Summary
Cellulaire senescentie is de belangrijkste factor in de ontwikkeling van chronische leeftijdsgebonden pathologieën. Identificatie van therapeutische middelen die gericht zijn op senescentie cellen tonen belofte voor het verlengen van gezonde veroudering. Hier presenteren we een nieuwe assay voor de identificatie van senotherapeutica op basis van meting van senescentie geassocieerde β-galactosidase activiteit in enkelvoudige cellen.
Abstract
Cell senescentie is een van de kenmerken van veroudering bekend om een negatieve invloed op een gezonde levensduur. Geneesmiddelen die in staat zijn om de senescentie cellen te doden, specifiek in de celcultuur, de zogenaamde senolytica, kunnen de senescentie-celbelasting in vivo verminderen en de healthspan verlengen. Er zijn tot nu toe meerdere klassen van senolytica geïdentificeerd, waaronder HSP90 remmers, bcl-2 familie remmers, piperlongumine, een FOXO4 remmende peptide en de combinatie van Dasatinib/quercetine. Detectie van SA-β-gal bij een verhoogde lysosomale pH is een van de best gekenmerkte markers voor de detectie van senescentie cellen. Levende celmetingen van senescentie-geassocieerde β-galactosidase (SA-β-Gal) activiteit met behulp van het fluorescerende substraat C12FDG in combinatie met de bepaling van het totale aantal cellen met behulp van een DNA intercalating Hoechst Dye opent de mogelijkheid om scherm voor senotherapeutische geneesmiddelen die ofwel de algehele SA-β-gal-activiteit verminderen door het doden van senescentie cellen (senolytica) of door het onderdrukken van SA-β-gal en andere fenotypes van senescentie cellen (senomorfen). Het gebruik van een high-content fluorescerende beeld acquisitie-en analyseplatform zorgt voor de snelle screening van medicijn bibliotheken met een hoge doorvoer voor effecten op SA-β-gal, celmorfologie en celnummer.
Introduction
Cellulaire senescentie werd voor het eerst beschreven door Leonard Hayflick en Paul Moorhead, die liet zien dat normale cellen een beperkt vermogen hadden om te vermenigvuldigen in cultuur1. Senescentie cellen niet te vermenigvuldigen ondanks de aanwezigheid van voedingsstoffen, groeifactoren en gebrek aan contact remming, maar blijven metabosch actief2. Dit fenomeen staat bekend als replicatief senescentie en werd voornamelijk toegeschreven aan de telomeer verkorting, althans in menselijke cellen3. Verdere studies hebben aangetoond dat cellen ook kunnen worden geïnduceerd om senescentie te ondergaan in reactie op andere stimuli, zoals oncogene stress (oncogene geïnduceerde senescentie, OIS), DNA-beschadiging, cytotoxische geneesmiddelen of bestraling (stress geïnduceerde senescentie, SIS)4 , 5 , 6. als reactie op DNA schade, met inbegrip van telomeer erosie, cellen ofwel senesce, start ongecontroleerde celgroei, of ondergaan apoptosis als de schade niet kan worden hersteld. In dit geval, cel senescentie lijkt te zijn gunstig als het werkt in een tumor suppressieve manier2. In tegenstelling, senescentie wordt verhoogd met veroudering als gevolg van de accumulatie van cellulaire schade met inbegrip van DNA-schade. Aangezien senescentie cellen cytokines kunnen afscheiden, matrixmetalloproteïnases en groeifactoren, aangeduid als de senescentie-geassocieerde secretoire fenotype (sasp), deze leeftijd afhankelijke toename van cellulaire senescentie en sasp draagt bij aan verminderde weefselhomeostase en vervolgens veroudert. Ook is deze leeftijdsafhankelijke toename van de senescentie last bekend voor het opwekken van metabole ziekten, stress gevoeligheid, Progeria syndromen en verstoorde genezing7,8 en is, deels, verantwoordelijk voor de talrijke leeftijdsgebonden ziekten, zoals atherosclerose, artrose, gespierde degeneratie, zweervorming, en de ziekte van Alzheimer9, 10,11,12,13. Het elimineren van senescentie cellen kan helpen om weefsel disfunctie te voorkomen of vertragen en healthspan14uit te breiden. Dit is aangetoond in transgene muismodellen14,15,16 en door gebruik te maken van senolytische geneesmiddelen en combinaties van geneesmiddelen die werden ontdekt door zowel de screening van de drug en bioinformatische analyse van trajecten specifiek geïnduceerd in de senescentie cellen17,18,19,20,21,22. Het identificeren van meer optimale senotherapeutische geneesmiddelen, in staat om de senescentie-celbelasting effectiever te verminderen, is een belangrijke volgende stap in de ontwikkeling van therapeutische benaderingen voor gezonde veroudering.
