Per promuovere la sopravvivenza delle cellule, le cellule vengono restituite alla cultura non più di un'ora dopo la raccolta per l'arricchimento di FACS e conservate a temperatura ambiente durante il processo di ordinamento. Per alcuni tipi di cellule, la sopravvivenza delle cellule può essere migliorata anche incubando le cellule su ghiaccio (4° C) durante tutto il processo di ordinamento.

L'espansione della massa delle cellule positive-FP fornisce un'opportunità per valutare la popolazione dall'analisi di imaging per localizzazione della proteina di fusione prima di generare linee clonali. Mentre la popolazione arricchita risultante delle cellule può essere sufficiente per alcuni studi, queste popolazioni visualizzare frequentemente FP segnale di varia intensità. Le linee clonali isolate hanno segnale uniforme (Figura 3), che li rende più appropriato per gli esperimenti funzionali12.

Generazione di linea clonale delle cellule

Durante tutto il processo di generazione linea editing e clonale, è importante monitorare la morfologia delle cellule. hiPSC colonie coltivate in condizioni prive di alimentatore dovrebbero esibire i bordi regolari e un centro ben confezionato, anche12,18,19. Cellule differenziate dovrebbero essere osservate in meno del 5% della cultura. Quando la raccolta di diverse colonie, scegliere quelli che mostra la buona morfologia. Durante la piastra a 96 pozzetti passaggio eventi, controllare cloni per morfologia e sospendere quelli che hanno invaso come questo può condurre alla differenziazione o essere un'indicazione di instabilità genetica.

Generazione delle varietà di cellula clonale permette per conferma genetica di editing preciso, che è importante perché indotta da Cas9 doppio filo si rompe nel genoma sono spesso riparato impreciso nonostante incorporazione del tag al luogo desiderato. Analisi PCR-basata precedentemente descritte ha mostrato che cumulativamente attraverso dieci loci genomici unici molti (45%) dei cloni che esprimono FP sofferta dall'integrazione di spina dorsale di plasmide di donatore al luogo di destinazione o (raramente) in modo casuale nel genoma12. Inoltre, il 23% di GFP-positive cloni (n = 177) attraverso dieci loci unici sono stati trovati per harbor mutazioni presso o vicino al sito di taglio crRNA attesi nell'allele senza tag, probabilmente a causa di NHEJ12. Questa analisi genetica di molte linee clonali (~ 100 cloni/edit) sottolinea l'importanza della validazione genetica che non è possibile in una popolazione delle cellule poiché FP-espressione e localizzazione della proteina di fusione previsto da solo non garanzia di editing preciso12 . Inoltre, non è possibile eseguire queste analisi PCR-basata su una popolazione arricchita delle cellule con alcuna certezza, che giustificano la necessità per la generazione linea clonale prima analisi significativa possono essere completata. Conferma genetica del inserito tag FP e verifica dell'integrità genetica dell'allele inedito (in un clone modificato mono-allelica) sono entrambi necessari per assicurare il preciso editing presso il locus mirato oltre espressione contrassegno.

Un basso tasso di modifiche bi-allelica e mancanza di mutazioni fuori bersaglio (come dosati di Sanger e il sequenziamento dell'esoma) sono stati osservati per data utilizzando questo metodo (dati non pubblicati)12. Ciò è coerente con gli studi precedenti che descrivono l'uso di breve durata RNP per CRISPR/Cas9 esperimenti26,27. La mancanza di linee di cellule clonali con bi-allelica modifiche può anche essere locus specifico o a causa dell'incapacità della cellula di tollerare due etichettate copie di una proteina essenziale come suggerito da esperimenti precedentemente pubblicati dove sono stati presunte bi-allelica celle modificate osservate per un locus (LMNB1), ma non un altro (TUBA1B)12. Linee di Bi-allelic completamente convalidato clonale delle cellule sono state generate utilizzando questo metodo per tag ST6 beta-galactoside alfa-2, 6-sialiltrasferasi 1 (ST6GAL1) e RAB5A membro RAS oncogene (RAB5A) con mEGFP19.

Di là di confermare la precisione della modifica nel genoma, ci sono una varietà di test di controllo qualità che può essere utilizzato per ulteriori caratterizzano la linea clonale e identificare cloni che soddisfano tutte le cellule staminali, genomica, e criteri biologici delle cellule per utilizzano in futuro studi . Analisi biologiche e funzionale delle cellule possono essere utilizzate per confermare l'espressione appropriata, la localizzazione e funzione della proteina fusion12. Confronto all'inedito controllo genitori vi aiuterà a valutare l'influenza del processo di editing su localizzazione, la dinamica e la funzione. Altri saggi come crescita analisi e test per la stabilità genomica può anche aiutare a determinare se la proteina taggata è perturbante alla cella. Quando si utilizza hiPSC in questo protocollo, valutazione di marcatori di pluripotenza e potenziale di differenziazione può essere critico nel determinare un clone che è prezioso per a valle studia12. Perché estesa cultura della hiPSC ha dimostrato di portare a instabilità genetica, monitoraggio del tasso di crescita e cariotipo delle varietà di cellula clonale è anche importante12,37. Tuttavia, la finale destinato uso di celle modificate determinerà il livello e l'ampiezza di analisi di controllo di qualità e varia a seconda dell'applicazione.