De senescentie cellen vertonen karakteristieke fenotypische en moleculaire kenmerken, zowel in de cultuur als in vivo. Deze senescentie markers kunnen ofwel de oorzaak of het resultaat zijn van senescentie inductie of een bijproduct van moleculaire veranderingen in deze cellen. Er wordt echter geen enkele marker specifiek gevonden in de senescentie cellen. Op dit moment, senescentie-geassocieerde β-galactosidase (SA-β-Gal) detectie is een van de meest gekarakteriseerde en gevestigde eencellige methoden voor het meten van senescentie in vitro en in vivo. SA-β-Gal is een lysosomale hydrolase met een optimale enzymatische activiteit bij pH 4. Het meten van zijn activiteit bij pH 6 is mogelijk, omdat de senescentie cellen een verhoogde lysosomale activiteit vertonen23,24. Voor levende cellen wordt een verhoogde lysosomale pH verkregen door lysosomale alkalisatie met de vacuole H+-ATPase-remmer bafilomycine a1 of de endosomale verzuring remmer chloroquine25,26. 5-dodecanoylaminofluorescein di-β-D-galactopyranoside (C12FDG) wordt gebruikt als substraat in levende cellen als het behoudt het gecleaved product in de cellen als gevolg van de 12 Carbon lipofiele stof25. Belangrijk is dat de SA-β-gal-activiteit zelf niet rechtstreeks verbonden is met een in de senescentie cellen geïdentificeerd traject en niet noodzakelijk is voor het induceren van senescence. Met deze test kunnen senescentie cellen worden geïdentificeerd, zelfs in heterogene celpopulaties en verouderings weefsels, zoals huid biopsieën van oudere individuen. Het is ook gebruikt om een correlatie tussen cel senescentie en veroudering van23 te laten zien, omdat het een betrouwbare marker is voor het detecteren van sencentie cellen in verschillende organismen en voorwaarden27,28,29, 30. Hier wordt een hoge doorvoer van de SA-β-gal-screeningtest op basis van het fluorescerende substraat C12FDG met behulp van primaire muis embryonale fibroblasten (mef's) met robuuste oxidatieve stress geïnduceerde celsenescentie beschreven en de voor-en nadelen ervan worden besproken. Hoewel deze test kan worden uitgevoerd met verschillende celtypen, het gebruik van Ercc1-deficiënte, DNA-herstel verminderde mefs zorgt voor een snellere inductie van senescentie onder omstandigheden van oxidatieve stress. Bij muizen, verminderde expressie van de DNA-reparatie endonuclease ERCC1-XPF veroorzaakt verminderde DNA-herstel, versnelde accumulatie van endogene DNA-schade, verhoogde ROS, mitochondriale disfunctie, verhoogde senescentie celbelasting, verlies van stamcel functie en vroegtijdige veroudering, vergelijkbaar met natuurlijke veroudering31,32. Evenzo ondergaan Ercc1-deficiënte mef's sneller senescentie in cultuur17. Een belangrijk kenmerk van de senescentie-MEF-test is dat elk goed een mengsel van senescentie-en niet-senescentie cellen heeft, waardoor een duidelijke demonstratie van senescentie-celspecifieke effecten mogelijk is. Hoewel we geloven dat het gebruik van oxidatieve stress in primaire cellen voor het opwekken van senescentie meer fysiologisch is, kan deze test ook worden gebruikt met cellijnen waar senescentie wordt geïnduceerd met DNA-schadelijke agentia zoals Etoposide of bestraling.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Het gebruik van dieren werd goedgekeurd door de Commissie voor institutionele dierenverzorging en-gebruik in de Scripps Florida.
1. generatie van senescentie-embryonale fibroblast (MEF) – 12-15 dagen
- Isoleer wild type en Ercc1-/- mefs van zwangere vrouwelijke muizen op embryonale dag 13 (E13) zoals eerder beschreven33.
Opmerking: alle volgende stappen worden uitgevoerd in een weefselkweek kap onder aseptische omstandigheden en met behulp van steriele instrumenten. - Sla het embryo hoofd boven de ogen.
- Verwijder het rode weefsel (hart en lever) en gebruik ze indien nodig voor genotypering.
- Bereid 500 mL van een 1:1 mengsel van Dulbecco's gemodificeerde Eagle's medium (DMEM) en ham F10 met 10% foetaal runderserum, 1x niet-essentiële aminozuren, penicillaire, en streptomycine als groei medium en verwarm het tot 37 °C gedurende ongeveer 15 minuten voor elk gebruik. Bewaar het groeimedium bij 4 °C.
- Incuberen de rest van het embryo met 0,25% trypsine/EDTA gedurende 10 min.
- Gehakt het embryo in stukjes van 1 mm en Pipetteer het weefsel meerdere malen op en neer.
- Voeg 10 mL groeimedium en plaat weefsels toe van één embryo per 10 cm diameter celkweek plaat (passage 0).
- Cultiveer cellen bij 37 °C, 3% O2,5% co2.
Opmerking: alleen MEF-cellen worden onder deze omstandigheden aan niet-gecoate weefsel cultuurplaten gehecht. - Verander het medium elke dag in passage 0 om niet-bijgevoegde weefsel-en celfragmenten te verwijderen.
Let op: afhankelijk van de grootte van het embryo en de kwaliteit van de isolatie, bereiken cellen meestal confluentie na 2 tot 3 dagen. - Trypsinoisatie
- Verwijder het groeimedium voorzichtig en spoel de cellen tweemaal met 10 mL 1x PBS.
- Voeg 2 mL van een 0,025% trypsine/EDTA-oplossing toe aan de cellen in platen met een diameter van 10 cm en inincuberen bij 37 °C gedurende 2-3 min.
- Zorg ervoor dat cellen worden losgekoppeld van het oppervlak door de cellen onder de Microscoop te inspecteren.
- Beëindig trypsine-spijsvertering door dezelfde hoeveelheid groeimedium toe te voegen.
- Breng de cellen naar een conische buis en centrifugeer cellen gedurende 3 minuten bij 200 x g en gooi het supernatant weg.
- Respendeer cellen zorgvuldig in vers groeimedium, Tel cellen en zaai ze in nieuwe platen bij de geprojecteerde celdichtheid.
- Voor niet-senescentie-subteelt gesplitste confluente cellen 1:4 en verleng voor een andere passage bij 3% O2, 37 °c om meer cellen te leveren (passage 1).
Opmerking: op dit punt kunnen de cellen ofwel worden gehandhaafd in cultuur of opgeslagen voor later gebruik in vloeibare stikstof, in cryoflesjes bevattende ongeveer 1.000.000 cellen. Deze stap biedt ook de mogelijkheid om een gemengde partij cellen van verschillende dieren te genereren om de variabiliteit te verminderen die afkomstig is van individuele dier analyses. - Voor het opwekken van celsenescentie, zaad splitsen confluente cellen uit passage 1 in een verhouding van 1:4 en inbroed ze bij 20% O2, 37 °c, 5% Co2 voor 3 dagen; Deze cultuuromstandigheden zijn atmosferisch voor zuurstof.
Opmerking: de teelt van cellen en blastocysten onder omgevings zuurstofconcentraties kan markers van cellulaire senescentie specifiek verheffen wanneer DNA-schade herstel is aangetast34,35,36. - Herhaal deze procedure voor nog 2 passages.
- Om cellulaire senescentie te bewaken, meet u de geleidelijke toename van de celdiameter en het celvolume tijdens elke trypsinisatie stap met behulp van een geavanceerd Coulter-celtellingssysteem.
- Beoordeling van de vermindering van de celproliferatie door bepaling van de populatieverdubbeling (PD) met behulp van de vergelijking
PDT = (t2-t1)/3,32 x (log n2 – log n1)
Opmerking: de verdubbelingstijd van de populatie werd alleen gebruikt voor niet-senescentie cellen. - Gebruik vroege passage wild-type of Ercc1-/- MEF cellen die werden gehouden op 3% O2, 37 ° c, 5% Co2 als niet-senescentie controle cellen.
2. senescentie geassocieerde β-gal screening assay – 2-3 dagen
- Bereid 10 mM stockoplossingen in DMSO van alle geneesmiddelen te testen en op te slaan aliquots bij-80 °C. Niet bevriezen-ontdooien stockoplossingen omdat dit de activiteit van drugs kan verminderen.
Opmerking: hier werd de HSP90 inhibitor 17DMAG gebruikt als een senolytisch medicijn dat specifiek de senescentie cellen17kan doden. - Op de dag van het experiment de aliquot ontdooien, de geneesmiddelen in vers kweekmedium verdunnen en toevoegen aan de cellen met geconditioneerd medium bij een verhouding van 1:1 om de uiteindelijke concentratie in het groeimedium te leveren.
- Gebruik 96-goed voorverdunnings platen voor seriële verdunningen en combinaties van geneesmiddelen.
Opmerking: voor MEF cellen, het was empirisch bepaald dat DMSO concentraties niet meer dan 2% en controle cellen behandeld met de hoogste DMSO concentraties gebruikt moeten worden opgenomen in elke run. - Zaad 5 x 103 senescentie cellen of 3 x 103 niet-senescentie cellen per put in 96 goed platen ten minste 6 uur vóór de behandeling in 100 μL groeimedium en incuberen bij 20% O2, 37 °c, 5% Co2.
Opmerking: cellen moeten ongeveer 80% Confluent Health zijn vóór de behandeling. - Gebruik zwarte muur/Clear bottom weefselcultuur, behandelde 96 goed platen te minimaliseren fluorescerende signaal overspraak en achtergrond.
Opmerking: echter, duidelijke platen zijn ook met succes getest. - Voeg geneesmiddelen verdunningen toe aan de MEF-cellen en incuberen gedurende 24 uur tot 48 uur onder 20% O2, 37 °c, 5% Co2 -condities.