Disclosures

Gli autori non hanno nulla a rivelare.

Acknowledgments

Ringraziamo Dambournet Daphne per molte discussioni penetranti e consigli sul gene editing, Thao per l'illustrazione, Angelique Nelson per la lettura critica del manoscritto e Andrew Tucker per la generazione della linea cellulare di lillo B1 mEGFP-etichetta. Vogliamo riconoscere le cellule staminali e Gene Editing e team di sviluppo di analisi presso l'Istituto di Allen per la scienza delle cellule per il loro contributo al processo di controllo qualità e gene editing. La linea WTC che abbiamo usato per creare la nostra linea di cella gene-modificato è offerta dal Bruce R. Conklin Laboratory presso gli istituti di Gladstone e UCSF. Ringraziamo l'Istituto Allen per il fondatore di scienza di cella, Paul G. Allen, per la sua visione, incoraggiamento e supporto.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Geneious R9 Biomatters, or similar bioinformatics software for in silico donor plasmid design
TE Buffer pH 8.0 IDT, or similar 11-01-02-05
HERAcell VIOS 160i CO2 incubator, or similar ThermoFisher Scientific, or similar 51030408
Pipettes (1000 µL, 200 µL, 20 µL, 10 µL, 2 µL) Rainin, or similar
Pipette tips (1000 µL, 200 µL, 20 µL) Rainin, or similar
Multi-channel Pipette (200 µL) Rainin, or similar
Serological pipetes (25 mL, 10 mL, 5 mL) Costar, or similar
BRAND 8-Channel Manifold for Quiksip, Autoclavable Millipore Sigma, or similar BR704526-1EA use with non-filtered pipet tips, such as Molecular BioProducts Low Retention Pipet Tips, Pure 10, below
Molecular BioProducts Low Retention Pipet Tips, Pure 10 Thermo Fisher, or similar 3501-05
XP2 Pipette Controller Drummond, or similar 4-000-501
Disposable Pasteur Pipets VWR, or similar 53300-567
Class II, Type A2 Biological Safety Cabinet CELLGARD, or similar NU-481
Matrigel Matrix, Growth Factor Reduced Corning 354230 lot tested before use with hiPSC
DMEM/F12 (-phenol red) Gibco 11039-021 cold, for diluting Matrigel 1:30
mTeSR1 Complete Media StemCell Technologies 85850 recommended growth media for WTC hiPSC line
Penicillin-streptomycin Gibco 15070-063
WTC hiPSC line Coriell GM25256 the hiPSC line used in this protocol is available through Coriell
Tissue culture dish 100 mm Falcon 353003
6-well Cell Culture Plate CELLSTAR 657160
StemPro Accutase Gibco A11105-01
Dulbecco's Phosphate Buffered Saline (DPBS) no calcium, no magnesium Gibco 14190144
15 mL polystyrene conical Sarstedt 62.554.100
Y-27632 (ROCK Inhibitor) StemCell Technologies 72308
Edit-R CRISPR-Cas9 Synthetic crRNA, unmodified (custom sequence) Dharmacon Custom0247
Edit-R CRISPR-Cas9 Synthetic tracrRNA Dharmacon U-002005-05
Recombinant wild-type Streptococcus pyogenes Cas9-NLS purified protein, 40 µM University of California-Berkeley QB3 Macrolab
Custom donor plasmid (PriorityGENE) Genewiz donor insert design was synthesized and cloned into pUC57 backbone by Genewiz
DNA LoBind Tube 1.5 mL Eppendorf 22431021
NucleoBond Xtra Maxi EF Clontech 740424.50
Neon Transfection System ThermoFisher Scientific MPK5000
Neon Transfection System, 100 µL kit ThermoFisher Scientific MPK10096
5 mL Polystyrene Round-bottom Tube with Cell Strainer Cap Falcon 352235
15 mL High Clarity Polyproylene Conical Tube Falcon 352196
FACSAriaIII Fusion BD Biosciences 656700
FACSDiva software BD Biosciences
FlowJo version 10.2 TreeStar
NERL Blood Bank Saline ThermoFisher Scientific 8504 used as preservative-free FACS Buffer
Olympus SZX7 Stereo Microscope, or similar Olympus, or similar
Tissue culture plate, 96-well Falcon 353072
96 well Cell Culture Plate, V-Bottom CELLSTAR 351180
CryoStor CS10 Sigma C2874-100ML used as cryopreservation buffer for cells in 96-well plate format
Parafilm Bemis PM-996
24 well Cell Culture Plate CELLSTAR 662160

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Proteina endogena Tagging in umani hanno indotto le cellule staminali pluripotenti utilizzando CRISPR/Cas9
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Haupt, A., Grancharova, T., Arakaki, J., Fuqua, M. A., Roberts, B., Gunawardane, R. N. Endogenous Protein Tagging in Human Induced Pluripotent Stem Cells Using CRISPR/Cas9. J. Vis. Exp. (138), e58130, doi:10.3791/58130 (2018).More

Haupt, A., Grancharova, T., Arakaki, J., Fuqua, M. A., Roberts, B., Gunawardane, R. N. Endogenous Protein Tagging in Human Induced Pluripotent Stem Cells Using CRISPR/Cas9. J. Vis. Exp. (138), e58130, doi:10.3791/58130 (2018).

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