- Houd niet-senescentie cellen onder 3% O2, 37 °c, 5% Co2 voorwaarden.
- Voor lysosomale alkalisatie, bereid een 10 mM bafilomycine a1 oplossing, aliquot en bewaren bevroren bij-20 °C.
- Voor de fluorescentie analyse van de SA-β-gal activiteit, bereid een 2 mM C12FDG stamoplossing, bewaren bij-20 °c, en beschermen tegen licht.
- Voor de werkoplossing, bereid 100 μM C12FDG in groeimedium op de dag van het experiment.
Opmerking: alle (incubatie) stappen met betrekking tot C12FDG moeten in het donker worden uitgevoerd. - Verwijder de geneesmiddel oplossing en spoel de cellen 1 keer met 100 μL van 1x PBS.
- Induceren lysosomale alkalisch door het voorbehandelen van cellen met 90 μL van een 100 nM bafilomycine a1 oplossing bereid in verse celkweekmedium gedurende 1 uur bij 20% O2, 37 °c, 5% Co2.
- Voeg 10 μL 100 μM C12FDG-werkoplossing toe aan het kweekmedium (eindconcentratie 10 μM).
- Incuberen cellen gedurende 2 uur.
- Voeg 2 μL van een 100 μg/mL Hoechst 33342 (eindconcentratie 2 μg/mL) toe aan de kweek en inincubatie gedurende 20 min.
- Verwijder de media en voeg 100 μL vers groeimedium toe.
3. kwantitatieve High-content fluorescerende beeldanalyse
- Gebruik een high content fluorescerende beeld acquisitie-en analyseplatform om fluorescerende beelden van de cellen in de twee kanalen te verkrijgen die geschikt zijn voor het vangen van Hoechst en C12FDG fluorescentie (bijvoorbeeld DAPI-en FITC-kanaal voorinstellingen).
Opmerking: acquisitie protocollen vereisen de definitie van verschillende variabelen die specifiek zijn voor de assay. Het doel van een acquisitie protocol is het vastleggen van een toereikend aantal in-focus fluorescerende afbeeldingen van voldoende aantallen cellen voor downstreamkwantitatieve analyse. - Een geschikt analyse protocol ontwikkelen door elk kanaal te selecteren en door een of meer selectieve criteria aan te passen, wat wordt aangemerkt als een functie van belang in elk kanaal.
- Voor de Nucleus, gebruik zo segmentatie pre-sets (bijv. nucleaire segmentatie, blaasje segmentatie, cytoplasma segmentatie) dat zal de identificatie van cellulaire organellen op basis van meerdere criteria, met inbegrip van morfologie, grootte, en signaal Intensiteit. Pas deze criteria aan om kernen op te nemen, met uitzondering van kern fragmenten en puin die een signaal kunnen hebben, maar die bijvoorbeeld te groot of te klein zijn om kernen te zijn.
- Controleer het signaal in het FITC-kanaal dat fluorescentie is van gesplitst C12FDG en vertegenwoordigt de hoeveelheid senescentie-geassocieerde β-galactosidase-activiteit in de cellen.
Opmerking: de senescentie cellen hebben een hogere, met senescence geassocieerde, β-galactosidase-activiteit dan niet-zenucerende cellen; C12FDG fluorescentie zal echter niet-discrete en ononderbroken zijn, waardoor een drempel moet worden vastgesteld tussen wat wordt beschouwd als een c12FDG-positief en een c12FDG-negatieve cel. - Met behulp van commercieel verkrijgbare analytische software, het genereren van een aantal exemplaren waarin een gedefinieerd gebied rond de Nucleus (een veronderstelde cel) heeft overlappende ten minste één keer met een bovendrempel C12FDG.
Opmerking: de analytische software genereert automatisch een telling met behulp van target Linking. Dit is de praktische definitie van de bepaling van een senescentie-, C12-FDG-positieve cel.
- Analyseer alle monsters in drievlaat met 3-5 velden per put en gemiddelde waarden en standaarddeviaties die dienovereenkomstig worden berekend.
- Bereken het percentage van de senescentie cellen met de volgende formule:
Senescentie cellen (%)
= x 100
= x 1004. validatieparameters voor assay
- Voor alle monsters werden de intra-en inter-assay coëfficiënt van variaties (% CVs) berekend aan de hand van de volgende formule:
Intra-assay CV (n = 10 herhalingen gemeten in één experiment) =
x 100 (%)
Inter-assay CV (n = 5 onafhankelijke experimenten) = x 100 (%) - Voor screeningdoeleinden, bepaal de Z ' waarde, een statistische parameter om de kwaliteit van een test te evalueren, uit cellen behandeld met 200 nM rapamycine gedurende 24 uur bij 20% O2, 37 °c, 5% Co2 (een positieve controle op senotherapeutische geneesmiddelen) en onbehandeld senescentie cellen (negatieve controle).
NB: de Z ' waarde werd berekend volgens Zhang et al.37. Z ' waarden tussen 0,5 en 1 geven aan dat een test kan worden gebruikt voor de screening van geneesmiddelen.
x 100 (%)Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
SA-β-gal activiteit kan worden gedetecteerd in cellen die worden geïnduceerd aan senesce door verschillende manieren van replicatieve uitputting, genotoxische en oxidatieve stress, naar oncogen activering23,25,38. In het huidige model met behulp van Ercc1-deficiënte muis embryonale fibroblast cellen, normoxic groei voorwaarden (20% O2) waren voldoende om te induceren cel senescentie na het cultiveren van hen voor een paar passages. Wild type Mef's ondergaan ook senescentie, maar vereisen extra passages bij 20% O2. Figuur 1 toont de workflow van de screeningtest beginnend met de isolatie van primaire MEF-cellen van Ercc1-deficiënte muizen embryo's, tot de inductie van celsenescentie door oxidatieve stress, en ten slotte tot de analyse van microscopische gegevens verkregen met een hoog gehalte fluorescerende Microscoop. Figuur 2 toont representatieve beelden van MEF-celculturen die niet-senescerende (jonge) cellen bevatten (Figuur 2, links), ongeveer 50% senescentie cellen in passage 5 (Figuur 2, midden) en senescentie cellen behandeld met een senolytisch geneesmiddel ( Afbeelding 2, rechts). Afbeelding 3a toont representatieve beelden voor automatische, door software gegenereerde kwantitatieve analyses van senescentie cellen. Figuur 3b toont de eliminatie van de achtergrond β-galactosidase activiteit door bafilomycine-A. Figuur 4 toont mogelijke uitkomsten van senescentie celculturen die met geneesmiddelen worden behandeld, waaronder senacentie-celmoord (senolytic) en senescentie modulerende (senomorfe) geneesmiddelen zoals beschreven in Fuhrmann-stroissnigget al. 17.
Figuur 1. Schematisch overzicht van screeningstest en tijdlijn. MEF cellen zijn geïsoleerd van zwangere muizen en zet op celcultuur behandeld plastic platen voor een paar dagen uit te breiden. Vroege passage cellen kunnen worden bevroren in vloeibare stikstof en kunnen worden gebruikt voor screening op een later tijdstip. Celsenescentie wordt geïnduceerd door een oxidatieve stress door passage bij 20% O2 en cellen worden blootgesteld aan geneesmiddelen zodra ze een robuuste sencentie toestand hebben bereikt. Gegevensanalyse met inbegrip van de totale hoeveelheid en resterende senescentie cellen wordt uitgevoerd. De tijdlijn, in dagen, geeft de duur van één experiment aan. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 2. Representatieve beelden van niet-senescentie-, senescentie-en senescentie cellen die zijn behandeld met 100 nM van het senolytische geneesmiddel 17DMAG. Blauwe fluorescentie geeft DNA-kleuring aan met Hoechst 33324 terwijl groene fluorescentie wijst op SA-β-gal kleuring met C12FDG. Heldere groene kleuring staat voor SA-β-gal positieve senescentie cellen, terwijl Dim kleuring SA-β-gal lage of negatieve, niet-senescentie cellen vertegenwoordigt. Houd er rekening mee dat senescentie cellen meestal een grotere celgrootte hebben en worden afgevlakt. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 3. Representatieve beelden van een senescentie-MEF-celcultuur die is geanalyseerd met commerciële software. A) de cellen van de sa-β-gal-positieve cellen (SA-β-gal+) worden beschreven in groene (groene pijlen), sa-β-gal-negatief (SA-β-gal-) worden in rood (rode pijlen) geschetst. Linker-en rechter panelen tonen respectievelijk nucleaire (Hoechst) en C12FDG (FITC) signaal. Alleen gebieden die positief zijn voor Hoechst (een nuclei bevatten) worden als cellen beschouwd. B) een vergelijking van Bafilomycine-een behandelde en onbehandelde cellen. Residuele®-galactosidase activiteit aanwezig in alle cellen wordt verminderd door lysosomale verzuring Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 4. Schema van mogelijke uitkomsten van medicamenteuze behandeling. Geneesmiddelen kunnen verschillende effecten hebben op senescentie-en niet-senescentie cellen, met inbegrip van doden senescentie cellen (senolytica) of onderdrukken van de SA-β-gal senescentie fenotype (senomorphics). Samen worden deze twee klassen senotherapeutics genoemd. Dit cijfer is gewijzigd van Fuhrmann-Stroissnigget al. 17. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
SA-β-Gal is een goed gedefinieerde biomarker voor cellulaire senescentie die oorspronkelijk werd ontdekt door Dimri et al. (1995) waaruit blijkt dat senescentie menselijke fibroblasten de activiteit van SA-β-gal hebben verhoogd bij een aanval op pH 623 in vergelijking met prolifererende cellen. Ondertussen zijn in vitro en in vivo analyse voor sa-β-gal vastgesteld voor verschillende celtypen en weefsels25,39,40. De op fluorescentie gebaseerde eencellige methode voor het meten van SA-β-gal in levende cellen zoals beschreven in dit protocol is een uitstekende primaire screening tool voor drugs die de celsenescentie17beïnvloeden. Hoewel sa-β-gal echter wordt beschouwd als een van de meest geschikte markers voor senescentie-celdetectie, extra markers voor cellulaire senescentie zoals de detectie van celcyclus regelaars P16Ink4A en P2141, senescentie geassocieerd secretoire fenotype (sasp) eiwitten zoals Il-6, tnfα, HMGB1and NF-κb42, DNA schade reparatie markers zoals υh2ax en telomeer geassocieerde DNA schade Foci (TAFs)43,44, senescentie geassocieerde chromatine Foci ( SAHF) 45of basale morfologische markers zoals Celgrootte en granulariteit moeten worden uitgevoerd als bevestigende testen om te zorgen voor het senotherapeutische potentieel van drugs40. Aangezien de overgang van een normale cel naar een senescentie cel een traag proces is, is de kritieke stap in deze methode het vinden van de drempel die onderscheid maakt tussen C12FDG positief (senescentie) en negatieve (normale) cellen. Dit moet voor elk celtype empirisch worden bepaald en C12FDG positieve en negatieve controles moeten in elk experiment worden opgenomen.
Naast oxidatieve beklemtoonde Ercc1-/- mefs, kan deze methode worden aangepast voor andere aanhandige celtypen. Oxidatieve-beklemtoonde Ercc1-deficiënte mesenchymale stamcellen (MSCS) en Etoposide-behandelde humane IMR90 cellen werden al met succes getest in de assay en kunnen worden gebruikt voor het scherm voor drugs17. Echter, tijden voor het opwekken van senescentie evenals medicamenteuze behandelingstijden en concentraties kunnen variëren.
De belangrijkste beperking van deze techniek is dat de sa-β-gal activiteit heeft aangetoond te stijgen onder bepaalde senescentie-onafhankelijke omstandigheden zoals celcontact remming of hoge cellulaire samenvloeiing46,47. Gebieden met "celheaps" en celculturen met meer dan confluente cellen kunnen gemakkelijk worden bepaald en moeten worden uitgesloten van de analyses. Bovendien, achtergrondkleuring van groene auto fluorescerende lipofuscin blaasjes verhoogd in senescentie cellen kan optreden. In senescentie-MEF-celculturen zijn ze verwaarloosbaar vanwege de helderheid van C12FDG, maar moeten voor elk celtype46worden onderzocht. Hoechst kleuring van DNA leidt meestal niet tot achtergrondkleuring. Sommige fenol ring met drugs, echter, kan worden fluorescerende in UV-licht. Verhoging van de uitsluitings grootte van het UV-positieve fluorescentie signaal tot de grootte van werkelijke celkernen kan helpen om ongewenste detectie van deze geneesmiddelen te voorkomen.
Het belangrijkste kenmerk van de beschreven assay is het feit dat zowel senescentie als niet-senescentie cellen in dezelfde omgeving worden aangetroffen, waardoor de geneesmiddel effecten op senescentie-en niet-senescentie cellen gelijktijdig kunnen worden vastgesteld. De detectie van het totale aantal cellen door het tellen van celkernen geeft een eerste indicatie over het celslachting potentieel van een medicijn. Een afname van de celaantallen en de senescentie van cellen duidt meestal op senolytische geneesmiddelen, terwijl een constant celgetal met een verlaagd aantal sencerende cellen meestal senomorfe geneesmiddelen aangeeft. Vanwege de korte incubatietijd van het geneesmiddel kunnen effecten zoals gelijktijdige proliferatie van niet-senescentie cellen en celdood van senescentie cellen die leiden tot een constant celgetal (bijv. senolytisch effect met senomorfe resultaat) niet worden uitgesloten, maar worden ze als zeer Onwaarschijnlijk.
Toekomstige toepassingen van deze techniek omvatten de mogelijkheid om extra levende celmarkeringen te integreren (bijv. apoptosis marker zoals annexinv en 7aad40) of markers voor verschillende intracellulaire compartimenten zoals mitochondriën of lysosomen in de testsysteem. Gelijktijdige monitoring van SA-β-gal en andere cellulaire markers tijdens medicamenteuze behandeling kan helpen om het onderliggende cellulaire mechanisme te verhelderen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben niets te onthullen.
Acknowledgments
Dit werk werd ondersteund door NIH grants AG043376 (project 2 en Core A, PDR; Project 1 en Core B, LJN) en AG056278 (project 3 en Core A, PDR; en project 2, LJN) en een subsidie van de Glenn Foundation (LJN).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DMEM | Corning | 10-013-CV | medium |
| Ham's F10 | Gibco | 12390-035 | medium |
| fetal bovine serum | Tissue Culture Biologics | 101 | serum |
| 1x non-essential amino acids | Corning | 25-025-Cl | amino-acids |
| bafilomycin A1 | Sigma | B1793 | lysosomal inhibitor |
| C12FDG | Setareh Biotech | 7188 | b-Gal substrate |
| Hoechst 33342 | Life Technologies | H1399 | DNA intercalation agent |
| 17DMAG | Selleck Chemical LLC | 50843 | HSP90 inhibitor |
| InCell6000 Cell Imaging System | GE Healthcare | High Content Imaging System |
References
- Hayflick, L., Moorhead, P. S. The serial cultivation of human diploid cell strains. Experimental Cell Research. 25, 585-621 (1961).
- Campisi, J., di Fagagna, F. D. Cellular senescence: when bad things happen to good cells. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 8 (9), 729-740 (2007).
- Harley, C. B., Futcher, A. B., Greider, C. W. Telomeres shorten during ageing of human fibroblasts. Nature. 345 (6274), 458-460 (1990).
- Zhu, J., Woods, D., McMahon, M., Bishop, J. M. Senescence of human fibroblasts induced by oncogenic Raf. Genes and Development. 12 (19), 2997-3007 (1998).
- Dimri, G. P., Itahana, K., Acosta, M., Campisi, J. Regulation of a senescence checkpoint response by the E2F1 transcription factor and p14(ARF) tumor suppressor. Molecular and Cellular Biology. 20 (1), 273-285 (2000).
- Michaloglou, C., et al. BRAFE600-associated senescence-like cell cycle arrest of human naevi. Nature. 436 (7051), 720-724 (2005).
- Niedernhofer, L. J. Tissue-specific accelerated aging in nucleotide excision repair deficiency. Mechanisms of Ageing and Development. 129 (78), 408-415 (2008).
- Gitenay, D., et al. Glucose metabolism and hexosamine pathway regulate oncogene-induced senescence. Cell Death & Disease. 5, e1089 (2014).
- Erusalimsky, J. D., Kurz, D. J. Cellular senescence in vivo: its relevance in ageing and cardiovascular disease. Experimental Gerontology. 40 (8-9), 634-642 (2005).
- Kassem, M., Marie, P. J. Senescence-associated intrinsic mechanisms of osteoblast dysfunctions. Aging Cell. 10 (2), 191-197 (2011).
- Campisi, J., Andersen, J. K., Kapahi, P., Melov, S. Cellular senescence: A link between cancer and age-related degenerative disease. Seminars in Cancer Biology. 21 (6), 354-359 (2011).
- Golde, T. E., Miller, V. M. Proteinopathy-induced neuronal senescence: a hypothesis for brain failure in Alzheimer's and other neurodegenerative diseases. Alzheimers Research & Therapy. 1 (2), 5 (2009).
- Telgenhoff, D., Shroot, B. Cellular senescence mechanisms in chronic wound healing. Cell Death & Differentiation. 12 (7), 695-698 (2005).
- Baker, D. J., et al. Clearance of p16Ink4a-positive senescent cells delays ageing-associated disorders. Nature. 479 (7372), 232-236 (2011).
- Baker, D. J., et al. Naturally occurring p16-positive cells shorten healthy lifespan. Nature. , (2016).
- Childs, B. G., et al. Senescent intimal foam cells are deleterious at all stages of atherosclerosis. Science. 354 (6311), 472-477 (2016).
- Fuhrmann-Stroissnigg, H., et al. Identification of HSP90 inhibitors as a novel class of senolytics. Nature Communications. 8 (1), 422 (2017).
- Zhu, Y., et al. New agents that target senescent cells: the flavone, fisetin, and the BCL-XL inhibitors, A1331852 and A1155463. Aging. 9 (3), Albany NY. 955-963 (2017).
- Zhu, Y., et al. Identification of a Novel Senolytic Agent, Navitoclax, Targeting the Bcl-2 Family of Anti-Apoptotic Factors. Aging Cell. , (2015).
- Zhu, Y., et al. The Achilles' heel of senescent cells: from transcriptome to senolytic drugs. Aging Cell. , (2015).
- Baar, M. P., et al. Targeted Apoptosis of Senescent Cells Restores Tissue Homeostasis in Response to Chemotoxicity and Aging. Cell. 169 (1), 132-147 (2017).
- Jeon, O. H., et al. Local clearance of senescent cells attenuates the development of post-traumatic osteoarthritis and creates a pro-regenerative environment. Nature. , (2017).
- Dimri, G. P., et al. A biomarker that identifies senescent human cells in culture and in aging skin in vivo. Proceedings of the National Academy of Sciences USA. 92 (20), 9363-9367 (1995).
- Itahana, K., Campisi, J., Dimri, G. P. Methods to detect biomarkers of cellular senescence: the senescence-associated beta-galactosidase assay. Methods in Molecular Biology. 371, 21-31 (2007).
- Debacq-Chainiaux, F., Erusalimsky, J. D., Campisi, J., Toussaint, O. Protocols to detect senescence-associated beta-galactosidase (SA-[beta]gal) activity, a biomarker of senescent cells in culture and in vivo. Nature Protocols. 4 (12), 1798-1806 (2009).
- Cahu, J., Sola, B. A sensitive method to quantify senescent cancer cells. Journal of Visualized Experiments. 78 (78), (2013).
- Collado, M., et al. Tumour biology: Senescence in premalignant tumours. Nature. 436 (7051), 642 (2005).
- Krishnamurthy, J., et al. Ink4a/Arf expression is a biomarker of aging. The Journal of Clinical Investigation. 114 (9), 1299-1307 (2004).
- Mishima, K., et al. Senescence-associated beta-galactosidase histochemistry for the primate eye. Investigative Ophthalmology, Visual Science. 40 (7), 1590-1593 (1999).
- Melk, A., et al. Expression of p16INK4a and other cell cycle regulator and senescence associated genes in aging human kidney. Kidney International. 65 (2), 510-520 (2004).
- Niedernhofer, L. J., et al. A new progeroid syndrome reveals that genotoxic stress suppresses the somatotroph axis. Nature. 444 (7122), 1038-1043 (2006).
- Wang, J., Clauson, C. L., Robbins, P. D., Niedernhofer, L. J., Wang, Y. The oxidative DNA lesions 8,5′-cyclopurines accumulate with aging in a tissue-specific manner. Aging Cell. 11 (4), 714-716 (2012).
- Jozefczuk, J., Drews, K., Adjaye, J. Preparation of mouse embryonic fibroblast cells suitable for culturing human embryonic and induced pluripotent stem cells. Journal of Visualized Experiments. (64), (2012).
- Jagannathan, L., Cuddapah, S., Costa, M. Oxidative stress under ambient and physiological oxygen tension in tissue culture. Current Pharmacology Reports. 2 (2), 64-72 (2016).
- Meuter, A., et al. Markers of cellular senescence are elevated in murine blastocysts cultured in vitro: molecular consequences of culture in atmospheric oxygen. J Assist Reprod Genet. 31 (10), 1259-1267 (2014).
- Robinson, A. R., et al. Spontaneous DNA damage to the nuclear genome promotes senescence, redox imbalance and aging. Redox Biology. 17, 259-273 (2018).
- Zhang, J. H., Chung, T. D., Oldenburg, K. R. A Simple Statistical Parameter for Use in Evaluation and Validation of High Throughput Screening Assays. Journal Of Biomolecular Screening. 4 (2), 67-73 (1999).
- Zhao, H., Darzynkiewicz, Z. Biomarkers of cell senescence assessed by imaging cytometry. Methods in Molecular Biology. 965, 83-92 (2013).
- Yang, N. -C., Hu, M. -L. A fluorimetric method using fluorescein di-β-d-galactopyranoside for quantifying the senescence-associated β-galactosidase activity in human foreskin fibroblast Hs68 cells. Analytical Biochemistry. 325 (2), 337-343 (2004).
- Zhao, J., et al. Quantitative Analysis of Cellular Senescence in Culture and In Vivo. Current Protocols in Cytometry. 79, (2017).
- Capparelli, C., et al. CDK inhibitors (p16/p19/p21) induce senescence and autophagy in cancer-associated fibroblasts, "fueling" tumor growth via paracrine interactions, without an increase in neo-angiogenesis. Cell Cycle. 11 (19), 3599-3610 (2012).
- Coppe, J. P., Desprez, P. Y., Krtolica, A., Campisi, J. The senescence-associated secretory phenotype: the dark side of tumor suppression. Annual Review of Pathology. 5, 99-118 (2010).
- Mah, L. J., El-Osta, A., Karagiannis, T. C. GammaH2AX as a molecular marker of aging and disease. Epigenetics. 5 (2), 129-136 (2010).
- Hewitt, G., et al. Telomeres are favoured targets of a persistent DNA damage response in ageing and stress-induced senescence. Nature Communications. 3, 708 (2012).
- Narita, M., et al. Rb-mediated heterochromatin formation and silencing of E2F target genes during cellular senescence. Cell. 113 (6), 703-716 (2003).
- Georgakopoulou, E. A., et al. Specific lipofuscin staining as a novel biomarker to detect replicative and stress-induced senescence. A method applicable in cryo-preserved and archival tissues. Aging-Us. 5 (1), 37-50 (2013).
- Severino, J., Allen, R. G., Balin, S., Balin, A., Cristofalo, V. J. Is β-Galactosidase Staining a Marker of Senescence in Vitro and in Vivo? Experimental Cell Research. 257 (1), 162-171 (2000).
